投资眼科视觉科学。作者手稿；PMC 2007年11月1日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院27827
老鼠Ccl2/Cx3cr1型缺陷导致视网膜病变模仿人类年龄相关性黄斑变性
,1 ,1,2 ,1,2 ,1,2 ,1 ,1 ,三 ,4 ,5 ,4 ,三和1
金圣拓
1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所免疫学实验室
克里斯汀·博亚诺夫斯基
1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所免疫学实验室
Min Zhou女士
1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所免疫学实验室
沈德芬
1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所免疫学实验室
罗伯特·J·罗斯
1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所免疫学实验室
凯文·罗森博格
1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所免疫学实验室
D.约书亚·卡梅隆
三犹他州盐湖城犹他大学约翰·莫兰眼科中心。
尹春月
4马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所外科神经病学分院
杰弗里·科瓦拉克
5马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心理健康研究所神经毒理学实验室
郑平庄
4马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所外科神经病学分院
张康（音译）
三犹他州盐湖城犹他大学约翰·莫兰眼科中心。
陈池超
1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所免疫学实验室
1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所免疫学实验室
三犹他州盐湖城犹他大学约翰·莫兰眼科中心。
4马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所外科神经病学分院
5马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心理健康研究所神经毒理学实验室
通讯作者：Chi-Chao Chan，免疫学实验室，10/10N103，国立卫生研究院/国家眼科研究所，10 Center Drive，Bethesda，MD 20892-1857；vog.hin.ien@cnahc. 2这些作者对本文所述的工作做出了同等贡献，因此应被视为同等作者。
摘要
目的
衰老的Ccl2公司-/-据报道，小鼠出现了人类年龄相关性黄斑变性（AMD）的主要特征。CX3CR1内的功能丧失单核苷酸多态性也被发现与AMD相关。作者生成Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠建立更具特征性和可复制性的AMD模型。
方法
单个Ccl2公司-和Cx3cr1型-将缺陷小鼠杂交以获得Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-老鼠。使用眼底镜、组织病理学、视网膜A2E定量、蛋白质组学、RT-PCR基因表达测定、免疫化学和Western blotting检查视网膜并评估视网膜组织中的基因表达。
结果
到6周大时，所有Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠出现AMD样视网膜病变，包括水肿、视网膜色素上皮改变和感光细胞变性。此外，15%的小鼠出现脉络膜新生血管。这些退行性病变随着年龄的增长而发展。A2E是AMD进展过程中积累的一种主要脂褐素荧光团，在AMD患者中显著升高Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-视网膜比野生型视网膜好。补体辅因子在Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-RPE。蛋白质组学数据表明，四种蛋白质在Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-视网膜与对照组比较。其中一种蛋白质ERp29是一种内质网蛋白，起着护卫伴侣和蛋白质折叠的作用。
结论
提交人的结论是Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠出现广泛的AMD异常，发病早，外显率高。这些观察结果暗示了某些趋化因子和内质网蛋白在AMD发病机制中的作用。与内质网蛋白功能障碍引起的神经退行性变的机制类似，伴随蛋白减少可能导致错误折叠的蛋白积累，导致酒石形成和视网膜退行性改变。
