神经祖细胞的中体和初级纤毛释放富含干细胞标记物prominin-1的细胞外膜颗粒

作为prom1粒子候选供体膜的中体

为了确定prom1颗粒的起源位置，我们探索了这些颗粒可能来源于微管型质膜突起的可能性。其基本原理是已知prom1集中在质膜突起中(Weigmann等人，1997年;Corbeil等人，2001年)但神经管液中大多数prom1颗粒缺乏肌动蛋白(Marzesco等人，2005年). 事实上，在胚胎第11.5天对小鼠神经管液进行差速离心，然后进行免疫印迹，P2颗粒，其中大多数大的prom1颗粒已知可以被回收(Marzesco等人，2005年)显示α-微管蛋白显著富集(图2 A). 与此相一致，端脑室管腔中prom1颗粒的双重免疫荧光显示，其中很大一部分（57±11%）含有α-微管蛋白，似乎集中在环状prom1染色的中心(图2 B). P2颗粒的双重免疫金EM证实了这一结论(图2 E)并揭示，对于E10.5端脑，α-微管蛋白位于电子致密结构内，表面显示prom1标记，并且似乎从神经上皮顶端表面分离（或至少出现）(图2、C和D).

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图2。

Prom1颗粒含有α-微管蛋白。（A） 对E11.5小鼠胚胎神经管液进行差速离心(Marzesco等人，2005年)然后对α-微管蛋白的组分进行免疫印迹分析。第1300页-克颗粒；第1200页-克颗粒；10000 P3-克颗粒；P4100000-克颗粒；4100000英镑-克上清液。（B） E10.5小鼠端脑横断冰冻切片，prom1（红色）和α-微管蛋白（绿色）双重免疫染色，共聚焦显微镜分析；显示了端脑室腔内prom1颗粒的四个例子（z-stack投影）。（C和D）小鼠E10.5端脑NE细胞免疫金标记prom1（5 nm）和α-微管蛋白（12 nm）的顶端区域的横向超薄冰冻切片，显示腔内表面有两个双重免疫反应颗粒。（E） 免疫金标记prom1（5 nm）和乙酰化微管蛋白（12 nm）后，P2颗粒中的颗粒呈阴性染色。棒材：（B）1μm；（C–E）100纳米。

根据这些观察结果，我们认为NE细胞的两个顶端膜结构是管腔prom1颗粒的假定供体膜，这两个顶端膜结构已知与微管簇、纤毛有关(Pazour和Witman，2003年;2005年普雷托利乌斯和春天)中体是连接新生子细胞直至胞质分裂完成的细胞质桥(Glotzer，2001年;Otegui等人，2005年). 对小鼠E10.5端脑分裂NE细胞顶端中体的连续塑料切片进行EM，得出三个主要结果。首先，我们观察到不同大小的膜芽从中体中出现，以及其附近的囊泡轮廓(图3、A、D和E，箭头；和图S4、A和B，可从http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200608137/DC1)与中体产生的细胞外膜小泡相一致。

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图3。

管腔颗粒的超微结构与NE细胞的老化中体相似。E10.5小鼠端脑神经上皮顶端表面连续超薄（70 nm）塑料切片的EM分析。（A） 终末期连接NE子细胞的中体。（B–D）显示老年人中身其他部分的序列。（E） NE细胞的中体，中心粒（箭头）位于顶端。（F–H）系列显示每三分之一段从神经上皮顶端表面脱落的电子致密颗粒。箭头表示质膜芽和突起，星号表示粘附连接。从中选择A、E和F–H的完整序列分别如图S4（A–C）所示（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200608137/DC1). 条形，500 nm。

第二，尽管某些中体显示出典型的微管有序排列，并且可以在单个切片中进行鉴定(图3 A)，其他显示出与之前观察到的多形突起相同的形态外观(Marzesco等人，2005年)只有在连续切片时才能识别为中体(图3，B–E; 以及图S4 B）。对于后一种中体，微管的有序排列不太明显(图3、C和E)核心区细胞质的结构更不均匀，显示出更多的电子密集区（通常在皮层区域）以及更少的致密斑块(图3、C和E). 此外，这些中体通常在NE子细胞上观察到，根据形态学标准，这些子细胞似乎已经进入G1，例如（1）纤毛的存在，纤毛在M期被分解(Hinds和Ruffett，1971年;Cohen等人，1988年;Pazour和Witman，2003年;Quarmby和Parker，2005年)然后改造（图S4 B），（2）拉长细胞形状(图1，E和P; （3）细胞核的心室位置(图1、E和P; 图S4 A；Hinds和Ruffett，1971年). 鉴于这种时间关系，我们将这些称为“老化”中体。

