介绍
线粒体是重要的细胞器，其结构和功能通过连续的融合和裂变事件适应不同的细胞条件(冈本和肖，2005年). 线粒体动力学发挥重要的生理和发育作用，调节凋亡过程，并影响线粒体内的能量生产(陈和陈，2005年). 两种神经病变，即夏科特-马里欧-牙2A型和常染色体显性视神经萎缩，是由重要融合成分（即丝裂原融合蛋白2或OPA1）的突变引起的(陈和陈，2005年). 虽然已经确定了参与融合的几个成分，其中许多是在酵母中，但线粒体融合事件的分子机制尚不清楚。线粒体外膜中的酵母菌Fzo1（或其哺乳动物同源物丝裂原1和2）作为融合复合体的一部分发挥了中心作用，酵母中也含有Ugo1和Mgm1(Meeusen和Nunnari，2005年).
不太清楚的是F-box蛋白Mdm30的作用，其缺失导致聚集和碎片化线粒体的积累(Fritz等人，2003年). 在21种注释蛋白质中酿酒酵母带有F-box图案(Willems等人，2004年)，一些在Skp1–Cdc53–F-box（SCF）E3泛素连接酶复合物中组装，其介导特定底物的蛋白酶体蛋白水解(Petroski和Deshaies，2005年). 事实上，Mdm30与细胞核中转录因子Gal4的转换有关(Muratani等人，2005年). Mdm30不仅定位于细胞溶质部分，还与线粒体相关(Fritz等人，2003年). 因此，与常驻ER蛋白的降解类似，Mdm30可能通过将线粒体融合机制与胞浆中的泛素-蛋白酶体系统（UPS）耦合来影响线粒体动力学。一直以来，在缺乏Mdm30的细胞中观察到Fzo1的积累(Fritz等人，2003年). 然而，尚不清楚这是否确实反映了Fzo1依赖Mdm30的蛋白水解，以及是否与UPS有关。值得注意的是，26S蛋白酶体与α-因子抑制酵母细胞中Fzo1的降解有关(Neutzner和Youle，2005年). 然而，在这些条件下，降解并不取决于Mdm30(Neutzner和Youle，2005年). 此外，26S蛋白酶体的参与仍有争议，因为只使用了蛋白酶体抑制剂，已知其仅对膜通透性增加或缺乏药物外排泵的酵母细胞有效(Lee和Goldberg，1996年).
我们分析了Mdm30在线粒体动力学调节中的作用，并首次证明了营养生长酵母细胞中Fzo1的Mdm30依赖性蛋白水解。Mdm30是一种新的蛋白水解途径的一部分，该途径不涉及SCF复合物和26S蛋白酶体，因此与α因子阻遏酵母细胞中Fzo1的蛋白酶体降解显著不同。
结果和讨论
Fzo1的Mdm30依赖和独立降解
Fzo1在Δmdm30细胞表明F-box蛋白Mdm30参与Fzo1的降解(；Fritz等人，2003年). 因此，我们评估了Fzo1在野生型和Δmdm30细胞后用环己酰亚胺抑制蛋白质合成。该分析表明Fzo1在野生型细胞中构成性降解，而在没有Mdm30的情况下保持稳定(). 在酵母菌细胞中，在指数或双相移后阶段进行了类似的实验，但未观察到Fzo1稳定性对生长阶段的显著依赖性(). 为了区分Fzo1的完全转换和加工，我们使用针对NH的抗体跟踪Fzol的降解2-末端GTPase结构域或位于Fzo1的COOH末端片段的肽。此外，携带NH的Fzo1变体的稳定性2-检查了末端HA标签。由于未检测到Fzo1的蛋白水解片段，因此我们得出结论，Fzol以Mdm30依赖的方式完全降解。