年龄相关性黄斑变性（AMD）是西方国家老年人失明的主要原因。1在建立AMD动物模型方面已经做出了相当大的努力。2-9尽管小鼠没有黄斑，但已有的小鼠AMD模型已显示出AMD的主要病理特征。三,8-10强有力的证据表明AMD与免疫过程有关。11此外，一些研究已成功证明AMD与各种单核苷酸多态性（SNP）之间的关联。其中许多SNP位于编码免疫分子的基因内。12-23
CX3CR1是CX3CL1/fractalkine趋化因子的特异性受体，在白细胞（例如淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞、质量细胞）、树突状细胞、，24,25脑小胶质细胞和星形胶质细胞。26-28眼部也有CX3CR1表达，29虹膜、睫状体、，30视网膜小胶质细胞、RPE和Müller细胞。31,32在一项功能研究中，两个CX3CR1 SNP导致CX3CL1结合位点数量减少，并降低了外周血单个核细胞的配体结合亲和力。33我们已经报道了这些SNP与AMD相关。22此外，我们已经证明，与正常眼睛的黄斑相比，AMD黄斑中CX3CR1转录物和蛋白质的数量有所减少。22,32然而，在年轻人中没有眼部异常的报道Cx3cr1型-缺陷小鼠。
除CX3CR1外，CCL2（MCP-1，一种CC趋化因子）被认为在AMD发病机制中起着稳态、免疫调节作用。34老年小鼠缺乏Ccl2公司或抄送2作为相应的受体，AMD具有许多基本特征，包括血栓形成、脂褐素和补体因子的RPE积聚以及脉络膜新生血管。8此外，如体外系统中报道的那样，CCL2可能发挥抗凋亡因子的作用。35,36
在本研究中，我们检验了以下假设：Cx3cr1型和Ccl2公司与现有的动物模型相比，在小鼠中诱导AMD的典型病理特征更加一致，并且发病年龄更早。我们发现小鼠的AMD特征具有高度特征性和可重复性。除了炎症分子外，我们还证明了内质网蛋白（ERp）在AMD中的潜在作用。
材料和方法
动物
Ccl2公司-不足和Cx3cr1型-缺陷小鼠（得自哈佛医学院儿童医院的Bao Lu和Barrett J.Rollins，37和国家过敏和传染病研究所/国家卫生研究院[NIAID/NIH]的菲利普·墨菲，38分别）被用作创始人一代（F0)并进行杂交以获得杂合动物（F1)的Ccl2公司和Cx3cr1型等位基因。杂合动物进行杂交以获得纯合子Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠（F2). 野生型（WT）小鼠为C57BL/6背景。该研究是根据ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明进行的，所有动物实验都是根据国家眼科研究所动物护理和使用委员会批准的方案进行的。
眼底摄影
在腹腔注射氯胺酮（1.4 mg/小鼠）和木聚嗪（0.12 mg/小鼠用于全身麻醉和局部施用1%托吡卡胺眼用溶液（德克萨斯州沃思堡Alcon公司）进行瞳孔扩张。
组织病理学
在人类捕杀老鼠后，采集了眼睛、大脑、肝脏、脾脏和肺部。组织在10%福尔马林中固定至少24小时。然后将所有组织包埋在甲基丙烯酸酯中。七十二只眼睛（其中60只眼睛Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠和12只WT小鼠）进行组织病理学检查。眼睛在瞳孔-视神经平面连续切片。每只眼睛被切成六个部分。其他器官常规切片。所有切片均用苏木精和伊红染色。如果发现眼部病变，则再切开6至12个部分。这些载玻片也用周期性酸性希夫（PAS）染色，以突出布鲁赫膜和小新生血管。这项关于人类眼部组织的研究得到了国家眼科研究所机构审查委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》中表达的原则进行。
透射电子显微镜
对4%戊二醛-甲醛固定组织进行电子显微镜检查。将固定的神经视网膜-RPE类组织嵌入环氧树脂中（LX-112；弗吉尼亚州伯灵顿LADD Research Industries）。用甲苯胺蓝染色的六微米厚切片在光学显微镜下进行检查。超薄切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，以便在显微镜下进行检查（JEM-100B；JEOL，日本东京）。三个年龄组（分别为12-20周、21-35周和36-48周）Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠和WT小鼠的两只眼睛用于透射电子显微镜研究。
免疫组织化学
