美国国家科学院院刊。1997年4月15日；94(8): 3668–3672.
Bax和Bcl-X的细胞膜再分布L（左）在细胞凋亡期间
美国国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所外科神经病学分所生物化学科，地址：马里兰州贝塞斯达市中心路10号5D-37室，邮编：20892
R.John Collier，哈佛医学院，马萨诸塞州波士顿
收稿日期：1996年11月8日；1997年1月29日接受。
摘要
Bcl-2、Bcl-XL（左）和Bax是Bcl-2家族的成员，在细胞凋亡的调节中起关键作用。这些蛋白被认为是膜结合的，它们能够同时进行同二聚和异二聚来调节细胞凋亡。我们在此报告，在小鼠胸腺细胞中，Bcl-2仅与膜结合，而Bax主要存在于胞浆和Bcl-X中L（左）以可溶性和膜结合形式存在。地塞米松或γ射线诱导小鼠胸腺细胞凋亡改变Bax和Bcl-X的亚细胞位置L（左）从可溶性形式到膜结合形式。staurosporine诱导HL-60白血病细胞凋亡后，Bax从胞浆定位到细胞膜的位置发生了类似的变化。环己酰亚胺抑制细胞凋亡抑制Bax和Bcl-X的运动L（左）在地塞米松处理下，胸腺细胞从胞浆进入细胞膜。这些运动可能是该家族成员调控细胞凋亡途径中的一个重要步骤。
关键词：程序性细胞死亡，Bcl-2，Bax，白喉毒素
Bcl-2、Bax和Bcl-XL（左）是不断扩大的Bcl-2家族的成员，在细胞凋亡的调节中起着关键作用。Bcl-2和Bcl-X的过度表达L（左）通过抑制大量细胞的凋亡来提高细胞存活率，这些细胞受到广泛的凋亡诱导刺激，包括生长因子戒断、辐射和化疗药物（综述见参考文献）。1–4). 与Bcl-2和Bcl-X不同L（左）Bax的过度表达会加速生长因子退出后的细胞死亡(5). 这些蛋白被认为通过同源和异源二聚体来调节细胞凋亡(5–7).
Bcl-2、Bax和Bcl-XL（左）在C末端包含疏水段(5,8,9)这被认为是一种膜锚。Bcl-2亚细胞定位于核膜、内质网和线粒体外膜(10,11). 类似地，Bcl-XL（左）最近定位于线粒体的外膜(12). 虽然Bax的亚细胞定位尚未被记录，但由于Bax存在假定的C末端跨膜段，并且能够与Bcl-2二聚体，因此建议Bax与Bcl-3在相同的亚细胞隔室内共定位(5).
在本文中，我们报道了Bax和Bcl-X的独特亚细胞定位L（左）在正常小鼠胸腺细胞中。此外，我们描述了诱导凋亡时这些蛋白质在细胞内的快速重新分布。
材料和方法
Bax、Bcl-2和Bcl-X的亚细胞定位L（左）.