第三，我们观察到复形膜结构，如连续切片所示，这些复形膜明显地从NE细胞的顶端表面脱落，但其形态与衰老中体核心的形态相似(图3，F–H). 由于这些分离的膜结构使人想起神经管管腔中P2颗粒的外观(图2、C和D; 图S2，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200608137/DC1;Marzesco等人，2005年)，我们的观察结果共同表明，后一种粒子可能起源于中体。

Prom1集中在NE细胞的中体

如果P2粒子起源于中体，人们预计prom1会集中在那里。免疫金标记EM显示情况确实如此。具体地说，prom1聚集在中体电子密集中心部分的表面(图4、A和F). 值得注意的是，prom1标记在中央中体质膜的芽上特别强烈(图4、C、D和G，箭头）。

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图4。

Prom1集中于NE细胞的中体。对小鼠胚胎前脑进行prom1（10nm金）预埋免疫金标记，然后对超薄连续塑料切片进行EM分析。图中显示了NE细胞在E8.5（A–E）、E10.5（H–J）和E12.5（F和G）的顶端中体。（B和C）B中所示的具有细长茎的中体的中心部分在C中连续截面的高倍放大下显示。（D和E）连续截面显示另一个具有细长柄的中体中心部分。（G–I）具有短柄的中心体。（J） 神经上皮细胞顶端表面的颗粒。黑色箭头表示prom1标记的质膜芽和突起，灰色箭头表示分离的颗粒，实心箭头表示中体质膜朝向内腔侧，开放箭头表示中身质膜源自卵裂沟。棒材：（A和C–J）100 nm；（B） 1微米。

不同胚胎阶段的比较表明，在这两个阶段之前都观察到了电子密集中心区域通过相对较短的茎与子细胞相连的中体（E8.5；图4 A)（E12；图4、F、G和I)端脑开始神经发生，而中脑有长而细的柄(图4 B)仅在早期阶段检测到（E8.5）。不同中体的Prom1免疫标记产生了三个值得注意的观察结果。首先，在具有有序微管阵列的短中体的情况下，prom1主要在面向内腔的质膜域上检测到(图4、A和F，实心箭头），而不是在源自解理沟的膜结构域上（开放箭头）。这与前中体质膜结构域一致，该结构域对应于母细胞的前体1细胞膜、顶端膜。其次，对于具有短柄或长柄的老年中体，prom1似乎围绕着中央核心(图4，C–E)表明中体衰老伴随着膜微结构域的重新分布。第三，对于长而薄的中体，prom1局限于最中央的部分(图4、B和E)表明这代表了一个独特的膜亚结构域。

此外，神经上皮顶端表面的免疫金标记显示，小膜芽（直径30–60nm）不仅在中体中部有成簇的prom1(图4，C–E和H)但也存在于与NE细胞顶面分离但在其附近的相对较大（直径为1-μm）的结构上(图4、G和J，灰色箭头）。这表明神经管液中的小（50–80 nm）P4 prom1颗粒(Marzesco等人，2005年)可能不仅来源于NE细胞的顶膜突起，如微绒毛(Marzesco等人，2005年; 纤毛，请参见图7)也来自神经管管腔中较大的P2 prom1颗粒，而这些颗粒又来自NE细胞的中体。

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图7。

Prom1集中在NE细胞的纤毛上。对小鼠前脑进行prom1（10nm金）预埋免疫金标记，然后对超薄塑料切片进行EM分析。（A） E8.5处的纤毛显示弱标记（箭头）。（B–F）E10.5（B和C）、E12.5（D和F）或E13.5（E）处的Cilia显示不同程度的表面标记；注意D和E中纤毛尖端的prom1簇（箭头）。（G和H）E12.5处的短纤毛，其附近有强prom1标记的电子致密颗粒。（一） prom1标记的E10.5端脑室表面扫描电镜；金颗粒（18nm）呈白点状。显示有金色标记的纤毛（箭头）、杯状结构（开放箭头）和强烈免疫反应的突起（实心箭头）。棒材：（A–H）100 nm；（一） 1微米。

