美国国家科学院院刊。1997年4月1日；94(7): 3195–3199.
人肿瘤坏死因子α启动子多态性对转录激活的影响
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安东尼·威尔逊
†谢菲尔德大学分子医学科，英国谢菲尔德S10 2JF皇家哈拉姆郡医院；和‡加利福尼亚州斯坦福大学微生物、免疫学和医学系，邮编94305
朱利安·西蒙斯
†谢菲尔德大学分子医学科，英国谢菲尔德S10 2JF皇家哈拉姆郡医院；和‡加利福尼亚州斯坦福大学微生物、免疫学和医学系，邮编94305
塔拉·L·麦克道尔
†谢菲尔德大学分子医学科，英国谢菲尔德S10 2JF皇家哈拉姆郡医院；和‡加利福尼亚州斯坦福大学微生物、免疫学和医学系，邮编94305
休·O·麦克德维特
†谢菲尔德大学分子医学科，英国谢菲尔德S10 2JF皇家哈勒姆郡医院；和‡加利福尼亚州斯坦福大学微生物、免疫学和医学系，邮编94305
戈登·达夫
†谢菲尔德大学分子医学科，英国谢菲尔德S10 2JF皇家哈拉姆郡医院；和‡加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学微生物学、免疫学和医学系94305
†谢菲尔德大学分子医学科，英国谢菲尔德S10 2JF皇家哈拉姆郡医院；和‡加利福尼亚州斯坦福大学微生物、免疫学和医学系，邮编94305
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摘要
肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种有效的免疫调节剂和促炎细胞因子，与自身免疫和感染性疾病的发病机制有关。例如，血浆TNFα水平与疟疾和利什曼病的严重程度和死亡率呈正相关。我们之前描述了TNFα启动子中−308的多态性，并表明罕见的等位基因TNF2位于扩展单倍型HLA-A1-B8-DR3-DQ2上，这与自身免疫和高TNFα生成有关。TNF2的纯合性使脑疟疾的死亡风险增加了7倍。在这里，我们证明，在两个等位基因TNF启动子控制下的报告基因中，TNF2是比人类B细胞系中常见等位基因（TNF1）更强的转录激活物。使用DNase I和B细胞核提取物进行的足迹分析表明，在−308和邻近保护区产生了超敏位点。两个等位基因之间的DNA结合蛋白亲和力没有差异。这些结果表明，这种多态性对TNFα基因调控有直接影响，可能是TNF2与高TNFα表型和疟疾和利什曼病等感染中更严重疾病相关的原因。
关键词：遗传学、主要组织相容性复合体、细胞因子、基因调控、自身免疫性疾病
肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种有效的细胞因子，具有多种促炎活性(1). 它通常由单核细胞/巨噬细胞产生，尽管其他类型的细胞，如T细胞和B细胞也产生大量。TNFA基因位于主要组织相容性复合体（MHC）的III类区域，约为HLA-B位点的250千碱基着丝粒和HLA-DR的850千碱基端粒。鉴于其生物学效应和基因位置，推测该基因座的多态性可能有助于MHC与自身免疫性和感染性疾病的关联(2)尤其是那些TNFα参与启动或维持炎症反应的，如类风湿性关节炎(三)或血液水平升高预示着较差的结果，如疟疾(4). 特定MHC单倍型与不同TNFα表型的关联支持了这一点：DR3和DR4单倍型产生更高水平的TNFα(5,6)而DR2单倍型与低产量相关(5,7)这表明调节TNFA基因的区域内可能存在功能多态性。
对小鼠的研究表明TNF基因座与疾病表型有关。启动子区出现了多态性(8)、第一内含子和3′非翻译区(9)TNFA在不同品系小鼠中的含量。此外，巨噬细胞产生TNFα的差异已被证明在菌株之间存在差异(10). 其中一些多态性与TNFα的产生以及几种疾病的易感性或严重性相关。（NZB×NZW）F1小鼠发生严重的自身免疫性疾病，与人类的系统性红斑狼疮（SLE）非常相似。TNFA基因的限制性片段长度多态性与TNFα的低产生和狼疮性肾炎的发生相关(11)重组TNFα替代治疗可延迟肾炎的发病，提高生存率(12). TNFα多态性与小鼠TNFαmRNA产生及发育阻力的相关性弓形虫BALB/c株也被证实患有脑炎(13). 一项关于Th2细胞介导的局部炎症反应的研究表明，这种现象的TNF依赖性与H2D单倍型和相应的TNFα生成表型有关，这表明，至少在小鼠中，不同等位基因的差异表达TNFα可能会影响免疫反应的性质(14).
