Kir4.1在脊髓星形胶质细胞中的差异分布表明K的区域差异⁺平衡

摘要

简介

哺乳动物脑细胞外钾的典型值[K⁺]_o（o），范围为2.6至3.8 mM(Sykova 1983年). 然而，这些值因K而波动⁺在神经元活动期间释放到细胞外空间。因为细胞外间隙体积小，[K的基线水平低⁺]_o（o）甚至少量K的释放⁺会导致细胞外钾的急剧增加⁺浓度(范·哈雷维德和马尔霍特拉1967). 已经证明，在大鼠脊髓中，单一刺激可以增加细胞外钾⁺高达5 mM(沃尔顿和切斯勒1988). [K持续增长⁺]_o（o）高于基线水平会导致过度兴奋并影响突触传递的完整性(沃尔兹2000). 迫切需要的是，有几种机制可以帮助细胞外钾⁺清除，包括简单的扩散和能量依赖机制，如神经胶质和神经元Na⁺-K（K）⁺水泵(Amedee等人，1997年;Kofuji和Newman 2004). 此外，K⁺-主要存在于胶质细胞中的选择性通道有助于K⁺移动K的间隙⁺当细胞外K⁺浓度增加。钾空间缓冲被认为是重新分配钾⁺通过缝隙连接将其释放到低[K⁺]_o（o）钾空间缓冲是钾的一种吸引机制⁺清除，因为它是节能的，并在细胞内空间隔离钾。然而，K的能量依赖机制⁺清除也与钾吸收有关(D’Ambrosio等人，2002年;MacVicar等人，2002年;Ransom等人，1995年;熊与斯特林格1999). 这三种机制都可能在一定程度上促进K⁺神经元活动后清除。

胶质细胞膜被赋予K⁺非常适合K任务的通道⁺间隙。Kir4.1，向内整流K⁺频道，已经获得了很多关注。该通道在整个中枢神经系统的胶质细胞中表达(Kofuji等人，2000年;Martin-Caraballo和Dryer 2002;Olsen等人，2006年;Poopalasundaram等人，2000年). Kir4.1通道在静止状态下具有较高的开放概率（Ransom和Sontheimer，1994年），因此导致高K⁺星形胶质细胞的通透性和静息膜电位为负。重要的是，通道电导随着细胞外钾的增加而增加⁺(Hagiwara和Takahashi 1974年;纽曼1993;Sakmann和Trube 1984)使Kir4.1非常适合K⁺间隙。细胞外钾环境中通道的重要性⁺在Kir4.1基因失活的动物中，已明确证明了对成熟星形胶质细胞标志性超极化静息膜电位的调节及其作用。在Kir4.1敲除动物中，Muller细胞(Kofuji等人，2000年)，腹侧呼吸组的星形胶质细胞(Neusch等人，2006年)和脊髓星形胶质细胞(Olsen等人，2006年)缺乏向内矫正K⁺电流。此外，K⁺摄取或清除能力降低，静息膜电位去极化，输入电阻显著增加。

在脊髓中，[K的动力学⁺]_o（o）都有详细的记录(Frankenhauser和Hodgkin 1956年;Jendelova和Sykova 1991年;沃尔顿和切斯勒1988). 重要的是，K的地区差异显著⁺神经元活动后出现蓄积(沃尔顿和切斯勒1988). 特别是，背角的神经元活动导致[K⁺]_o（o）而不是腹角。我们在此证明Kir4.1在腹角和K⁺刺激会产生大大增强的摄取电流。因此，Kir4.1表达的变化似乎转化为细胞外钾的显著差异⁺平衡。