Prom1颗粒含有苯胺，苯胺是中体的一种成分

中体的一个特征成分是苯胺，一种与收缩环相关的肌动蛋白结合蛋白(菲尔德和阿尔伯茨，1995年;Oegema等人，2000年). 如果神经管液中发现的prom1颗粒来自中体，人们可能会认为它们含有苯胺。事实上，E10.5端脑NE细胞的双重免疫金标记显示，不仅顶端中体含有苯胺（除了prom1；图5 A)也包括从顶端表面脱落的prom1颗粒(图5 B)可以从神经管液中分离出来(图5 C，箭头）。通过双重免疫荧光，E10.5端脑室管腔中的大部分（39±8%）prom1颗粒含有苯胺(图5 F). 此外，E11.5端脑神经上皮顶端表面的绝大多数苯胺阳性结构也含有prom1(图5D，箭头），尽管在每个结构中，两个标记相对彼此的分布是不同的(图5 E). 这些发现证实了我们的结论，即神经管液中的prom1颗粒来自NE细胞的中体。

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图5。

苯胺不仅存在于含prom1的中体中，也存在于含prom1的管腔颗粒中。（A和B）E10.5小鼠端脑神经上皮顶部表面的横向超薄冰冻切片，双免疫金标记prom1（5 nm）和苯胺（10 nm；白色箭头）。双重免疫反应中体（A）和神经上皮顶面颗粒（B）。黑色箭头表示中体管腔质膜上的prom1标记区域。（C） E11.5神经管液P2颗粒中微粒的prom1（5 nm）和苯胺（10 nm；白色箭头）的双重免疫金标记。（D–F）E11.5（D和E）和E10.5（F）小鼠端脑横截面冷冻切片，对prom1（红色）和anillin（绿色）进行双重免疫染色，并用共焦显微镜进行分析。（D和E）Z轴投影提供神经上皮顶部表面的正面视图；对于定向，D（E）中的一个光学切片显示了细胞核的DAPI染色（蓝色）。D的选定区域（用箭头表示）放大倍率较高。（F） 端脑室管腔中含prom1颗粒的四例（z叠加投影）。棒材：（A–C）100 nm；（D） 10微米；（F） 1微米。

鉴于这些固定样本的观察结果，我们在鸡脊髓中表达GFP-苯胺后，对切片培养的活分裂NE细胞进行了延时共聚焦成像（图S1和视频3，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200608137/DC1). 这表明，当核膜破裂时，GFP-苯胺从核质释放到细胞质中后，聚集在细胞体的基底极，与收缩环相关，并在胞质分裂结束时集中在分裂细胞顶部表面形成的颗粒中。这些含有GFP-苯胺的顶端颗粒最终从子细胞中消失，与释放到神经管腔中的颗粒一致。

顶端中体和NE细胞对称与不对称分裂

先前有报道称，根据NE细胞是经历对称分裂还是不对称分裂，从基底侧进入的卵裂沟将平分或绕过顶膜，导致其分别被两个或仅一个子细胞遗传(Kosodo等人，2004年). 由此推论，在对称分裂中，中体包含顶端膜，而在不对称分裂中，则不包含。根据目前的研究结果，我们扩展了之前与此问题相关的观察结果(Kosodo等人，2004年)并系统地测定了中体相对于末期NE细胞顶端含有prom1的膜的定位。该分析是在这21-GFP敲除小鼠胚胎，其中GFP在经历神经原性（而非增殖性）分裂的NE细胞中特异表达(Haubensak等人，2004年); 神经原的(这21-心室表面GFP阳性的分裂主要（但不限于）不对称，而增殖性(Tis21型-GFP–负）分割几乎总是对称的(Kosodo等人，2004年).