TNF具有强大的生物学作用，其产生的控制受到严格调控，发生在转录和转录后水平(15). 在脂多糖刺激巨噬细胞后，TNF转录增加3倍，TNF mRNA增加50至100倍，蛋白质分泌增加约10000倍(16). 淋巴毒素α基因3′端和TNFA 5′端之间的1100 bp DNA片段中的序列已被证明是转录控制的核心(17,18).
最近，我们和其他人描述了人类TNFA启动子−308的两个多态性(19)和−238(20)两者都涉及腺苷在罕见等位基因中取代鸟嘌呤。我们表明，−308的罕见等位基因（TNF2）是扩展MHC单倍型HLA-A1-B8-DR3-DQ2的一部分(21)与高TNFα生成有关(5,6). 对大量人群的研究表明，携带TNF2与脑型疟疾的不良结局相关(22)和利什曼病(23).
为了测试−308多态性是否具有功能意义，我们使用报告基因分析研究了其对转录的影响。我们的结果表明，TNF2等位基因是比普通等位基因更强大的转录激活物。虽然我们可以证明核蛋白的特异性结合和多态位点的DNase I超敏反应，但蛋白质对这两个等位基因的亲和力没有明显差异。这些结果表明，这种多态性可能对转录活性有直接影响，可能是HLA-A1-B8-DR3单倍型与高TNFα产生相关的基础，并直接导致携带TNF2等位基因的疟疾和利什曼病的不良结局。
材料和方法
TNFα启动子片段的产生和克隆。
使用引物5′-GCTTTGTCCCTGCTACCCGC-3′和5′-GTCAGGGGATGTGGCGTCT-3′，通过PCR扩增TNFA基因691 bp（−585至+106）的片段(19). 将片段克隆到TA载体中并用于转换大肠杆菌（INVF′α菌株）（Invitrogen，美国生化公司）。在选择和繁殖后，用标准方法制备纯质粒DNA(24). 用限制性内切酶消化法从TA载体中去除TNF启动子等位基因欣dIII和Xba公司I（Promega）允许定向克隆到pBLCAT3表达载体(25). 插入物的序列通过使用Sequenase（美国生物化学）的双脱氧链终止法进行检查。
人类B细胞的转染。
使用人类Raji B细胞系进行实验。细胞培养在1×RPMI 1640培养基中，用1 M NaOH调节pH至7.4，用7.5%（vol/vol）碳酸氢钠缓冲，并补充5%（vol/vol）胎牛血清（GIBCO/BRL）、青霉素（100单位/ml）、链霉素（100μg/ml）和谷氨酰胺（2 mM）（英国诺森伯兰诺森比亚生物制品公司）。培养物在37°C的加湿5%CO中培养2/95%大气。Raji细胞通过改变培养基保持快速生长期，每3天以1:10传代，在400×克5分钟。用培养基清洗细胞一次，离心，然后以1×10的浓度重新悬浮7每毫升培养基中的细胞数；每次转染时使用800μl。在每个实验中，转染三种不同的质粒：(我)pBLCAT3(ii（ii）)TNF1-pBLCAT3，以及(三)TNF2-pBLCAT3。每次使用80μg DNA。在300V和960μFd的设置下，用来自基因脉冲发生器设备（Bio-Rad）的单个脉冲进行电穿孔，该设备具有电容扩展单元。电穿孔前后在室温下培养细胞10分钟。将细胞悬浮液添加到19.2 ml培养基中，并培养24小时。然后将每个细胞培养物分成两半，再次悬浮在20 ml培养基内。将福尔波12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）（Sigma）添加到一个培养物中，从每个副本添加到最终浓度为50 ng/ml的培养物中并再孵育48小时。然后通过离心法收集细胞，并将颗粒重新悬浮在0.25 M Tris·HCl（pH 8.0）中，并保存在−70°C下。细胞悬浮液经过三次快速冷冻/解冻以获得裂解物。
氯霉素乙酰转移酶（CAT）表达的定量和标准化。