Fzo1的稳定性由两条独立的蛋白水解途径控制。（A，顶部）添加环己酰亚胺（CHX）后，通过SDS-PAGE和免疫印迹法监测Fzo1在指数生长（exp）或双移后培养（PDS）中的稳定性。（底部）量化，包括三个独立实验的标准偏差。（B） 细胞亚分馏。指数增长的野生型（wt）和Δmdm30如前所述，通过差速离心将细胞分裂为线粒体（颗粒）和胞质（sup）部分(Rapaport等人，1998年). 通过SDS-PAGE和免疫印迹分析组分中是否存在Fzo1。线粒体外膜蛋白Tom40和细胞溶质蛋白Tpi1被用作标记蛋白来验证分馏。（C） 线粒体外膜中Fzo1的复合形成。野生型和Δmdm30细胞在Triton X-100中溶解并通过Superose 6凝胶过滤色谱分离。用Fzo1特异性抗体通过免疫印迹分析洗脱液组分。（D） α因子诱导的细胞周期阻滞导致Fzo1降解。Fzo1在细胞周期中的稳定性——抑制野生型和Δmdm30按照A中的方法对细胞进行分析。电泳期间对应于116、43和27kD的标准分子质量标记的位置分别由显示Fzo1、Tom40或Tpi1的面板中的小条指示。
Mdm30可能影响Fzo1的定位和/或复杂组装，从而影响Fzo 1的稳定性和线粒体融合。因此，线粒体和线粒体后上清液中野生型和Δmdm30分析细胞是否存在Fzo1(). 无论是否存在Mdm30，Fzo1都是从线粒体部分中回收的，线粒体部分也含有线粒体外膜蛋白Tom40，但不含可溶性胞质蛋白Tpi1(). Fzo1在野生型细胞中组装成850-kD复合物(Rapaport等人，1998年)发现其存在于Δmdm30单元格(). 因此，Mdm30不影响Fzo1在线粒体外膜的组装。
最近有报道称，Fzo1在交配因子诱导的细胞周期阻滞后降解(Neutzner和Youle，2005年；). 有趣的是，在这些条件下，蛋白水解独立于Mdm30发生(Neutzner和Youle，2005年；)或编码F-box蛋白的任何其他非必需酵母基因（未公开数据）。因此，我们得出结论，Fzo1沿着两条生理和机械上不同的途径降解，一条在营养生长细胞中普遍存在，另一条在α-因子阻遏细胞中广泛存在。
Mdm30与Fzo1结合并以F盒依赖的方式介导蛋白质水解
为了评估Mdm30 F-box基序对Fzo1降解的需求，替换基序中的四个保守氨基酸残基，即L19P、P20A、E22Q和I23A(). 在第二个构造中，整个F-box被删除（氨基酸1-58；，ΔF-box）。亚细胞分离后发现野生型或突变型Mdm30与线粒体具有同等关联性（未公布数据）。在野生型和Δmdm30用免疫印迹法监测Fzo1的稳态水平。在野生型细胞中，Fzo1的稳态浓度不受突变型Mdm30的影响(). 在Δmdm30然而，只有野生型Mdm30的细胞，而非具有缺陷F-box的Mdm30变体能够恢复降解和低Fzo1稳态浓度(). 这些结果表明Fzo1的蛋白水解依赖于Mdm30 F-box的完整性。
构成性Fzo1周转取决于其相互作用伙伴Mdm30的F-box基序。（A） Mdm30变型的示意图。如图所示，获得了Mdm30衍生物F-box*，取代了Mdm30F-box基序的共有残基中的氨基酸残基19、20、22和23。通过删除Mdm30的1–58个氨基酸残基生成变体ΔF-box。（B） 野生型（wt）和Δmdm30使用Fzo1特异性抗体和Tom40特异性抗体作为负荷控制，通过免疫印迹分析表达Mdm30变体或经载体控制转化的菌株。（C） 线粒体来源于野生型细胞，表达几个携带NH的Mdm30变异体2-用载体控制转化的末端Flag表位或细胞溶解在洋地黄素中，并使用Fzo1特异性抗体进行免疫沉淀。用针对Mdm30蛋白Flag表位的抗体通过免疫印迹法分析总提取物（输入；5%）和免疫沉淀物（IP；100%）。电泳期间对应于116、43和66 kD的标准分子质量标记的位置分别由面板中显示Fzo1、Tom40或Mdm30的小条指示。