我们的第一种方法是对末期E11.5前脑NE细胞中苯胺与prom1定位的双重免疫荧光分析。图6（A–E）显示了一个经常观察到的苯胺标记的中体与prom1共定位的例子，这与图4和​和5；5; 相应的NE单元缺少这21-GFP表达(图6 A)因此，很可能经历了增殖分裂。图6（F–J）相反，显示了一个例子，苯胺标记的中体位于心室表面正下方且缺乏prom1的病例较少；这里，对应的NE细胞显示这21-GFP表达(图6 F)也就是说，进行了神经源性分裂。这些关于苯胺与prom1定位的数据通过3D重建得到了证实(图6，E′和J′).

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图6。

苯胺相对于prom1和钙粘蛋白的定位这21-GFP阴性与阳性有丝分裂NE细胞。（A–T）这21-GFP敲除小鼠（GFP表达；白色）对苯胺（绿色）和prom1（A–J；红色）或钙粘蛋白（K–T；红色）进行双重免疫染色，并通过共焦显微镜（C–E、H–J、M–O和R–T，单个光学切片；A、B、F、G、K、L、P和Q，四个连续光学切片的投影）进行分析。细胞核用DAPI染色（蓝色）。白色星号表示子细胞的末期细胞核。M、O、R和T中的白色小条表示钙粘蛋白孔。（A–E和K–O）末期NE细胞缺乏这21-GFP表达并经历对称分裂（苯胺与prom1和钙粘蛋白孔共定位于90-100%完全进入卵裂沟后）。（F–J和P–T）Telophase NE细胞显示强（F）或弱（P）这21-GFP表达并经历不对称分裂（苯胺与prom1不同，在90-100%完全进入卵裂沟后与钙粘蛋白共定位）。（E′，J′，O′，和T′）从6到8个1μm光学截面的三维重建显示了对称分割的prom1–anillin–DAPI合并Tis21型-E（E′）中GFP阴性细胞，不对称分裂这21-J（J′）中GFP阳性细胞，钙粘蛋白-苯胺-DAPI合并对称分裂这21-GFP–O（O′）中的阴性细胞，以及不对称分裂这21-T（T′）GFP阳性细胞。O′和T′中的白色和黑色箭头分别表示钙粘蛋白孔。（U） 对称和不对称分裂NE细胞中苯胺染色的顶端中体的定量。E9.5、E11.5和E14.5的前脑NE细胞这21-GFP敲除小鼠进行钙粘蛋白和苯胺的双重免疫染色，并通过共焦显微镜进行分析，如K-T。显示分裂沟完全进入90-100%的末期NE细胞（分析的54个细胞中有25个）首先对顶端苯胺染色与细胞表面钙粘蛋白阴性（对称分裂）或钙粘蛋白阳性（不对称分裂）片段的共定位进行评分，然后对是否存在钙粘蛋白这21-GFP表达。对称分裂的NE细胞表示为对称分裂细胞和不对称分裂细胞的百分比；对称分割的百分比这21-GFP–阳性细胞以绿色表示。棒材，5μm。

当我们通过对侧膜蛋白钙粘蛋白的反染鉴定单个有丝分裂NE细胞的顶膜时，进一步支持了这样的观点，即含有富含prom1的顶膜的中体的释放是NE细胞进行对称增殖分裂的特征(Kosodo等人，2004年). 具体来说，我们通过对末期E11.5前脑NE细胞的双重免疫荧光分析来确定苯胺标记的中体是否与钙粘蛋白“洞”共定位(Kosodo等人，2004年)，即顶膜，或与包括钙粘蛋白染色的粘附物连接的侧膜。图6（K–O）和3D重建(图6 O′)显示苯胺标记的中体与钙粘蛋白孔（顶端中体）共定位的示例；加上缺乏这21-GFP表达(图6 K)，这表明相应的NE细胞经历了对称的增殖分裂。相反，图6（P–T）和3D重建(图6 T′)显示了苯胺标记的中间体与钙粘蛋白染色的粘附物连接处（根尖下中间体）共定位的实例；以及（尽管较弱）的存在这21-GFP表达(图6 P)这表明相应的NE细胞经历了不对称的神经原性分裂。

我们在三个发育阶段量化了前脑中相对于末期NE细胞顶膜和侧膜的中体定位(图6 U). 在神经发生开始（E11.5）至中期神经发生（E14.5）后，心室表面约90%的NE细胞分裂是对称的，约10%是不对称的。（与之前的观察结果一致[Kosodo等人，2004年]，其中一些对称划分是这21-GFP阳性[图6 U，绿色]。）相反，在神经发生开始之前（E9.5），基本上所有苯胺标记的中体都定位于钙粘蛋白孔，NE细胞均未表达这21-GFP，与所有NE细胞在此阶段进行对称增殖分裂的观点一致，这些细胞释放的中体包含顶端膜，解释了神经发生前P2 prom1颗粒在神经管液中的积聚(Marzesco等人，2005年).