在Iscove培养基（马里兰州罗克维尔，Biofuids）存在下，从小鼠胸腺中分散小鼠胸腺细胞。将细胞离心，在Iscove培养基中清洗，然后以5×10的细胞密度重新悬浮7裂解缓冲液中每毫升的细胞数[10 mM Hepes，pH 7.4/38 mM NaCl/苯甲基磺酰氟（25μg/ml）/亮氨酸肽（1μg/ml）/抑肽酶（1μg/ml）]。细胞悬液在Dounce均质器中均质并在900×克在Sorvall SA-600转子中对原子核进行颗粒化。然后以130000×克在Beckman Ti 80转子中造粒膜。将粗膜和核颗粒重新悬浮在与上清液体积相等的裂解缓冲液中。Bax、Bcl-2和Bcl-X的相对水平L（左）用相应的抗体（Y.-T.H.和R.J.Y.，未发表的结果），通过Western blotting分析细胞溶质、粗膜和核部分。
为了研究地塞米松和γ辐射诱导的凋亡，将小鼠胸腺细胞重新悬浮在含有10%胎牛血清的Iscove培养基中，细胞密度为7.5×107每毫升胸腺细胞接受2μM地塞米松或8 Gyγ射线照射137Cs来源。在处理后2和4小时，收集细胞，离心，并在Iscove培养基中清洗一次。然后如前所述进行亚细胞分级。对于环己酰亚胺抑制研究，添加10μg/ml的环己酰酮，或者不添加，或者与添加2μM地塞米松一起添加。如上所述收集细胞并进行亚细胞分离。
对HL-60细胞进行staurosporine处理时，将细胞在不含或含有1μM staurosoprine的条件下处理2-4小时。然后收集细胞，在Iscove培养基中洗涤一次，将其溶解，并在裂解缓冲液（1×10）中均质7每毫升细胞数）。如上所述进行亚细胞分离。
SDS/PAGE和Western Blot分析。
采用Laemmli法在12%聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS/PAGE(13). 用SDS/PAGE分析亚细胞分离的每个蛋白质样品的23微升。凝胶要么用考马斯蓝染色，要么电印迹到Immobilion膜上(14). 用抗人（h）Bcl-2 124（Dako）、抗hBax 2D2、抗小鼠（m）Bax 5B7、抗通用（u）Bcl-X进行免疫印迹分析L（左）2H12，抗mBcl-2 10C4单克隆抗体如所述进行（Y.-T.H.和R.J.Y.，未发表的结果）。
结果
Bax、Bcl-2和Bcl-X的亚细胞定位L（左）.
通过低渗裂解、Dounce均质化和差速离心制备小鼠胸腺细胞的可溶性、粗膜和核组分。蛋白质样品通过考马斯蓝染色SDS/PAGE进行分析（图。 顶部)用抗mBax 5B7、抗mBcl-2 10C4和抗uBcl-X进行蛋白质印迹分析L（左）用于检测小鼠Bax、Bcl-2和Bcl-X的2H12单克隆抗体L（左）分别为。Bax主要作为可溶性蛋白存在于小鼠胸腺细胞中（图。 顶部、Western blot、车道a–c）。另一方面，在可溶部分中未检测到Bcl-2，并且在高速膜芯和核部分中都存在Bcl-2（图。 中部、Western blot、车道a–c）。最后，Bcl-XL（左）在胸腺细胞的所有三个隔室中都检测到（图。 底部、Western blot、车道a–c）。
Bax和Bcl-X的差异定位L（左）以及地塞米松诱导细胞凋亡时与细胞膜的关系。地塞米松可诱导小鼠胸腺细胞凋亡。用地塞米松低渗溶解未经处理的细胞（a–c道）和孵育2 h（d–f道）和4 h（g–i道）的细胞，用Dounce均质器均质，并通过差速离心分离成可溶性细胞（a、d和g道）、高速膜球（b、e和h道）和核组分（c、f和i道）。蛋白质样品用SDS/PAGE在考马斯蓝（CB）染色的凝胶上分析，或用抗mBax 5B7、抗mBcl-2 10C4和抗uBcl-X的Western印迹法分析L（左）2H12单克隆抗体。
Bax和Bcl-X的膜结合L（左）细胞凋亡后。