使用商用酶联免疫吸附试验（Boehringer-Mannheim）测量转染细胞中CAT蛋白的产生。检测下限为100 pg/ml CAT。细胞提取物中蛋白质浓度的定量使用改进的微液技术（蛋白质检测试剂盒；Sigma）进行测定。
为了确定转染效率，遵循点印迹程序(26)使用β计数器（Tri-Carb 260-DU，Packard）。使用的探针是通过用生态意大利。该片段长约1500 bp，跨越CAT cDNA，随机标记为[α-32P] dCTP[3000 Ci/mmol（1 Ci=37 GBq）；Amersham]根据制造商的说明使用T7 Quickprime试剂盒（法玛西亚）。
从Raji细胞中提取DNA-结合蛋白。
按照描述从Raji细胞中提取核蛋白(27). 使用前，测定蛋白质浓度。
生成放射性标记的TNFA启动子片段。
利用引物5′-CAAAAGAAATGGAGGCAAT-3′和5′-TCCTCTCTCCGATTCCG-3′从TNF1和TNF2纯合个体中扩增出一段119-bp的TNFα启动子片段（−345至−226）。然后将这两个等位基因片段克隆到TA载体中，并如上所述确认序列。探针通过限制性消化制备，使用Nsi公司我和欣dIII，[α-32P] dCTP最终用Klenow片段（Promega）标记，然后用Sephadex G-50 NICK柱纯化（Pharmacia）。用β计数器测量探针的比活性。
电泳迁移率变化分析（EMSA）。
核蛋白提取物（10μg）与2μg聚（dI-dC）（Pharmacia）在25μl缓冲液中孵育，缓冲液由10 mM Tris·HCl（pH 7.5）、75 mM KCl、5 mM MgCl组成2室温下，1 mM DTT、1 mM EDTA、12.5%甘油和0.1%（vol/vol）Triton X-100培养30分钟。添加2.5 ng标记探针并再培养30分钟后，2.5μl加载缓冲液由250 mM Tris·HCl（pH 7.5）、0.2%溴酚蓝、0.2%二甲苯氰醇组成，添加40%甘油，样品在0.25×TBE（90 mM Tris/64.6 mM硼酸/2.5 mM EDTA，pH 8.3）/4%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。通过放射自显影术显示条带。通过测量260 nm处的光密度来量化竞争对手DNA的浓度。通过比较琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后的条带强度来验证这一点。
DNA酶I足迹。
最初，将80 ng Raji核提取物在37°C下于50μl缓冲液中培养20分钟，缓冲液中含有25 mM Hepes（pH 7.8）、50 mM KCl、0.05 mM EDTA、0.5 mM DTT、0.5mM苯甲基磺酰基氟化物、5%甘油和100 ng聚（dI-dC）。然后添加标记探针（40000 cpm）并再培养20分钟。添加1 mM CaCl后，在0°C下用0.01单位的DNase I（Boehringer Mannheim）消化1分钟2和5 mM氯化镁2然后用100μl停液终止反应，该停液由0.375%（wt/vol）SDS、15 mM EDTA、100 mM NaCl和100 mM Tris·HCl（pH 7.6）组成。然后将产物与0.18 mg蛋白酶K和10μg tRNA在37°C下孵育15分钟，最终体积为163μl，提取苯酚/氯仿并沉淀乙醇。同时，生成了Maxam–Gilbert胍梯，如所述(28). 片段在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。然后干燥凝胶并通过放射自显影术进行可视化。
结果
TNFA启动子片段诱导CAT蛋白。