作为细胞外膜颗粒来源的中体

NE细胞顶端中体的命运显然比整个释放更为复杂。我们观察到不同大小的膜芽从细胞附着的中体和从细胞分离的中体残余物中出现(图3和​和4）。4). 舞会一集中在这些花蕾上(图4). 这些芽产生的较大的膜泡可能与那些缺乏微管蛋白和苯胺的P2 prom1颗粒相对应(图2和​和5）5)因此似乎不构成完整的中体(图8 B、B). 这些芽中较小的芽可能产生神经管液中观察到的P4 prom1颗粒，因此除了微绒毛外，可能是后者颗粒的第二来源(Marzesco等人，2005年;图8 B、a和B). 从分离的中体中出芽的膜泡可能对应于先前观察到的中体“退化”(Mullins和Biesele，1977年). 重要的是，已知显示prom1聚集的质膜突起含有特定的膜微结构域(Röper等人，2000年)，我们的观察表明，NE细胞的顶端中体是细胞粘附和分离后胞外膜交通的一种特殊供体结构。

初级纤毛上的Prom1是细胞外膜小泡的额外来源？

本研究将初级纤毛添加到prom1集中的质膜突起列表中。有趣的是，尽管先前报告的突起上有prom1（例如微绒毛、跛足和丝状足；Weigmann等人，1997年;Corbeil等人，2001年;Fargeas等人，2006年)是基于肌动蛋白的，这里发现的携带prom1的两种结构，中体和初级纤毛，是基于微管的。尽管突起1标记的顶端中心体解释了先前描述的具有突起1的多形性突起(Marzesco等人，2005年)到目前为止，初级纤毛上还没有发现prom1的存在。特别是，我们在这方面的两项意见值得评论。首先，在E10.5–13.5，即在神经发生开始时和之后，小鼠NE细胞的大多数（如果不是全部的话）初级纤毛含有prom1(图7，B–I)而在早期（E8.5），prom1在初级纤毛上几乎检测不到(图7 A)，提出纤毛上prom1的存在可能与这些神经前体细胞的分化状态有关。神经发生开始时纤毛上prom1的出现也与神经管液中P4颗粒出现的时间进程一致(Marzesco等人，2005年).

第二，初级纤毛上prom1的分布表明，小的膜泡从其顶端萌发。在初步报告中，Huang等人（Huang，K.、Diener，D.R.、Karki，R.、Pedersen，L.B.、Geimer，S.和Rosenbaum，J.L.，2005）。美国细胞生物学学会年会。文章摘要。1513），独立得出了类似的结论莱茵衣藻与其他人对该生物体的早期观察结果一致(McLean等人，1974年;伯格曼等人，1975年;斯内尔，1976年;Goodenough和Jurivich，1978年). 如果小的P4 prom1颗粒已知存在于神经管液中(Marzesco等人，2005年)至少部分来源于NE细胞的初级纤毛(图8 B、c)，这将增加这种可能性，即这些细胞器不仅对其细胞表现出信号接收功能(Pazour和Witman，2003年;希尔德布兰特和奥托，2005年;Pan等人，2005年;Hirokawa等人，2006年;斯科利和安德森，2006年)，但也可能是对其他细胞的信号发送功能。此外，初级纤毛的膜芽可能是控制纤毛长度的机制的一部分，在不同发育阶段和细胞周期的特定阶段，NE细胞的长度不同(图7，A–H;索罗金，1968年;Cohen等人，1988年).