为了检测Mdm30是否与Fzo1直接相互作用，我们在表达Mdm30或其F-box变体的细胞中使用Fzo1-特异性抗体进行了联合免疫沉淀实验。用Fzo1特异性抗体沉淀Mdm30，证明这两种蛋白在野生型细胞中形成复合物(). 因此，与对其他F-盒蛋白的研究一致(Skowyra等人，1997年)，Mdm30识别Fzo1不依赖于其F-box(). 需要注意的是，线粒体膜与洋地黄素溶解后，Mdm30或突变变异体在分级色谱上与Fzo1没有协同作用，表明存在相当动态的相互作用（未公布的数据）。
Mdm30-介导的Fzo1转换独立于SCF复合物或泛素化
在高通量蛋白质相互作用研究中，发现Mdm30与Skp1和Cdc53都相关(Uetz等人，2000年)和体外试验(Kus等人，2004年). 因此，它对Fzo1蛋白水解的需求表明，降解是通过SCF复合物的泛素化发生的(Petroski和Deshaies，2005年). 在缺乏SCF复合物核心成分的细胞中进行蛋白质关闭实验(skp1-11号机组,skp1-12号机组、和cdc53-1型)或E2酶Cdc34(cdc34-2型). Fzo1在这些SCF缺乏细胞中降解，其动力学与野生型细胞相似(). 这与Grr1相反，Grr1是SCF复合物的已知底物(Galan和Peter，1999年)在这些突变体中稳定积累(). 我们还分析了Fzo1在允许关键基因四环素敏感表达的细胞中的稳定性川东北53和CDC34型(Mnaimneh等人，2004年)但没有观察到Fzo1在抑制川东北53或CDC34型（未发布的数据）。因此，Fzo1依赖Mdm30的蛋白水解不需要SCF泛素连接酶复合物。这些发现让人想起F-box蛋白Ctf13和Rcy1，它们不在SCF复合体中组装(Russell等人，1999年；Galan等人，2001年)，并证实F-box蛋白可能发挥泛素依赖蛋白降解以外的细胞功能。然而，应该强调的是，Mdm30可以通过与SCF复合物的相互作用介导其他底物蛋白的降解。最近观察到的细胞核内Gal4依赖Mdm30的泛素化支持了这一假设(Muratani等人，2005年).
组成型和诱导型Fzo1降解对泛素化的不同要求。（A–C）在植物生长的野生型（wt）中，用放线菌酮（CHX）抑制胞浆蛋白合成后，分析Fzo1和Grr1 myc的稳定性，Δmdm30,cdc34-2型,cdc53-1型,skp1-11号机组,skp1-12号机组、和uba1型ts秒37°C下的电池，如（D）在37°C下，在野生型和uba1号机组ts秒细胞。电泳期间标准分子质量标记的位置对应于158和116 kD，分别由显示Grr1或Fzo1的面板中的小条指示。
为了直接检测Fzo1可能被其他E3泛素连接酶泛素化，使用突变的E1酶限制细胞泛素池(uba1号机组ts秒)或通过突变泛素形式的过度表达，无法形成泛素链（K29R、K48R、K63R或RRR）。两种方法均未导致Fzo1稳定(). 我们得出结论，依赖于Mdm30的组成性Fzo1降解独立于SCF和泛素。
我们还研究了Fzo1蛋白水解泛素化在交配因子诱导的细胞周期阻滞中的作用uba1号机组ts秒发现细胞受损(). 因此，与Fzo1的组成性降解和Mdm30依赖性降解形成鲜明对比的是，Fzol在滞留细胞中的蛋白水解降解是泛素依赖性的().