Bax和Bcl-X的意外而独特的亚细胞定位L（左）促使我们研究其在细胞凋亡过程中的亚细胞分布。当用2μM地塞米松处理小鼠胸腺细胞2和4小时时，Bax、Bcl-2或Bcl-X的总蛋白水平L（左）未更改（数据未显示）。为了检查这些蛋白质的亚细胞分布，在与地塞米松孵育2和4小时后，用Dounce均质器低张裂解胸腺细胞并使其均质。通过SDS/PAGE和Western印迹分析未处理和地塞米松处理的胸腺细胞的可溶性蛋白、粗膜和核级分。SDS/聚丙烯酰胺凝胶的考马斯蓝染色表明，在诱导凋亡后，低分子量组蛋白从细胞核释放到可溶性和膜组分（图。，考马斯蓝染色凝胶，车道d、e、g和h）。用抗mBax 5B7抗体进行的Western blot分析表明，在地塞米松治疗后2和4小时，Bax的亚细胞定位从胞浆显著转移到粗膜或核室（图。 顶部、Western blot、车道e、f、h和i）。另一方面，如抗mBcl-2 10C4标记所示，Bcl-2在诱导凋亡后仍被分隔成粗膜或核部分（图。 中部，Western blot）。最后，用抗uBcl-X进行Western blot分析L（左）2H12表示Bcl-XL（左），最初显示可溶性和膜相关形式（图。 底部，蛋白质印迹，泳道a–c），在诱导细胞凋亡后2小时内主要与膜相关（图。 底部、Western blot、车道e、f、h和i）。因此，Bax和Bcl-XL（左）地塞米松诱导细胞凋亡时，细胞从胞浆迁移到膜部分。
除了地塞米松治疗外，我们还检测了γ射线照射诱导的小鼠胸腺细胞凋亡。在照射后2和4小时，胸腺细胞被低渗溶解，用Dounce均质器均质，并进行亚细胞分离。蛋白质样品再次在考马斯蓝染色SDS/聚丙烯酰胺凝胶和Western blots上进行分析（图。). 在诱导凋亡后，与地塞米松的结果一致，发现Bax的定位从胞浆转移到膜（图。 顶部，Western blot）。发现Bcl-2的膜定位在凋亡反应中没有改变（图。 中部，Western blot）。最后，Bcl-XL（左）在诱导细胞凋亡时，其从可溶性和膜结合形式的凋亡前双重定位转变为膜结合形式（图。 底部，Western blot）。
Bax和Bcl-X协会L（左）膜对γ射线诱导的细胞凋亡作出反应。γ射线照射诱导小鼠胸腺细胞凋亡。未经处理的细胞（a–c道）和照射后2 h（d–f道）和4 h（g–i道）收集的细胞被低渗溶解，在Dounce均质器中均质，并通过差速离心分离成可溶性（a、d和g道）、高速膜颗粒（b、e和h道）和核组分（c、f和i道）。蛋白质样品用SDS/PAGE在考马斯蓝（CB）染色的凝胶上分析，或用抗mBax 5B7、抗mBcl-2 10C4和抗uBcl-X的Western印迹法分析L（左）2H12单克隆抗体。
抑制细胞凋亡阻断地塞米松诱导的Bax和Bcl-X移位L（左）.
确定凋亡抑制是否阻止Bax和Bcl-X定位中的凋亡相关移位L（左）小鼠胸腺细胞在生长培养基中孵育2h，孵育过程中加入或不加入放线菌酮（一种已知的胸腺细胞凋亡抑制剂）、地塞米松或放线菌胺和地塞米森的混合物。通过SDS/PAGE和Western blotting分析亚细胞分离得到的样品。可溶性和膜结合Bax和Bcl-X的相对百分比L（左）通过密度分析测定。如图所示。考马斯蓝染色的单个样本的蛋白质带型非常相似。用抗mBax 5B7抗体进行的Western blot分析表明，单独培养时Bax主要以可溶性形式存在（80%可溶性vs.20%膜结合；图。 顶部，Western blot，lanes a–c）或在环己酰亚胺存在下（80%可溶性vs.20%膜结合；图。 顶部、Western blot、车道d–f）。用地塞米松处理胸腺细胞，使大量细胞溶质Bax转移到膜中（55%可溶，45%膜结合；图。 顶部，蛋白质印迹，泳道g–i），这种转移被环己酰亚胺的存在部分阻断（70%可溶，30%膜结合；图。 顶部、Western blot、lanes j–l）。Bcl-2的亚细胞定位不受地塞米松或放线菌酮处理的影响（图。 中部，Western blot）。Bcl-X公司L（左）在未经处理的情况下，具有细胞溶质和膜结合形式（15%可溶，85%膜结合；图。 底部、Western blot、lanes a–c）和环己酰亚胺处理的细胞（30%可溶，70%膜结合；图。 底部、Western blot、车道d–f）。Bcl-X公司L（左）经地塞米松处理后，成为膜唯一结合（3%可溶性vs 97%膜结合；图。 底部、Western blot、lanes g–i）。这种膜定位被环己酰亚胺的存在所阻断（25%可溶，75%膜结合；图。 底部、Western blot、lanes j–l）。这表明抑制地塞米松诱导的凋亡阻止了细胞溶质Bcl-X的转移L（左）在某种程度上，Bax进入膜。