摘除眼球后，将小鼠眼睛快速冷冻并嵌入OCT化合物中（Sakura Finetek，Inc.，Torrance，CA）。三只眼睛Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-如前所述，用小鼠和对照小鼠的两只眼睛进行免疫组化。39将4μm厚的冷冻切片固定在丙酮中7至10分钟，并用0.05 m的Tris缓冲盐水冲洗，pH 7.4。将载玻片浸入5%的正常血清中，以阻断次级抗体的潜在背景。因为小胶质细胞和补体系统激活被认为在视网膜管理中起作用，并与AMD的发展相关，12,40CD11b是小胶质细胞的标记物，CD46是补体因子C3b和C4b的配体以及补体调节蛋白，41进行了测量。对于小胶质细胞的检测，使用鼠抗鼠CD11b抗体（英国拉夫堡哈兰Sera实验室）作为主要抗体；为了检测CD46，使用兔抗鼠CD46（H-294:sc-9098；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cru z，CA）作为主要抗体。第二抗体分别是生物素标记的山羊抗大鼠或抗兔IgG（Vector Laboratories，Burlingame，CA）。为了检测ERp29，使用兔抗ERp29多克隆抗体（Abcam Inc.，Cambridge，MA）作为一级抗体，然后与二级抗体（生物素标记的山羊抗兔IgG；Vector Laboratories）孵育。切片用亲和素-生物素免疫过氧化物酶系统和3,3′-二氨基联苯胺作为底物处理，并用甲基绿进行复染。每个特定一级抗体的染色试验至少重复一次。免疫组织化学图像的曝光时间相匹配，以确保适当的控制。根据阳性细胞数量和染色细胞的颜色（黑色）强度对染色进行量化和分级。超过50%呈黑色的细胞被分级为具有强烈的免疫反应性；相比之下，灰白度小于20%的细胞被分级为免疫反应较差。
根据《联邦人体保护政策》（美国科学技术政策办公室）和《赫尔辛基宣言》中规定的政策和原则，对五个人类眼部切片（两个湿性AMD、两个干性AMD和一个正常眼）进行了免疫组化分析。去除福尔马林固定的人类眼部切片的石蜡。32,42如前所述，在人体切片上检测ERp29，并在每只眼睛中重复至少一次。
A2E提取和定量
将小鼠置于黑暗中超过12小时。从15、20和24周龄的WT和Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-老鼠。然后在昏暗的红光下的暗室中，在移除神经视网膜后解剖RPE细胞。43,44每组共有6只眼睛。重复每个分析。如前所述提取2-[2,6-二甲基-8-（2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基）-1E，3E，5E，7E-八四烯基]-1-（2-羟乙基）-4-[4-甲基-6（2,6,1-三甲基-1--环己烯-2-基）1E，3E-，5E、7E-六三烯基]-吡啶（A2E）。三使用高效液相色谱-电喷雾电离质谱法（ESI-MS；Thermo Electron，San Jose，CA）进行检测和定量。使用75%至96%的乙腈梯度，以1 mL/min的流速在40分钟内分离A2E。根据外部标准对A2E进行量化，并使用标准物确定A2E浓度。
蛋白质组学
将小鼠视网膜（包括RPE，但不包括脉络膜）溶解到提取缓冲液II中（加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad实验室）。样品制备，包括根据制造商协议进行的二维凝胶电泳图像分析（Proteomweaver；Definiens，Munich，Germany），凝胶内消化，然后在LC/MS系统上进行液相色谱（LC）-MS/MS（ProteomeX；ThermoElectron Corp.，San Jose，CA），根据Okamoto等人。45当来自同一蛋白质的至少两个肽的MS/MS光谱显示出最小默认Xcorr与程序设置的电荷值（对于Z= 1,1.50; 对于Z= 2, 2.00; 对于Z= 3, 2.50). 每组6只眼睛作为一个样本。三个独立实验（18Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-和18只WT小鼠）。在进行进一步分析之前，所有样品均一式两份，以确保大于90%的一致性。
Western Blot分析
用等体积的2×裂解缓冲液（RIPA；Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）均质小鼠视网膜，包括RPE。蛋白质在还原条件下通过SDS-PAGE分离，并转移到转移膜（Immobilon-P；Millipore，Bedford，MA）。用免疫检测试剂盒处理膜（WesternBreeze；Invitrogen，Carlsbad，CA）。简言之，首先用1:500稀释的抗ERp29抗体（Abcam，Cambridge，MA）培养膜，然后用1:2000稀释的碱性磷酸酶标记的二级抗体（Vector）培养膜。通过将膜浸没在显色底物中来显示信号。进行了两个独立的实验，在每次实验中，每种菌株的两只眼睛都被合并在一起。
检测Ccl2公司,Cx3cr1型、和应急响应29RT-PCR成绩单