用三种质粒转染Raji细胞：一种阴性对照，由pBLCAT3载体单独组成，另一种质粒包含两个TNF等位基因启动子片段中的任何一个。使用来自不同质粒制剂的DNA进行了四次实验。通过CAT基因的Southern blot分析评估转染效率，并通过β计数进行量化。在细胞裂解液中也测量总蛋白。利用这些结果校正CAT蛋白浓度，以最小化因转染效率和细胞数量引起的差异，并以每毫克总蛋白中CAT蛋白的微克数表示。该实验的结果如图所示。正如预期的那样，阴性对照组在未刺激和PMA刺激的细胞中产生非常低水平的CAT蛋白。与TNF1-CAT相比，TNF2-CAT质粒在未刺激和刺激细胞中产生的CAT明显更高。TNF1-CAT质粒没有显示CAT的诱导产生。虽然PMA似乎对TNF2-CAT质粒有一定的诱导作用，但这并不显著。这一结果用不同批次的Raji细胞重复了四次。
从报告基因构建物中诱导CAT蛋白转染Raji细胞。Raji电池（0.8×107)用不含插入物的pBLCAT3载体（作为阴性对照）或每个等位基因启动子的691 bp转染。24小时后，将细胞分为两部分，并用PMA（50 ng/ml）刺激每个重复的一个烧瓶。再培养48小时后，收集细胞。通过CAT DNA的Southern blot分析，以及通过测量总蛋白，对转染效率和总细胞数的结果进行了校正。实验进行了四次，并显示了平均值和标准误差。
TNFα片段的EMSA。
为了研究多态性附近的蛋白质-DNA相互作用，我们使用Raji细胞提取物和119-bp TNF片段进行EMSA。实验结果如图所示。至少一种蛋白质与两个等位基因片段（通道2和7）结合。结合的特殊性质通过与100倍过剩的未标记TNF1探针（第3和第8道）或TNF2探针（第5和第10道）竞争DNA-蛋白质复合物的消失来证明，但在使用类似大小的白细胞介素1A（IL-1A）启动子片段（第4和第9道）时没有。
核蛋白对TNF启动子片段的特异性结合。Raji细胞的核提取物（10μg）与两个TNF启动子片段中的每个片段孵育，这两个启动子片段具有（3–5和8–10道）或不具有（1、2、6、7道）100倍摩尔过量的未标记探针。凝胶阻滞复合物由“蛋白质/DNA复合物”表示。通道4和9与未标记的IL-1 DNA片段竞争并没有破坏复合物。
TNFα启动子区片段的DNase I足迹。
在足迹分析中确定了多态位点周围DNA-蛋白质相互作用的确切位置。在−308处与相邻的保护区（图。). 没有发现其他相互作用的证据。
在−308检测超敏位点。体外显示了TNF1等位基因（编码链）的DNase I足迹分析。未填充箭头表示保护区域，填充箭头表示DNase I超敏位点。车道：1、Maxam–Gilbert胍梯；2、裸DNA对照；3，再加上Raji细胞核提取物。
竞争性EMSA。
为了检查转录活性的差异是否是由于两个等位基因对结合蛋白的亲和力不同所致，使用标记的TNF1和增加冷寡核苷酸的过量量进行了竞争EMSA。没有证据表明这两个等位基因之间的亲和力存在重大差异（图。).
竞争EMSA使用等位TNF启动子片段和Raji核提取物。使用标记的TNF2。车道：1和7，无竞争对手；2–6和7–12车道，分别增加了未标记TNF2和TNF1作为竞争对手的过剩量。TNF等位基因之间对核蛋白的亲和力没有明显差异。
讨论
一些特征使得很难确定MHC中的特定DNA变体是否直接导致疾病关联。这是基因组中多态性最强的区域，包含许多编码参与炎症和免疫反应的蛋白质的基因。另一个重要特征是MHC中等位基因之间的强连锁不平衡。因此，例如，单倍型HLA-A1-B8-DR3-DQ2的出现频率远远高于单个等位基因频率的乘积。因此，MHC单倍型与TNFα表型的关联可能不是由于TNF基因本身的多态性，而是由于调控该细胞因子表达的连锁基因的变异。一个可能的例子是最近克隆了一个Ik个TNF位点90千碱基内的B样基因(29). 至少有三个NFk个TNFα启动子内的B共有序列，每个序列都被证明能与B细胞核蛋白结合(17). 因此，重要的是要显示任何多态性的直接功能影响，因为与疾病的关联可能完全是由于与真正的病因基因的连锁不平衡。