方法

结果

我们开始研究异质性Kir4.1表达与变量K⁺脊髓清除率。我们通过检测大鼠脊髓中Kir4.1的表达来开始这些研究。从多聚甲醛灌注幼年大鼠（P12–P20）的颈部、胸部和腰部切片中获得的切片用Kir4.1和神经胶质特异性细胞标记物进行免疫染色。灰质中的Kir4.1免疫反应显示出明显的标记模式，在腹角表达最高，在背角浅层（Rexed Lamina I/II，图1A类). 为了更好地可视化Kir4.1的标记模式，灰质被用黑色略显轮廓。黑色箭头表示腹角，这显示出最强烈的Kir4.1标记。相反，白色箭头表示背角的浅层，很少显示Kir4.1标记。我们在整个脊髓中观察到这种标记模式。腹角图像显示Kir4.1免疫反应与星形细胞特异性膜标记物谷氨酸转运体1（GLT-1，图1B类)但不是神经标记物Neu-N(图1，C类和D类)Map2或突触素（数据未显示）说明胶质特异性。脊髓胶质细胞的这种特异性已在以前得到证实(Kaiser等人，2006年; Neusch等人，2001年；Olsen等人，2006年). 高倍图像显示，在神经元细胞体周围和轴突（箭头、，图1G公司)以及沿着毛细血管（未显示）。这些数据表明，Kir4.1在脊髓星形胶质细胞中具有明显的异质性，在腹角中Kir4.1的表达最高。为了量化脊髓横切面中Kir4.1的含量，我们研究了21张低倍图像，在这些图像中我们能够在同一张图像中看到两个角(图1E类). 我们重点关注四个特定区域：雷克斯的九层（区域1）、雷克斯的七层（区域2）、雷克斯的五层（区域3）和雷克斯的一层/二层（区域4）。来自21张图像的平均数据表明，Rexed’s Laminae 1/II和所检查脊髓的所有其他区域之间Kir4.1的表达存在显著差异(P（P）<0.001，Tukey-Kramer多重比较测试，图1F类). Kir 4.1在区域3或Rexed’s Laminae V中的表达也与Rexed‘s Laminate 9显著不同(n个= 21,P（P）< 0.001). 这些数据表明Kir4.1在新生大鼠脊髓中显示出一种免疫反应梯度。

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图1

免疫组织化学显示，Kir4.1染色在腹角最高，而在背角顶端免疫反应性很低。A类：来自脊髓不同区域的低放大率图像显示，腹角的Kir4.1免疫反应性最高，脊髓背角的染色很少。灰质以黑色略显轮廓，便于观察。黑色箭头表示腹角，这是对Kir4.1标记最强烈的脊髓区域。白色箭头表示背角的浅层，显示Kir4.1免疫反应性很小。B类：来自腹角的图像显示Kir 4.1与GLT-1大量重叠，如合并图像中的黄色所示。C类：Kir4.1和Neu-N标记在腹角明显。D类：腹角的高倍图像显示Kir4.1染色是神经元胞体周围最强烈的染色。（比例尺A中，200μ米，B和C、，100μ米，G、，50μm） ●●●●。E类：此图像中的圆圈区域对应于Rexed的第九层（区域1）、Rexes的第七层（区域2）、Reexed的第五层（区域3）和Rexed’s的第一层/第二层（区域4）；脊髓横切面低倍图像中用于相对定量Kir4.1表达的区域。F类：对脊髓横切面Kir4.1表达的定量分析表明，在Rexed’s层片IV、VII、V、I/II中Kir4.1的表达存在显著差异。平均数据表明，Rexed的椎板1/II和所检查脊髓的所有其他区域之间存在显著差异(P（P）<0.001，Tukey-Kramer多重比较测试，n个=21）。Kir 4.1在区域3或Rexed’s Laminae V中的表达也与Rexed‘s Laminate 9显著不同(n个= 21,P（P）< 0.001).

接下来，我们通过Western blot分析检测了Kir4.1在背角和腹角的表达。使用来自厚（1–2 mm）脊髓切片的腹角或背角的灰质组织制备裂解物进行Western印迹。将等量的蛋白质加载到凝胶上，并用Kir4.1探测两个区域的印迹。我们能够在约50和200 kD处检测到与Kir4.1的单体和四聚体相对应的谱带(图2). 与免疫组化结果一致，在两个P16大鼠的背侧通道中检测到较少的Kir4.1免疫反应。用两个星形细胞标记物GLT-1和GFAP重复相同的印迹表明，背侧和腹侧的星形细胞数量或星形细胞膜/总蛋白毫克的百分比相同；确实，GLT-1在背侧区域的表达略高。因此，Kir4.1表达的差异不能归因于这两个区域星形胶质细胞数量的总体差异。为了证明装载了相同浓度的蛋白质，用肌动蛋白对该印迹进行了探测。不表达Kir4.1的人类胚胎肾（HEK）细胞作为阴性对照。我们假设~100 kD处的带为非特异性结合，因为它也存在于HEK细胞通道中。

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图2

Western blot显示Kir4.1在腹角的表达显著高于背角。该印迹包含两种不同动物的背部和腹部灰质裂解物，用于检测Kir4.1。在约200 kD处检测到一条与四聚体相对应的显著带，在约50 kD处（单体）检测到一个带。为了进行比较和评估星形胶质细胞总蛋白，用GLT-1和GFAP抗体对该印迹进行了重新免疫。对于负荷控制，用肌动蛋白探测该印迹。我们假设约100 kD处的带为非特异性结合，因为它也存在于人类胚胎肾（HEK）细胞系中，该细胞系不表达Kir4.1。