初级纤毛和中体之间连接的prom1膜微结构域

有趣的是，初级纤毛存在于间期而非M期(Hinds和Ruffett，1971年;Rieder等人，1979年;Cohen等人，1988年;Pan等人，2005年)和中体，其存在与M期有关，共享许多成分，包括微管阵列和相关运动蛋白，以及特定蛋白激酶(马林斯和麦金托什，1982年;Gromley等人，2003年;Pan等人，2004年,2005;Skop等人，2004年). 体细胞干细胞膜标记prom1的存在以及NE细胞初生纤毛和顶端中体上含prom1膜芽的形成为这两个细胞器之间的关系提供了进一步的支持。这些细胞器可能合作的过程包括（1）通过其释放膜颗粒的能力，NE细胞顶端表面在发育过程中发生的减少以及向神经发生的转变(Kosodo等人，2004年;Marzesco等人，2005年)（2）从原发纤毛在多囊肾病中的作用推断(希尔德布兰特和奥托，2005年;夸姆比和帕克，2005年)NE细胞周期进展的调节。

Prom1、中体和NE细胞的对称与不对称分裂

我们的研究小组先前表明，大约垂直于NE细胞心室表面发生的分裂可以是对称的，也可以是不对称的，这取决于分裂沟分别将心尖膜切开还是绕过(Kosodo等人，2004年). 根据这一概念，只有将顶端膜一分为二的分裂才能在胞质分裂结束时形成表面含有prom1的顶端中体（即，中体从顶端出现到粘附连接带，并构成连接两个子细胞顶端表面的细胞质桥[图8 A]). 相反，绕过顶膜的劈理预计会在侧膜（包括连接复合体）的最顶端形成中体，而侧膜缺乏顶膜蛋白prom1。我们对根尖的观察(图6，A–E、E′、K–O和O′)与根尖下(图6，F–J，J′，P–T和T′）苯胺簇与此概念一致。重要的是，这意味着神经管管腔中的中体衍生prom1颗粒主要来源于经历对称、增殖而非不对称神经原性分裂的NE细胞。神经发生开始前P2 prom1颗粒在神经管液中的积聚及其随后的下降(Marzesco等人，2005年)完全符合这个概念。

另外，NE细胞顶端中体释放管腔prom1颗粒也有重要意义。在HeLa细胞中，中体环被其中一个子细胞不对称遗传，并通过间期持续存在(Mishima等人，2002年;Gromley等人，2005年). 我们的观察表明，与HeLa细胞相比，神经前体细胞通过释放其顶端中体来防止这种不对称。

卵内电穿孔和活体成像

鸡蛋（从Lohmann Tierzucht GmbH获得）在38°C的加湿培养箱中培养2天。在HH10-11，小鼠prom1-GFP、GFP-anillin和mRFP cDNA（1-2μg/μl）均由cag启动子驱动（CMV增强子耦合到β-actin启动子；Niwa等人，1991年)，被注射（＜0.1μl）到鸡脊髓腔中，并使用BTX电穿孔器通过施加五个25 V的脉冲，每个脉冲30 ms进行单向电穿孔(Muramatsu等人，1997年;Momose等人，1999年).

电穿孔后，将卵子孵育20–24小时，制备脊髓切片培养物，并按照前面所述进行延时荧光显微镜检查(Haubensak等人，2004年)，进行了以下修改。用剃须刀片（约400-μm厚的横切切片）对转染的脊髓区域进行解剖和手工切片。切片嵌入胶原蛋白（I-A型细胞基质；Nitta明胶公司）中，胶原蛋白在DME/F12（Invitrogen）、26 mM NaHCO中稀释至1–1.2 mg/ml_三20 mM Hepes和5 mM NaOH；在37°C下培养20分钟，使其凝固；并在37°C的POC室中覆盖含有100 U/ml青霉素/链霉素、10%鸡血清和5%胎牛血清的DME进行成像。使用倒置共焦显微镜（IX81型[Olympus]；客观PlanApo 60×oil；NA 1.4）和成像系统（FluoView 1000；Olympus）对切片进行成像。在切片中40–80μm深度同时采集荧光和差分干涉对比度（DIC）图像。在z轴上收集了大约10个光学截面，步长为1–1.2μm。成像时间为0.5–1.5小时，每35–120秒扫描一次切片，或将近7小时，每5分钟扫描一次。使用Imaris软件（Bitplane）分析图像，调整水平和伽马值，并使用Photoshop和Image Ready（Adobe）组合图像。