Fzo1降解的蛋白酶体独立性和ATP依赖性
接下来，我们检查了蛋白酶体活性不足的酵母细胞中Fzo1的稳定性。Fzo1的蛋白水解在前1-1或cim5-1分别携带20S核心颗粒蛋白水解亚基或19S调节复合物ATP酶亚基突变的细胞(). 同样，蛋白酶体组装因子Ump1的缺失不会干扰营养生长细胞中Fzo1的蛋白水解分解(). 这与在交配因子存在下阻止的细胞中Fzo1蛋白水解形成对比(). 与之前的抑制剂研究一致(Neutzner和Youle，2005年)，Fzo1治疗后仍保持稳定预1-1或cim5-1含有α因子的细胞(). 我们得出结论，Fzo1的组成性Mdm30依赖性转换独立于26S蛋白酶体发生，而Fzo1-在α-因子阻滞后的降解涉及泛素化和26S蛋白酶。
Fzo1降解由一个新的蛋白水解系统介导。（A） 在野生型（wt）中监测Fzo1的稳定性，Δmdm30,预1-1,cim5-1,Δump1，
Δyme1、和Δpep4添加环己酰亚胺（CHX）后的电池（B）在野生型中检测了α因子诱导的细胞周期阻滞后Fzo1的稳定性，前1-1、和cim5-1细胞，也缺乏棒1（C）用环己酰亚胺（CHX）和叠氮化钠（NaN）处理指数生长的野生型细胞三)或CCCP。Fzo1的稳定性测定如下电泳过程中标准分子质量标记对应116 kD的位置由小条表示。
为了进一步表征Mdm30-介导的Fzo1蛋白水解，我们检测了该蛋白水解途径的潜在ATP依赖性。线粒体中使用了两种ATP生成的化学抑制剂：NaN三细胞色素抑制剂c（c）氧化酶和羰基氰化物米-氯苯腙（CCCP）是一种解偶联剂，可通过线粒体内膜耗散膜电位。两种处理都完全阻断了Fzo1的降解，Fzo2似乎依赖于ATP().
因此，我们分析了缺乏ATP依赖性的线粒体中Fzo1的稳定性我-AAA蛋白酶亚单位Yme1，活跃于线粒体膜间隙(Leonhard等人，1996年)，但未观察到对Fzo1降解的任何影响(). 此外，我们检测了液泡降解的参与，液泡降解负责在雷帕霉素诱导的自噬条件下线粒体蛋白的一般去除(Kissova等人，2004年). 然而，Fzo1在第四人民党缺乏活性液泡肽酶的细胞(). 我们得出结论，Fzo1被一个尚不清楚的蛋白水解酶系统组成性降解，其活性明显依赖于ATP。
Mdm30仅通过Fzo1蛋白水解控制线粒体融合
删除MDM30型损害线粒体融合，导致线粒体碎片的形成，并伴有Fzo1的积累(；Fritz等人，2003年). 检查Fzo1是否在Δmdm30细胞是线粒体融合受损的一般结果，Fzo1的稳态浓度在Δugo1,Δmgm1、和Δpcp1突变细胞。Fzo1没有在这些突变细胞中积累，这表明Fzol的细胞水平与正在进行的线粒体融合之间没有直接联系(). 为了进一步证实Mdm30对Fzo1稳定性和线粒体融合的特异性影响，我们分析了131株非必需缺失菌株和已知线粒体碎片的16个tet-off必需基因对Fzo 1稳态水平的影响(Dimmer等人，2002年；Altmann和Westermann，2005年). 然而，除了Δmdm30我们没有观察到Fzo1水平的改变（未发表的数据）。因此，Mdm30可能通过特异性调节Fzo1的稳定性来影响线粒体动力学。