为了进一步将脊髓切片中Kir4.1蛋白的表达与可测量电流联系起来，我们接下来在脊髓切片上进行了全细胞、斑贴灯记录。图3显示了从腹角中记录的星形胶质细胞相对于背角顶端的星形胶质细胞获得的代表性记录(图3A类). Kir电流通过应用100μM Ba公司²⁺，一种选择性抑制Kir4.1通道介导的电流的浓度。这些记录证实了Ba的大小有两倍以上的差异²⁺-灵敏基尔电流。来自这两个区域的全细胞电流保持相似的分布，即超极化电位下的失活、弱整流和100倍的完全抑制μM Ba公司²⁺对−140-mV阶跃响应的分析表明，Ba和Ba两个区域的Kir振幅存在显著差异²⁺-来自背角的敏感电流为−205.3±44.2 pA(n个=21），来自腹部的电流测量值为−453.8±81.4 pA(n个= 25,P（P）= 0.0110;图3B类). 有人可能会认为，腹角电流较大的细胞耦合更广泛。然而，与先前报道的数据一致，电流振幅不依赖于细胞耦合(学校等2006年). 在腹角充满生物细胞素的六个细胞中，只有一个细胞表现出显著的细胞耦合。在背角，生物细胞素标记显示11个细胞中有8个细胞表现出广泛的细胞耦合。生物细胞填充细胞的典型示例如所示图3C类.

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图3

急性脊髓切片的全细胞斑贴灯记录显示，脊髓两个区域的Kir电流振幅存在显著差异。A类：典型电压阶跃响应（协议如所示插入)来自腹角和背角星形胶质细胞的研究表明，这两个区域的Kir电流具有相似的特性（在超极化电位下失活，100个区域完全失活μ百万巴²⁺); 然而，巴²⁺-腹角的敏感Kir电流大约大2倍。B类：平均数据显示Ba存在显著差异²⁺-腹角和背角星形胶质细胞的敏感Kir电流（−140 mV）（−453.8±81.4，pAn个=25和−205.3±44.2 pA，n个= 21,P（P）分别为0.0110）。C类：显示了脊髓腹侧和背侧区域充满细胞的典型示例。

为了检验这些差异是否与内向矫正钾有关⁺电流，我们接下来检查了这些相同细胞中的延迟整流（Ka）和快速失活（Kd）电流。与Kir数据相反，背角和腹角的Ka或Kd没有统计差异(图4).面板A说明了K的示例⁺通道记录来自两个单元，每个区域一个。所选择的特定实施例在大小上是相同的（41pF），并且是从相同的动物获得的。背角Kir电流明显小于腹侧Kir电流(图4A类,顶部). 在这些细胞中，背侧细胞的Ka电流大于腹角细胞(图4A类,中间的)而Kd电流的大小与腹侧区相似(图4A类,底部). 然而，在检查了来自两个不同区域的>30个细胞后，平均数据表明，这两个区域的Ka或Kd电流幅度没有差异。+100 mV时测得的峰值Ka电流为2132.3±225.4 pA，n个=33，位于腹角，2358.3±199.7 pA，n个=31，在背角(图4B类). 虽然在+100 mV下测得的峰值Kd电流为1714.3±179.7 pA，n个=33，位于腹角，1504.6±161.5 pA，n个=31，在背角(图4C类). 用于隔离单个电流的协议如所示图4D类.

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图4

背角和腹角的快速失活（Ka）和延迟整流（Kd）钾电流无统计学差异。A类：来自脊髓腹侧和背侧区域星形胶质细胞的Kir、Ka和Kd电流的典型示例。背角的Kir电流始终较小，而Ka电流(中间的)和Kd电流(底部)在这两个区域中是可变的。B类和C类：平均数据显示Ka（2132.3±225.4 pA，腹侧，n个=33和2358.3±199.7 pA，背部，n个=31）或Kd（1714.3±179.7 pA，腹侧，n个=33和1504.6±161.5 pA，背部，n个=31）两个区域的电流。D类：用于隔离Kir、Ka和Kd电流的协议。用于激活Ka电流的协议同时激活Ka和Kd电流，因此使用逐点减法（Ka−Kd）来隔离Ka电流。