免疫组织学分析

NMRI野生型小鼠胚胎这21 ^GFP公司/+敲除线（C57BL6背景；Haubensak等人，2004年)将prom1基因敲除系（在比利时鲁汶鲁汶大学P.Carmeliet实验室产生）和电穿孔鸡胚固定在4%多聚甲醛中并冷冻切片。为了进行免疫染色，用鼠抗小鼠prom1单克隆抗体13A4（1.2μg/ml；Weigmann等人，1997年)，亲和纯化兔抗megalin抗体（1μg/ml；取自南卡罗来纳医科大学查尔斯顿分校S.Argraves；Drake等人，2004年)，亲和纯化兔抗苯胺抗体（1:400；从马萨诸塞州波士顿哈佛医学院C.Field获得；Oegema等人，2000年)、抗α-微管蛋白的小鼠单克隆抗体（1:400，Sigma-Aldrich）和识别pan-cadherin的小鼠单抗（1:200；Sigma-Aldrich），其次是Cy3-和Cy5-结合二级抗体（1:1000；Jackson ImmunoResearch Laboratories）。细胞核用DAPI染色（125 ng/ml；Sigma-Aldrich）。图像是通过传统荧光显微镜（BX61型[Olympus]；摄像机和采集设备，从Diagnostic Instruments，Inc.和ViSytron Systems获得，使用IPLab软件）或倒置显微镜（Axiover 200；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）采集的和激光扫描共焦成像系统（LSM 510[卡尔蔡司微成像公司]；PlanApo 63×oil；DIC物镜，NA 1.4），与LSM 510AIM采集软件（卡尔蔡斯微成像公司）一起使用，步长为1-μm z（prom1、cadherin和anillin的1个区域单元上的针孔），并使用Photoshop进行处理。

对于苯胺与prom1的双重免疫荧光定位，只分析了心室表面有丝分裂的NE细胞，其中苯胺聚集在心尖表面，即末期细胞。我们首先分析了这种顶端聚集的苯胺是与（对称分裂）prom1共定位还是与（不对称分裂）prom2不同。该分析是在研究人员不知情的情况下进行的这21-随后测定GFP的表达。

对于苯胺与钙粘蛋白的双重免疫荧光定位，只分析了心室表面有丝分裂的NE细胞，其中苯胺要么聚集在顶部表面，即末期细胞，要么至少与后期或末期细胞的收缩环有关。遵循前面描述的方法(Kosodo等人，2004年)，首先从姐妹染色单体的取向推断出卵裂面的取向，然后通过苯胺免疫染色显示的收缩环的取向来证实（在卵裂沟未完全进入的情况下）或钙粘蛋白免疫染色显示的卵裂沟的方向（在卵裂沟完全进入[90-100%]的情况下）。然后，我们确定卵裂是被预测为平分（对称分裂）还是绕过（不对称分裂）心尖膜，通过钙粘蛋白免疫染色显示为钙粘蛋白“洞”(Kosodo等人，2004年). 在卵裂沟完全进入的情况下，中体相对于钙粘蛋白孔的定位（通过苯胺免疫染色显示）是另一个决定性的标准。对称与非对称划分由研究人员在不知情的情况下确定这21-GFP表达，最后评分为弱或强。只有有丝分裂的NE细胞，其中对称与不对称分裂可以明确确定，并且由两名研究人员独立获得相同的评分，并且只有分裂沟完全进入90-100%的细胞最终被纳入量化。在应用高斯滤波器后，使用Imaris 4.1.1软件，特别是具有适当阈值设置的Iso Surface函数，从六到八个光学切片上对苯胺与prom1或钙粘蛋白免疫荧光和DAPI染色进行三维重建。

免疫印迹法

收集野生型E11.5 NMRI小鼠胚胎的神经管液，并通过差速离心进行分离，使用小鼠抗α-微管蛋白单克隆抗体（1:4000；Sigma-Aldrich）进行免疫印迹分析，如前所述(Marzesco等人，2005年).