环己酰亚胺抑制地塞米松诱导的细胞凋亡阻断Bax和Bcl-X的迁移L（左）进入膜中。将小鼠胸腺细胞在没有或存在放线菌酮、地塞米松或放线菌胺和地塞米森的组合的培养基中培养2 h。收集细胞，低渗溶解，在Dounce均质器中均质，并分馏成可溶性（a、d、g和j道），通过差速离心法获得高速膜颗粒（通道b、e、h和k）和核组分（通道c、f、i和l）。样品在考马斯蓝（CB）染色的凝胶上通过SDS/PAGE进行分析，或通过抗mBax 5B7、抗mBcl-2 10C4和抗uBcl-X的Western印迹进行分析L（左）2H12单克隆抗体。
Staurosporine处理HL-60细胞促进Bax的膜结合。
为了确定Bax定位中的凋亡相关移位是否是一种常见现象，我们检测了Bax在另一个已建立的凋亡系统中的重新分布，该系统使用staurosporine诱导HL-60早幼粒细胞白血病细胞凋亡。这些细胞缺乏可检测的Bcl-XL（左）但表达Bax和Bcl-2。在这些细胞中，大多数Bax都在胞质溶胶中，尽管有可检测量的Bax似乎与膜结合（图。 上部、Western blot、车道a–c）。用staurosporine处理细胞后，Bax的定位在4小时内从优先胞质形式转变为膜结合形式（图。 上部、Western blot、lanes g–i）。与胸腺细胞和脾细胞研究一样，Bcl-2的膜定位不受staurosporine的影响（图。 下部，Western blot）。这表明凋亡过程中Bax进入细胞膜的运动与Bcl-X的存在无关L（左）在staurosporine处理的HL-60细胞中，似乎存在蛋白质水解。除了膜插入外，一些可溶性Bax可能在凋亡过程中降解。
Staurosporine治疗HL-60细胞促进Bax的膜结合。HL-60细胞在不存在（a–c道）或存在1μM staurosporine的情况下处理2 h（d–f道）和4 h（g–i道）。收集细胞，低渗裂解，用Dounce均质机均质，并通过差速离心将其分为可溶性（a、d和g道）、高速膜颗粒（b、e和h道）和核组分（c、f和i道）。样品用抗hBax 2D2和抗hBcl-2124单克隆抗体进行Western blotting分析。
与胸腺细胞的凋亡被蛋白质合成抑制所阻断不同，HL-60即使在环己酰亚胺的存在下也能执行凋亡途径(15). 我们发现，添加环己酰亚胺并没有阻止staurosporine诱导的Bax插入到膜中（数据未显示）。这表明膜结合的Bax分子以前存在于胞浆中，而不是在细胞凋亡期间转化的新合成分子。
讨论
Bcl-2、Bax和Bcl-XL（左）被认为是一组膜蛋白，通过体内二聚作用。在此，我们证明Bax不是像Bcl-2那样的膜蛋白，而是可溶的，这是因为它在高速超速离心后存在于健康小鼠胸腺细胞的上清液中。同样，Bcl-X的很大一部分L（左）被发现是细胞溶质。Bax和Bcl-X序列的水力学分析L（左）预测其C末端区域的跨膜结构域(5,9). 在Bcl-2中，该C末端结构域被认为介导膜与各种细胞器的连接。从Bcl-2中去除这种疏水性尾巴导致了一系列结果，要么完全消除了这种蛋白质的生存功能，要么根本没有效果(16–18). 另一方面，截断Bax或Bcl-X的C端疏水尾L（左）似乎对它们在促进细胞死亡或存活方面的作用没有影响（J.Lee、Y.-T.H.、R.J.Y.和K.A.Wood，未发表的数据；裁判。19). 观察到Bax和Bcl-X的重要部分L（左）它们的C末端疏水结构域可能隐藏在蛋白质内部，也可能与其他细胞溶质因子结合。有趣的是，糖蛋白，一种红细胞蛋白，被认为是一种可溶性蛋白，尽管它有一个预测的跨膜段(20).