来自小鼠视网膜/RPE的5微克RNA用于cDNA合成（上标II RNase H-逆转录酶；因维特罗根，纽约州格兰德岛）。进行实时PCR（Stratagene Mx3000实时PCR系统和Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix；加州拉霍拉市Stratagene]）。底漆Ccl2公司和Cx3cr1型由合成并作为基因表达检测试剂盒（RT2实时；Super-Array Bioscience Corp.，马里兰州弗雷德里克）。对于内部对照，使用引物5′-CCCAGACAATGAAGATCAA-3′和5′-CACATCTGGAAGGCAC-3′扩增β-actin。要确定应急响应29小鼠眼组织转录本，经验证和编目应急响应29和GAPDH公司根据制造商的说明使用基因表达试剂盒（TaqMan；Applied Biosystems，Foster City，CA）。比较级Ct吨该方法用于建立基因表达中折叠变化的相对定量（用户公告2；ABI Prism 7700序列检测系统，PE Applied Biosystems，Foster City，CA；1997）。折叠变化首先通过GAPDH公司基因操作引起的平均折叠变化再次归一化为WT小鼠的转录水平，并以图形表示。每组分析四个生物样本。每个样品至少分析两次。
结果
的系统表现Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-老鼠
在400只F2基因型后代中，有12只动物Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-，表明孟德尔分离异常（预计16分之一）。Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-与对照组相比，小鼠的体重正常。Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-当作为一个单独的谱系进行饲养时，小鼠的繁殖力较低，平均每窝四只幼崽，而WT对照组每窝八只。百分之二十的Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠出现了进行性斑片状皮肤色素脱失，主要发生在面部和上肢（数据未显示）。
中的眼睛特征Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-老鼠
103例眼科检查结果Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠除视网膜和脉络膜外均正常。76例患者进行了连续眼底镜检查Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠和27只年龄匹配的WT小鼠，从3周龄开始每3周一次。与所有年龄段都正常的WT小鼠不同()，均为6至9周龄Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠自发形成了以视网膜下异质性、圆形或圆顶状、软有序、黄色沉积物为特征的核果样病变(). 随着年龄的增长，这些病灶扩大或变平并融合(). 一些病变发展成脉络膜视网膜瘢痕和色素沉着萎缩区(). 相比之下，没有一次击倒Ccl2公司-/-或Cx3cr1型-/-老鼠在这么小的年龄就出现了视网膜损伤（Ross RJ等。IOVS公司2007;48:ARVO E-摘要2355）。8
眼底照片。(一)21周龄WT小鼠的视网膜正常。(B类)多发性视网膜下病变模拟血栓形成(箭头)在9周内Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-鼠标。(C类)视网膜下肿胀样病变扩大并融合(箭头)在同一个眼中Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠18周龄。(D类)疤痕和萎缩性视网膜病变(箭头)表明33周时该小鼠同一只眼睛的疾病进展。
中的组织学特征Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-视网膜
对60只眼睛进行了组织病理学检查Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠（20只8-15周龄小鼠、20只15-21周龄小鼠和20只21-60周龄小鼠）和12只WT小鼠（4只小于12周龄、4只12-24周龄和4只大于60周龄）。年龄匹配的WT小鼠的眼睛完全正常，没有核果形成、新生血管形成、光感受器变性和RPE萎缩(是一个具有代表性的图像）。全部Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-眼睛显示Bruch膜局灶性增厚。在一些眼睛中发现了Drusen（Bruch膜内透明突起的圆顶状区域）(); 大多数核糖粒较小（5-15μm）。局部RPE色素沉着和空泡化()通常可见光感受器外段紊乱和光感受者萎缩。这些局部变化可能在同一只眼睛或不同的眼睛中以不同的严重程度出现。仔细检查一系列连续切片，15%的患者发现脉络膜新生血管Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠眼睛；最早发病于12周龄。穿透Bruch膜并进入视网膜外层的一些脆弱的小脉络膜新生血管被增生的RPE细胞或萎缩的RPE区域包围().