通过Fzo1的Mdm30-依赖性蛋白水解控制线粒体融合。（A） 野生型（wt）表达mtGFP后，通过荧光显微镜观察细胞（Nomarski）和线粒体（GFP）形态，Δfzo1、和Δmdm30细胞或野生型细胞中表达Fzo1的多拷贝质粒CUP1大学添加铜（50μM；wt+Fzo1）时的促进剂2μ). （B） 使用Fzo1特异性抗体和Tom40特异性抗体作为负荷控制，通过免疫印迹分析所示菌株提取物中Fzol的稳定浓度。（C） Fzo1在野生型和Δmdm30细胞。蛋白质合成关闭实验如使用指数增长的野生型或Δmdm30在内源性控制下，从着丝粒（cen）或多拷贝（2μ）质粒表达HA-Fzo1的细胞FZO1型发起人。（D） 野生型和Δmdm30表达mtGFP的细胞，并含有镀锌1启动子上游FZO1型编码区生长在含葡萄糖、棉子糖或半乳糖的培养基上。通过荧光显微镜观察mtGFP表达后的细胞（Nomarski）和线粒体（GFP）形态。（E） 野生型细胞表达mtGFP，并含有镀锌1启动子上游FZO1型编码区生长在含葡萄糖或半乳糖的培养基上。细胞表达MDM30型在多拷贝质粒的控制下CUP1大学启动程序（如有指示）。荧光显微镜观察细胞（Nomarski）和线粒体（GFP）形态。电泳期间对应于116和43 kD的标准分子质量标记的位置分别由显示Fzo1或Tom40的面板中的小条指示。棒材，5μm。
为了证实Mdm30对Fzo1的特异作用，我们评估了野生型细胞中Fzol过度表达的线粒体形态。令人惊讶的是，细胞中的线粒体在存在MDM30型野生型等位基因类似于Δmdm30单元格(). 与这一观察结果一致，Fzo1的蛋白水解仅在从着丝粒低拷贝质粒中表达时观察到，而在从多拷贝质粒表达时未观察到(). 通过调节野生型和Δmdm30使用诱导物的细胞镀锌1发起人。在葡萄糖、棉子糖或半乳糖存在下生长的酵母细胞会抑制、抑制或诱导Fzo1合成。重要的是，在Δmdm30在棉子糖存在的非压制条件下生长的细胞，即Fzo1的中间表达水平(和). 这证实线粒体形态可以通过改变Fzo1表达水平进行调节。因此，线粒体融合需要严格控制Fzo1的稳态浓度。我们得出结论，降低Fzo1蛋白水平可以绕过Mdm30。因此，Mdm30仅通过控制Fzo1的稳态水平促进线粒体融合。
表一。
| 线粒体形态（细胞百分比）
|
|---|
| 菌株/培养基 | 碎片 | 聚合 | 管状 |
|---|
| 重量/GAL1-FZO1型
| | | |
| 葡萄糖 |
92
| 7 | 1 |
| 棉子糖 |
90
| 8 | 2 |
| 半乳糖 | 16 |
79
| 5 |
|
Δmdm30/GAL1-FZO1型
| | | |
| 葡萄糖 |
89
| 5 | 6 |
| 棉子糖 | 8 | 6 |
86
|
| 半乳糖 | 10 |
86
| 4 |
在野生型细胞中过度表达Fzo1可以阻止其降解，这表明Mdm30可能是限制因素。因此，Mdm30在含有半乳糖诱导物的细胞中过度表达FZO1型等位基因。令人惊讶的是，我们发现Fzo1和Mdm30的同时过表达对细胞生长有害，并导致异常的细胞和线粒体形态(). 因此，可以想象Fzo1–Mdm30复合体隔离了一个对增长至关重要的未知因素。
结论
我们的实验证明了Fzo1蛋白水解在维持线粒体形态方面的关键作用。Fzo1的稳定性由一个新的明显依赖ATP的蛋白水解酶系统控制。该系统涉及F-box蛋白Mdm30，但不涉及泛素化和SCF复合物，为F-box蛋白的细胞活性开辟了新的前景。我们的结果还表明，线粒体外膜中的蛋白质至少可以通过两种方式降解，其中只有一种方式依赖于UPS。同时，他们提出了一种机制，通过在真核细胞的不同生理状态下使用两种不同的蛋白水解系统来调节细胞器的形态。
材料和方法
酵母菌株和生长培养基