地塞米松或γ射线照射诱导小鼠胸腺细胞凋亡导致Bax和Bcl-X定位发生改变L（左）从可溶性形式到膜结合形式。在地塞米松诱导的细胞凋亡过程中，这些蛋白进入细胞膜的运动被环己酰亚胺阻断。这表明需要蛋白质合成的凋亡途径的位置是导致Bax和Bcl-X的事件的上游L（左）插入膜中。在另一种细胞系统，即HL-60早幼粒细胞白血病中，我们观察到在星形孢菌素诱导的细胞凋亡过程中Bax进入细胞膜。这表明，在细胞凋亡过程中，这些蛋白进入细胞膜的运动可能在不同的细胞类型中广泛存在，Bax促进细胞死亡，Bcl-XL（左）促进细胞存活。
Bcl-2、Bcl-X的作用机制L（左），Bax调节细胞凋亡仍不明确。最近，Bcl-X的晶体和溶液结构L（左）表明Bcl-X中的α-螺旋结构L（左）类似于白喉毒素的膜易位域(19). 大量Bax成为膜结合的事实表明，它也可能具有类似于Bcl-X的α-螺旋结构L（左）和白喉毒素。在白喉毒素中，蛋白质沉积从可溶性形式转变为膜结合形式是由pH值的变化触发的(21–23). 我们的研究表明，在Bcl-2家族成员中存在类似的活动，其中大约一半的Bax和几乎所有的Bcl-XL（左）在诱导细胞凋亡过程中成为膜相关。然而，可溶性Bax和Bcl-XL（左）暴露时未插入膜在体外至低pH值（pH值5.2；未公布数据）。因此，我们没有发现凋亡期间发生的细胞内环境酸化的证据(24,25)负责Bcl-XL（左）或Bax插入。Bax的膜结合形式能够抵抗碱萃取，表明其具有较强的膜结合性（未公布的数据）。Bax和Bcl-X的重新分布L（左）如图所示。在经历凋亡的胸腺细胞中，Bax和Bcl-X的触发因素L（左）插入膜的情况尚不清楚。丝氨酸残基上Bcl-2的磷酸化与细胞凋亡过程中其功能的失活有关(26,27). 确定Bax和Bcl-X是否L（左）可以被磷酸化，以及这种修饰是否会影响其插入膜。此外，重要的是要确定Bax和Bcl-X的作用位点L（左）在细胞溶质或膜中，以及Bax和Bcl-X的预测跨膜段L（左）在细胞凋亡过程中，在其插入膜中发挥作用。
Bax和Bcl-X膜插入示意图L（左）在小鼠胸腺细胞中，Bax是胞质的，Bcl-2主要是膜结合的，而Bcl-XL（左）以可溶性和膜结合形式存在(我). 在地塞米松或γ射线照射诱导细胞凋亡后，几乎所有的细胞溶质Bcl-XL（左）大量Bax变成膜结合。尚不清楚Bax在其膜相关状态下是否发生异二聚或同二聚(ii（ii）). 或者，Bax、Bcl-2和Bcl-X可能L（左）在膜结合状态下，可能会竞争膜中未知蛋白质的结合，以促进细胞死亡或存活(三).