接下来，我们评估了来自这两个区域的星形胶质细胞的其他一些电生理特性。先前的研究表明Kir通道的表达与细胞静息膜电位有关(V（V）_米); Kir通道表达越高V（V）_米(Bringmann等人，1999年;Ransom和Sontheimer，1995年;Sontheimer等人，1989年;Williamson等人，1997年). 与这些观察结果相一致，平均数据表明，相对于腹角的星形胶质细胞，背角星形胶质细胞的去极化程度稍高（-67.4±2.4，n个=33和−76.8±1.1，n个= 34,P（P）= 0.0008,图5A类). 此外，输入电阻(图5B类)来自背角的细胞数量显著增加（760.5±171.9，n个=18）比来自腹角的星形胶质细胞（279.1±60.9，n个＝18，P（P）= 0.0153). Kir通道在静止状态下具有较高的开放概率，因此有助于星形胶质细胞中相对较低的输入阻抗。在背角星形胶质细胞中观察到的较高输入阻抗可能是这些星形胶质细胞Kir通道较少的直接结果。

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图5

背角和腹角的星形胶质细胞表现出其他电生理差异。A类：背角静息膜电位显著去极化（-67.4±2.4 mV，n个=33），相对于腹角星形胶质细胞（−76.8±1.1 mV，n个= 34,P（P）= 0.0008).B类：与来自腹角的星形细胞相比，背角星形细胞的输入电阻在背角星形胶质细胞中显著升高（760.5±171.9 mΩ，n个=18和279.1±60.9 mΩ，n个= 18,P（P）分别为0.0153）。

人们预计Kir通道表达的减少会导致细胞外K的变化⁺动力学和K的差异⁺吸收电流。模拟K的焦距增加⁺如神经元活动后所见，我们施加短暂的压力（1、2和3 s）130 mM K⁺脉冲使用Picospritzer，注意放置K⁺-相同距离的填充电极（~25μm） 在同一焦平面上从感兴趣的细胞中取出，并使用直径相似的吸管尖端。我们故意将吹气吸管放在非常近的地方，并用饱和浓度的K进行脉冲⁺以使目标细胞中的响应最大化。全细胞记录用于测量K⁺-−80 mV电压钳下的感应内向电流。典型示例如所示图6A类平均数据标准化为单元格大小，如所示图6B。响应K的向内电流⁺与背角相比，腹角的喘息幅度几乎是背角的两倍。在这两个地区，Ba几乎完全消除了这种反应²⁺（未显示）。作为量化该数据的一种方法，我们整合了Ba前后曲线下的面积²⁺应用程序。减去的面积表示Ba²⁺-灵敏电荷流，即K⁺脉冲期间离子通过Kir通道流动。然后将这些数据归一化为整个电池的电容，以获得特定的K⁺流量/单位膜。以这种方式检测的10个腹角和5个背角细胞的平均数据如图所示图6B类这些数据表明，平均值等于K⁺挑战导致K值降低60%⁺与腹角相比，背角的离子内流（31.9±6.3 pC/pF，n个=10和11.9±2.3n个分别=5 pC/pF，P（P）= 0.049). 综上所述，这些数据表明星形细胞Kir4.1表达的区域差异导致对细胞外[K⁺].

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图6

与清除钾的能力下降一致，背角星形胶质细胞在暴露于钾浓度升高时表现出较小的反应。A类：电压钳制（−80 mV）腹角和背角星形胶质细胞在暴露于高外部钾溶液（130 mM）2s吹气时观察到的典型反应。B类：100后，通过从迹线中减去对照迹线来分析平均数据μ百万巴²⁺并对减去的面积进行积分。来自每个区域的几个细胞的数据显示，背角细胞表现出比腹角细胞小两倍以上的反应。总Ba²⁺-腹角单位膜的敏感电荷为31.91±6.3 pC/pF，n个=10，而背角的测量值为11.9±2.3 pC/pF，n个= 5.