酵母菌株按照标准程序在添加了2%（wt/vol）葡萄糖的完整或合成培养基上生长，或者，如果需要，添加2%（wt/vol）半乳糖或棉籽糖和0.02%（wt/vol）葡萄糖。100μg/ml环己酰亚胺，10μMα-因子（或0.1μM，在Δbar1电池），2 mM NaN三或在指示时添加1 mM CCCP。显微镜下证实α-因子存在时细胞周期阻滞。
使用的酵母菌株是W303和BY4741的衍生物。菌株Δmdm30,Δfzo1,Δugo1,Δpcp1，或Δmgm1从Euroscaw获得了等基因野生型菌株BY4741Δmdm30控制下的单元格镀锌1启动子，使用先前描述的菌株(Fritz等人，2003年).MDM30型和政治公众人物4被W303中基于PCR的同源重组删除。为了提高α因子阻滞的效率，棒1在野生型中被基于PCR的同源重组删除，cim5-1、和前1-1细胞。
质粒
FZO1型,MDM30型、和百万立方米编码NH的突变变体（F-box*，具有L19P、P20A、E22Q和I23A突变；ΔF-box，没有残基1-58）2-将末端FLAG标签克隆到多拷贝载体pJDCEX2（2μ；LEU2级和CUP1大学发起人）。携带NH的Fzo12-在内源性启动子的控制下，使用着丝粒质粒pRS315或多拷贝质粒YEplac181表达末端HA标签。为了可视化线粒体，使用质粒pVT100U-mtGFP（线粒体靶向GFP）。
蛋白质合成停止和α因子细胞周期阻滞
为了监测Fzo1的组成性蛋白水解，将放线菌酮添加到最终浓度为100μg/ml的对数生长酵母培养物中。在添加放线菌酰胺之前，将热敏菌株在37°C下培养1h。为了检测α因子诱导的细胞周期阻滞对Fzo1降解的影响，用20 mM柠檬酸钠和10μMα因子（或0.1μMΔ巴1菌株）。在指定的时间点，收集对应于3个OD单位的细胞，并在碱性pH条件下进行溶解(Tatsuta和Langer，2006年)用SDS-PAGE和免疫印迹法分析蛋白质提取物。显示了至少三个独立实验的平均值。
Fzo1和Mdm30的免疫共沉淀
表达来自铜响应启动子的Mdm30及其变体的野生型细胞在合成培养基上生长，无需额外的铜补充。将从这些细胞的60个OD单位获得的粗线粒体溶解在免疫沉淀缓冲液（150 mM KAc、4 mM MgAc、30 mM Tris/HCl、pH 7.4、1 mM PMSF和1 mM ATP）中的1%（wt/vol）洋地黄素中15分钟。在45000转了15分钟后克，上清液在4°C下与蛋白A–Sepharose和针对Fzo1 GTPase结构域的多克隆抗体持续混合培养1 h。在免疫沉淀缓冲液中经过两个洗涤步骤，在10 mM Tris/HCl（pH 7.4）中经过一个洗涤步骤后，用SDS样品缓冲液洗脱结合物，并用于Western blot分析。
抗体
抗Fzo1 COOH末端的抗血清(Rapaport等人，1998年)使用了Fzo1的GTPase结构域（由加利福尼亚大学戴维斯分校J.Nunnari提供）、HA表位（3F10；Roche）、FLAG表位（M2-F3165；Sigma-Aldrich）或myc表位（9B11；细胞信号技术）。
显微镜
使用100×油浸物镜，在显微镜（Axioplan；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）上通过外荧光显微镜分析过夜培养物。活细胞中可见GFP荧光。使用相机（Quantix；Photometrix）采集图像，并使用MetaMorph 4.5软件（Universal Imaging Corp.）进行处理。