眼睛显微照片。(一)6个月大的野生型小鼠视网膜、视网膜色素上皮、布鲁赫膜和脉络膜毛细血管正常。(B类)德鲁森矿床(箭头)在两个Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-老鼠。(C类)色素沉着不足和花边变性(箭头)RPE的Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-鼠标。(D类)脉络膜新生血管由小的未闭血管识别(箭头)从脉络膜穿透Bruch膜和RPE进入视网膜的两个Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-老鼠。神经节细胞层；INL，内核层；PR，光感受器内外节；CH，脉络膜。苏木精和伊红染色。比例尺，100μm。
的超微结构Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-视网膜
对不同年龄段的小鼠进行透射电镜检查。视网膜Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠RPE内黑素体减少，脂褐素增加（色素减退；)加厚的Bruch膜（500-1000 nm，而正常区域为240-350 nmCcl2公司-/-/Cx3cr1型-/-和WT小鼠；)具有非晶颗粒和非均匀材料沉积物()感光细胞的紊乱或萎缩(). 此外，在一些RPE细胞中发现紧密连接丢失和细胞膜折叠。这些超微结构的发现表明RPE和感光细胞的退化，并使人想起在人类AMD病例中观察到的超微结构变化。46,47此外，这些异常在年龄较大的小鼠中更为严重，表明衰老过程中有一个渐进的退化过程。相反，在年龄匹配的WT小鼠的眼睛中没有发现任何异常。
视网膜透射电子显微照片。(一)黑色素体显著减少，RPE细胞中存在脂褐素(箭头)的Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-鼠标。(B类)脂褐素(箭头)和脂滴(胰头)沉积物显示为另一个RPE中均匀的电子致密细胞质包裹体Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-. (C类)加厚的Bruch膜和非晶沉积物(箭头)在Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-鼠标。(D类)光感受器紊乱和萎缩(星号)和脂褐素(箭头)在RPE中观察到。(E类)正常RPE、Bruch膜和脉络膜在WT小鼠中显示。标尺，500 nm(一,B类,D类); 2微米(C类,E类).
A2E在Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-零售物价指数
脂褐素和荧光团A2E的积聚是人类AMD的早期病理特征。48稳定的A2E，一种从所有-反式视网膜和磷脂酰乙醇胺对RPE有毒。49使用HPLC/ESI-MS在RPE内测量A2E水平，发现15周龄及以上婴儿的A2E水平显著增加了三倍以上Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠（每眼3.4 pmol A2E）与年龄匹配的WT（约1 pmol；).
中A2E的定量Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠与正常对照组相比。色谱图表示440 nm处的吸光度。A2E峰在25.5分钟洗脱。Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-4个月时的RPE:A2E约3.4 pmol(黑色). 4个月时的正常RPE:A2E约1.1 pmol(灰色). 每一个代表一个200μL的六种RPE提取物注射液。
补体辅因子与小胶质细胞Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-视网膜
CD46（膜辅因子蛋白[MCP]）免疫反应性在整个RPE上检测到Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-但不是WT小鼠的顶端RPE()，表明补体（C3b和C4b）激活可能增强。CD46的表达模式在Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-和WT小鼠，这是一个预期的发现，因为CD46广泛分布在脉络膜的血管内皮细胞和成纤维细胞上。小胶质细胞（CD11b）的浸润+细胞）在视网膜病变中检测到Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠()但WT小鼠没有。CD46和CD11b在菌株内的免疫染色结果一致。
补体辅因子和小胶质细胞的眼显微照片。(一,C类)CD46型(箭头，黑色)在整个RPE和一个Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-WT小鼠视网膜中的小鼠与无小鼠的比较(胰头，RPE与棕色的颜料）。(B类,D类)小胶质细胞（CD11b+细胞，箭头)在视网膜病变中发现Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠；在WT老鼠中没有发现(胰头（RPE）。插图：两株RPE细胞的放大倍数较高。(一,B类：WT小鼠；C类,D类:Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-老鼠）。INL，内核层；ONL，外核层。比例尺，100μm。
ERp29在Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-视网膜
使用二维凝胶对视网膜裂解物进行蛋白质组学分析，发现四种蛋白质在Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-和WT对照小鼠(). 三个独立的实验得出了一致的蛋白质分布模式。LC/MS/MS成功鉴定的四个蛋白中有三个是ERp29前体、钙结合140k蛋白和RIKEN cDNA 2210010C04。ERp29是一种内质网蛋白，在蛋白质折叠中起作用，并与各种退行性疾病相关。50,51因此，我们研究了ERp29在WT和Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-老鼠。免疫染色、Western blotting和RT-PCR数据显示ERp29在视网膜中的表达显著降低Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠与WT对照组的比较().