讨论

细胞外钾缓冲⁺被广泛认为是胶质细胞执行的一项重要的稳态任务。大量证据表明K⁺神经胶质细胞通过向内整流钾而摄取⁺通道（Kir）和最近的基因敲除研究(Kofuji等人，2000年;Neusch等人，2006年;Olsen等人，2006年)表明Kir 4.1对K很重要⁺平衡。静止时打开概率高(P（P）_o（o）~ 0.9, (Ransom和Sontheimer，1995年)随着细胞外钾的增加，电导增加⁺使Kir4.1成为K的理想途径⁺间隙。在本研究中，我们证明来自脊髓两个不同区域的星形胶质细胞在Kir4.1通道表达方面存在差异，这两个区域在功能上有明显区别。我们的免疫组织化学研究表明，Kir4.1在腹角腹侧缘（Rexed Laminae 9）表达最高，而在脊髓浅层（Rexex Laminate I/II）表达降低。Western blots证实我们的免疫组化结果显示Kir4.1在脊髓腹角的表达增强。重要的是，我们对急性脊髓切片中星形胶质细胞的记录证实，这种差异反映在功能上，即Ba的量值相差两倍以上²⁺-灵敏的向内整流电流。这一发现意义重大，因为它与之前观察到的细胞外K⁺脊髓这些区域的内稳态。具体地说，在新生大鼠中，对背根的单一电刺激引起[K+]的显著增加_o（o）在背角，而相同的刺激不能产生明显的[K⁺]_o（o）腹角的变化(沃尔顿和切斯勒1988). 此外，在背角，一个单一的顺向刺激引起[K⁺]_o（o）增加4-5 mM。此外，基线细胞外K⁺这个结构中的级别不同(Svoboda等人，1988年). 我们的数据表明，这种现象可能直接由背角星形胶质细胞中Kir4.1的表达减少来解释，我们实验表明，这些星形胶质细胞吸收钾的能力显著降低⁺和前面的研究一样，我们的实验是在新生动物中进行的，因此，在成年动物中是否会观察到Kir4.1通道表达的类似差异，还有待证明。重要的是，上述发现并非由于星形胶质细胞数量的总体差异，因为GFAP的表达在这些区域之间没有差异。Western blot上GLT-1染色检测到的星形细胞膜在脊髓背角略高。此外，Kir电流幅度的这种差异并不是由于K的总体降低⁺背角星形胶质细胞通道作为延迟整流和快速失活K的相对表达⁺这两个区域的星形胶质细胞的通道是相同的。

K中的这些差异⁺吸收可能反映出对钾的不同需求⁺脊髓这两个区域的内稳态，因此Kir4.1的表达可能只是调节到对K的相对需求⁺间隙。腹角主要包含高频放电的运动通路。因此K⁺运动神经元会大量释放。另一方面，背角主要包含感觉通路，其中许多通路包含传导缓慢的无髓纤维，放电速度相对较慢。值得注意的是，Kir4.1并不是脊髓中唯一表现出区域差异表达的蛋白质。水通道蛋白1(Oshio等人，2006年)，水通道蛋白4(Nesic等人，2006年;Vitellaro-Zuccarello等人，2005年)GLT-1和GLAST(Rothstein等人，1994年)每个都有差异表达，在背角的浅层表现出较高的表达水平。

除了在K中的作用⁺清除，Kir4.1已被证明有助于大多数星形胶质细胞典型的负静息膜电位。外源性Ba阻断Kir4.1的星形胶质细胞²⁺或来自Kir4.1敲除动物的星形胶质细胞，相对于正常星形胶质细胞(Kofuji等人，2000年;Svoboda等人，1988年). 负RMP对于星形胶质细胞中的许多转运系统至关重要，包括葡萄糖和神经递质转运。静息膜电位越负，钠含量越高⁺作为驱动这些系统的能源的膜的梯度。事实上，最近的研究表明，当细胞被Kir4.1的siRNA处理时，培养的皮层星形胶质细胞中的谷氨酸摄取减少了50%以上(Kucheryavykh等人，2007年). 在我们的研究中，相对于腹角星形细胞，背角星形细胞轻微但显著地去极化。因此，除非细胞表现出对转运体表达的补偿性上调，否则谷氨酸摄取将减少。

最近，有研究表明，在ALS小鼠模型中，腹角星形胶质细胞中Kir4.1的逐渐丢失与疾病进展平行(Kaiser等人，2006年). 此外，当运动神经元暴露于适度升高的K⁺（10 mM）持续120 h，出现明显的神经元细胞死亡。Kir4.1在该区域的高表达表明，腹角神经元可能对细胞外K升高特别敏感⁺，并且有效的清除机制对于神经元细胞存活是必要的，这再次解释了观察到的Kir4.1表达的增加。相反，Kir4.1在脊髓负责疼痛感知的背角区域的表达减少可能具有功能意义。在这里，对于K来说，使用一个效率较低的系统可能确实是有益的⁺间隙，允许K⁺在疼痛或有害刺激时增加。增加的K⁺由于该区域“疼痛”神经元活动增加而产生的负荷可能通过使该区域神经元轻微去极化来放大信号，因此，增加其放电频率与伤害性刺激成正比。钾的长期细微增加⁺有报道表明钾含量降低⁺背角的调节。在最近的一项研究中，将其应用于大鼠的后爪后，发现[K⁺]_o（o）持续2小时以上的下背角，比基线高出≤3 mM(Svoboda等人，1988年). 这种升高是由于损伤引起的自持神经元放电。这个[K⁺]_o（o）增加程度随伤害性刺激的强度而分级。显然，这些实验表明，脊髓可能确实是一个高度专业化的结构，涉及神经元传递和钾的生理相关性⁺在这方面，体内平衡需要进一步检查。

致谢

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