致谢
我们感谢Shu-Chan Hsu（斯坦福大学）对手稿的技术援助和批判性审查，感谢Steven Rafferty对手稿提出的有益建议，感谢Katherine Wood和Pat Johnson的技术讨论。K.G.W.是霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）——美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的研究学者。
工具书类
1Boise L H、Gottschalk A R、Quintáns J、Thompson C B。当前顶级微生物免疫学。1995;200:107–121.[公共医学][谷歌学者] 2里德J C。北美Hematol Oncol Clin。1995;9：451–473。[公共医学][谷歌学者] 4Yang E、Korsmeyer S J。鲜血。1996;88:386–401.[公共医学][谷歌学者] 5Oltvai Z N、Milliman C L、Korsmeyer S J。单元格。1993;74:609–619.[公共医学][谷歌学者] 6Sedlak T W、Oltvai Z N、Yang E、Wang K、Boise L H、Thompson C B、Korsmeyer S J。美国国家科学院程序。1995;92:7834–7838. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Yang E、Zha J、Jockel J、Boise L H、Thompson C B、Korsmeyer S J。单元格。1995;80:285–291.[公共医学][谷歌学者] 8津本Y、池崎N、克罗齐C·M。癌基因。1987;2:3–7.[公共医学][谷歌学者] 9Boise L H、González-García M、Postma C E、Ding L、Lindsten T、Turka L a、Mao X、Nuñez G、Thompson C B。单元格。1993;74:597–608.[公共医学][谷歌学者] 10Hockenbery D M、Nuñez G、Milliman C、Schreiber R D、Korsmeyer S J。自然（伦敦）1990;348:334–336.[公共医学][谷歌学者] 11Krajewski S、Tanaka S、Takayama S、Schibler M J、Fenton W、Reed J C。癌症研究。1993;53:4701–4714.[公共医学][谷歌学者] 12González-García M、Pérez-Balestero R、Ding L、Duan L、Boise L H、Thompson C B、Nuñez G。开发（英国剑桥）1994;120:3033–3042.[公共医学][谷歌学者] 13莱姆利英国。自然（伦敦）1970;227:680–685.[公共医学][谷歌学者] 14Molday L L、Cook N J、Kaupp U B、Molday R S。生物化学杂志。1990;265:18690–18695.[公共医学][谷歌学者] 15Martin S J、Lennon S V、Bonham A M、Cotter T G。免疫学杂志。1990;145:1859–1867.[公共医学][谷歌学者] 16Alnemri E S、Robertson N M、Fernandes T F、Croce C M、Litwack G。美国国家科学院程序。1992;89:7295–7299. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Hockenbery D M、Oltvai Z N、Yin X-M、Milliman C L、Korsmeyer S J。单元格。1993;75:241–251.[公共医学][谷歌学者] 18Borner C、Martinou I、Mattmann C、Irmler M、Scharer E、Martinoo J-C、Tschopp J。细胞生物学杂志。1994;126:1059–1068. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Muchmore S W、Sattler M、Liang H、Meadows R P、Harlan J E、Yoon H S、Nettesheim D、Chang B S、Thompson C B、Wong S-L、Ng S-C、Fesik S W。自然（伦敦）1996;381:335–341.[公共医学][谷歌学者] 20Anderson R A、Marchesi V T。自然（伦敦）1985;318:295–298.[公共医学][谷歌学者] 22Hu V W，Holmes R K。生物化学杂志。1984;259:12226–12233.[公共医学][谷歌学者] 23Zhan H、Oh K J、Shin Y-K、Hubbell W L、Collier R J。生物化学。1995;34:4856–4863.[公共医学][谷歌学者] 24Rebollo A、Gómez J、Aragón A M、Lastres P、Silva A、Pérez Sala D。实验细胞研究。1995;218：581–585。[公共医学][谷歌学者] 25李杰，伊士曼A。生物化学杂志。1995;270:3203–3211.[公共医学][谷歌学者] 26May W S、Tyler P G、Ito T、Armstrong D K、Qatsha K A、Davidson N E。生物化学杂志。1994;269:26865–26870.[公共医学][谷歌学者] 27Haldar S、Jena N、Croce C M。美国国家科学院程序。1995;92:4507–4511. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