传统变速器EM

小鼠胚胎在4%多聚甲醛中固定1-2小时，在2%戊二醛中过夜，均在磷酸盐缓冲液中。对胚胎大脑的特定区域进行切割和处理以进行EM。用1%四氧化锇对组织进行后固定，并在室温下通过分级系列乙醇脱水（每个步骤15–30分钟），然后用EmBed树脂（科学服务）渗透并在60°C聚合2天。超薄切片（70 nm）在UCT切片机（Leica Microsystems）上切割，并在电子显微镜下观察（Morgagni；FEI公司）。使用电荷耦合设备相机（MegaviewII；Soft Imaging System）和AnalySis软件（Soft Imagion System）或底片（SO163；Kodak）拍摄显微照片，底片在平板扫描仪（PowerLook 1100；UMAX）上用透射光进行扫描，并用Photoshop进行处理。

后埋藏免疫金传播EM

如前所述，对小鼠胚胎大脑样本进行处理，以进行德意志州冷冻切片和随后的单或双免疫金标记(Marzesco等人，2005年). 使用以下抗体：25–50μg/ml mAb 13A4，然后是大鼠IgG（Cappel）和蛋白A/5 nm金的兔抗血清（乌得勒支大学）；兔抗苯胺和megalin抗体（见免疫组织化学），在任何一种情况下，随后是蛋白A/10nm金；和鼠抗α-微管蛋白IgG1（1:600；Sigma-Aldrich）或鼠抗乙酰化微管蛋白的IgG2b（1:100；克隆6-11B-1；Sigma Aldrich。

亚细胞组分的免疫金透射电镜

通过23只E10.5小鼠神经管液的差速离心分离出的P2颗粒(Marzesco等人，2005年)在磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛中再次悬浮，并吸附到400目formvar/碳涂层格栅中。如前所述，样品通过免疫金标记和阴性对照进行处理(Marzesco等人，2005年).

预包埋免疫金传递EM

E8.5–12.5小鼠在磷酸盐缓冲液中4%多聚甲醛中固定至少24小时，并在使用前保存在固定剂中。将E8.5胚胎手动切割成小块，而将较老的胚胎嵌入3%的低熔点琼脂糖中，并制备200μm厚的振动切片（VT1000S；徕卡微系统）。在振动体切片的情况下，在磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛中后固定之前，去除周围的琼脂糖。在室温下与1μg/ml大鼠单克隆抗体13A4孵育2 h之前，用0.5%牛血清白蛋白和0.2%明胶在PBS中封闭组织块和振动切片。在封闭缓冲液中清洗后，将样品固定在4%多聚甲醛中，封闭并用兔抗大鼠IgG抗血清（1:1000）孵育，然后用蛋白A/10 nm金孵育。样品用PBS清洗，并在室温下用1%戊二醛在磷酸盐缓冲液中固定15分钟。然后如上所述对样品进行塑料嵌入处理（参见常规透射EM）。使用Photoshop增加了扫描显微照片的整体对比度设置（参见传统透射EM）。

免疫金标扫描电镜

用E10.5胚胎进行Prom1免疫金标记扫描电镜（见预包埋免疫金传输电镜），但脑室是通过矢状切口手动打开的，并使用与18nm金（Dianova）偶联的山羊抗兔抗体代替蛋白a。如前所述，处理戊二醛固定样品，通过扫描EM检测后向散射电子(Steegmaier等人，1997年).

我们感谢C.Field博士为我们提供亲和纯化的苯胺抗体；我们感谢K.Röper博士生成并表征小鼠prom1-GFP融合；Y.Kosodo博士提供了GFP-anillin构建物，K.Langenfeld博士提供了卓越的技术援助；MPI-CBG的生物医学服务（Y.Helppi）和光学显微镜设备（J.Peychl）提供专家支持；P.Carmeliet博士和同事们亲切地提供了prom1敲除小鼠系列；S.Argraves博士检测megalin抗体；H.Schwarz博士和J.Berger博士帮助进行免疫金扫描EM；J.Howard博士和A.Hyman博士进行了有益的讨论；以及S.Eaton博士对手稿的深刻评论。

V.Dubreuil获得EMBO长期奖学金的支持；D.Corbeil获得了德国联邦基金会（SFB/TR13-04 B1和SFB 655 A13）和德国国家科学技术研究院（4212/05-16）的资助；以及W.B.Huttner，由德意志联邦基金会（SPP 1109，Hu275/7-3；SPP 1111，Hu274/8-3；SFB/TR13-04，B1；和SFB 655，A2）和联邦教育和研究部（NGFN，SMP RNAi，01GR0402，和PRI-S08T05）资助。