WT和WT视网膜裂解物的蛋白质组学Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠的二维PAGE分析。(一)来自一个WT视网膜的典型二维PAGE图像。(B类)一张具有代表性的二维PAGE图像Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-视网膜。两组之间的四个银染蛋白斑点被确定为差异表达，如下所示圈子来自这四个点的三种蛋白质通过LC/MS/MS成功鉴定。重复分析揭示了每组的一致蛋白质模式。这三种蛋白分别是（1）钙结合蛋白140k、（2）ERp29前体和（3）RIKEN cDNA 2210010C04。
视网膜中ERp29的表达。(一)小鼠视网膜切片的显微照片显示ERp29反应性较低(黑色，箭头)以及视网膜病变的存在(星号)在中Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠比WT小鼠（亲和素-生物素免疫过氧化物酶染色）。比例尺，100μm。(B类)视网膜裂解物的Western blotting显示ERp29在Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-鼠标比WT鼠标。(C类)定量RT-PCR检测眼内ERp29 mRNA表达Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠比WT小鼠。
ERp29在人AMD切片中的低表达
免疫组织化学染色发现，与正常人黄斑相比，患有AMD的人黄斑的神经视网膜和RPE细胞中ERp29蛋白的表达降低。有代表性的图像如所示.
人眼ERp29的显微照片。(一)ERp29阳性反应性(箭头，黑色)在正常视网膜的光感受器层的内段、外丛状和内核层的交界处、神经节细胞层和RPE细胞中检测到。(B类)免疫反应性(箭头)与正常眼相比，AMD眼的视网膜外层和RPE细胞（尤其是病变的视网膜外层）含量较低。NFL，神经纤维层；神经节细胞层；IPL，内丛状层；INL，内核层；OPL，外丛状层；ONL，外核层；感光细胞的内外节；C、 脉络膜；S、 巩膜。亲和素-生物素免疫过氧化物酶染色。比例尺，100μm。
讨论
本研究展示了一种通过敲除趋化因子（Ccl2）和趋化因子受体而产生的小鼠菌株(Cx3cr1型)显示了人类AMD的病理特征。Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-研究表明，小鼠自发发生视网膜变性病变，包括脉络膜新生血管。此外，RPE中A2E的升高以及补体调节蛋白（CD46）和小胶质细胞的增强表达也见于Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-老鼠。这些发现与人类AMD眼睛相一致，其中A2E在RPE细胞中积聚49CD46定位于核糖核酸酶附近和上覆核糖核酸酶的RPE细胞上。52这些眼部表现在Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠的免疫系统、特异性趋化因子和配体在导致损伤的发病机制中发挥着重要作用。由于这些小鼠表现出的许多AMD样特征具有较高的外显率和早期表现，这种表型使模型成为研究AMD遗传和病理机制的替代品，并可能适当地帮助评估这种致盲性疾病的各种治疗方法。
研究人员将免疫系统和炎症过程与人类AMD的病理生理学联系起来。53,54此外，在正常情况下，各种内外因素刺激的黄斑沉积的生成与趋化因子吸引到部位的炎性细胞清除这些沉积之间实现了动态平衡。据推测，缺乏足够的巨噬细胞募集参与AMD的发展。8,22我们发现CX3CR1系列AMD患者黄斑区的转录物比黄斑周围视网膜的转录物多。相比之下CX3CR1系列在正常眼受试者的黄斑和黄斑周围检测到转录表达。22我们还报告了在注射视网膜下基底膜制剂（Matrigel；BD Biosciences，San Jose，CA）后，视网膜退化和脉络膜新生血管加剧的情况Ccl2公司-缺陷小鼠。55许多趋化因子，包括CCL2，对神经元凋亡具有保护作用。36,56,57在帕金森病毒性模型和遗传性运动神经元病模型中，Cx3cr1型-/-小鼠表现出比正常情况更广泛的神经元细胞损失Cx3cr1型+/+室友控制。58
活化的小胶质细胞与AMD相关。40,59我们在视网膜病变中观察到小胶质细胞Ccl2/Cx3cr1型-缺陷小鼠而非WT小鼠，表明视网膜小胶质细胞的激活可能导致邻近光感受器死亡。60,61CD46是一种膜结合的补体调节因子，可促进活化补体成分C3b和C4b的失活。62与衰老患者RPE中CD46的发现类似Ccl2、Ccr2，或草皮1(铜、锌超氧化物歧化酶)敲除小鼠，8,9我们的Ccl2/Cx3cr1型缺陷小鼠也证明眼睛中存在这种补体调节蛋白。这些数据与患有AMD的人眼的数据类似。52
ERp29蛋白和转录物在眼组织中的表达显著降低Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠比WT对照组大。免疫组织化学还显示，与对照组相比，人类AMD黄斑区ERp29降低。ERp29的表达主要通过XBP-1/IRE-1途径控制。63IRE-1在炎症状态下表达不同，64这可能是该趋化因子缺乏小鼠ERp29表达较低的原因。众所周知，神经退行性疾病涉及内质网应激引起的细胞死亡，因此被视为内质网胁迫相关疾病或构象疾病。65-67
内质网是脂质合成、蛋白质折叠和蛋白质成熟的中心细胞器。所有新合成的膜和分泌蛋白都在内质网中折叠和处理。细胞需要正确折叠和处理的膜蛋白才能发挥功能，当蛋白质展开或错误折叠时，它们往往会形成对细胞有害的有毒聚集物（例如RPE中的脂褐素）。ER故障的情况称为ER应力。内质网应激是由未折叠蛋白聚集体的积累引起的，称为未折叠蛋白反应。在内质网应激中，转录因子被激活以诱导内质网受体伴侣的表达，以处理积累的蛋白质聚集体。ERp29是一种ER-受体伴侣，通过使未折叠的蛋白质保持折叠竞争状态来防止蛋白质聚集，并作为ER-特异性蛋白质降解装置的一个组成部分来消除变性蛋白质。50,63,68,69伴随蛋白减少可能导致错误折叠的蛋白质积累。此外，ERp29作为一种护卫分子，将蛋白质带到细胞中的不同位置。63AMD是一种堆积病。在我们的模型中，脂褐素的大量积累可能是由于ERp29不能护送所致。ER窘迫和ERp29蛋白在AMD发病机制中的作用已有报道。70-73此外，视网膜ERp29水平随着年龄的增长而降低。51在最近对人类AMD眼睛进行的蛋白质组分析中，Ethen等人。73报告AMD发病期黄斑ERp29下降33%。我们正在研究ERp29在该小鼠株表型发育中的可能机制作用。
在另一项最近的研究中，Azfer等人。74报告了内质网应激相关基因簇的激活，包括应急响应29，在心肌恶化和心脏功能障碍的发展过程中Ccl2公司转基因小鼠，在早期保护心肌细胞免受应激的不利影响。然而，由于慢性炎症，这些努力失败了，细胞死亡，导致死亡。在我们的模型中，CCL2和CX3CR1水平较低，这可能导致内质网应激蛋白生成不足和内质网功能障碍。在内质网受损的情况下，未折叠蛋白积聚在内质网腔中，这是一个负责激活未折叠蛋白反应的信号。
总之，Ccl2公司-/-/Cx3cr1型-/-小鼠出现早发性和进行性视网膜退行性疾病，具有与人类AMD相似的广谱病理特征。该表型具有高度渗透性、可靠性和重现性。蛋白质组学、免疫组织化学、Western blot和RT-PCR的数据表明ERp29蛋白参与了该模型，这一发现为AMD发病机制提供了新的见解。本研究中的观察结果表明，某些趋化因子和ER蛋白在AMD的发展中具有重要作用。
致谢
作者感谢哈佛医学院儿童医院的Bao Lu和Barrett J.Rollins以及NIAID/NIH的Philip MurphyCcl2公司-/-和Cx3cr1型-/-创始人一代。他们还感谢P.Bhosale在高效液相色谱分析方面的帮助，感谢美国国家眼科研究所的Rachel Caspi，感谢哈佛医学院儿童医院的Craig Gerard，感谢他们进行了批判性的科学讨论。
由美国国立卫生研究院国家眼科研究所校内研究计划资助。
脚注
披露：J·陀，无；C.M.博亚诺夫斯基，无；周先生，无；D.沈，无；R.J.罗斯，无；K.I.罗森博格，无；D.J.卡梅隆，无；C.阴，无；J.A.科瓦拉克，无；Z.庄，无；K·张，无；C.-C.陈，无
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