我们的结果表明，在报告基因检测中，−308的多态性对转录活性有显著影响，这可以解释高TNFα表型和DR3单倍型之间的关联。这种差异的分子机制尚不完全清楚，因为没有证据表明DNA-结合蛋白与TNFA启动子的两种等位基因形式的亲和力存在重大差异，至少在Raji细胞中是如此。如果基于蛋白质与DNA的相互作用，这应该会在竞争实验中出现。也许由于多态位点的DNA/染色质结构的差异，转录因子的相互作用增强，导致TNFα基因更强的反式激活。我们的结果表明，人类B细胞中两个TNFα启动子等位基因片段均缺乏诱导性，这与之前的研究一致，该研究表明，与T细胞相比，729–6 B细胞系中PMA反应所需的最小启动子片段延伸至-1105 bp，基本活性高，诱导性差细胞和单核细胞系(30)发现Raji细胞中TNFαmRNA的高组成水平(18). 虽然多态位点位于AP2的一致序列中，但我们在凝胶阻滞试验中使用重组人蛋白，没有发现AP2与多态位点结合的证据（数据未显示）。有趣的是，TNFA启动子中的一个同源序列（−254到−230）已被证明与转录阻遏物而不是AP2结合(31). 因此，可能是一种新的蛋白质与多态性TNFA−308位点结合。其他一些研究小组已经研究了这种多态性对基因表达的影响。在Jurkat细胞或U937细胞的一项研究中发现了与我们的结果类似的结果，有证据表明一种蛋白质只与TNF2等位基因结合(32). 另外两个组无法证明启动子等位基因之间转录活性的差异。这可能是因为所使用的细胞类型、刺激物和报告基因结构的差异(33,34). 例如，我们发现，在报告基因分析中，短于此处描述的TNFA片段是不活跃的（数据未显示）。然而，最近一项关于用抗CD3和抗CD28刺激的外周血单个核细胞产生TNFα的研究表明，TNF2携带者的TNFα生成表型较高，在两种TNF单倍型中，TNF2+ve单倍型仅在−308时不同，TNFα产生显著更多(35). 因此，有证据表明TNF2基因型与TNFα生成增加有关体外.
一个有趣的观察结果是，在疟疾流行的西非地区，SLE发病率较低(36)相比之下，非洲裔美国人的发病率很高，他们大多是西非后裔(37). 进一步感染（NZB×NZW）F1鼠标伯氏疟原虫防止自发性狼疮样疾病(38). 在疟疾患者中，致命的脑疟疾病例中TNF水平最高(4). 一项对西非疟疾患者TNF基因型的研究表明，TNF2纯合子与脑疟疾导致死亡或严重神经并发症的风险增加7倍有关(22). 因此，TNF2等位基因可能是导致非洲SLE发病率较低的原因，因为地方性疟疾导致了较高水平的TNF生成，而美国缺乏这种TNF生成刺激物导致了非裔美国人狼疮发病率的增加。尽管纯合性对疟疾有不利影响，但在西非和北欧人群中TNF2保持在类似水平，这表明非洲存在维持等位基因的代偿压力。也许它对其他主要传染病有有益的影响，如麻疹、脑膜炎球菌病、麻风病或结核病。也可能存在杂合优势。
HLA-DR4和-DR2分别与高和低TNFα产生的相关性尚未解释。似乎有理由推测，可能存在于TNFA基因的其他调控区域或连锁基因中的多态性在TNFα的产生中起作用。基因表达调控中最重要的区域似乎是3′非翻译区，它包含八位序列TTATTTAT的串联重复序列(39). mRNA中相应的UA-rich序列结合可诱导的细胞质因子(40)导致mRNA不稳定和翻译阻断(41). 这可能是该区域的DNA变体与HLA-DR4或-DR2处于连锁不平衡状态。TNF基因座中的微卫星等位基因可用于将DR4单倍型细分为高TNF和低TNF表型，这表明该基因座内或附近确实存在功能重要的DNA变体。TNFα被认为是类风湿关节炎慢性炎症反应的关键介质之一(42). 这种疾病的严重形式与DRB1*0401等位基因的纯合子有关(43). 因此，有趣的是，DR4亚型是否与高TNFα表型相关。
对−238 TNFA启动子多态性的研究表明，罕见等位基因与两种扩展MHC单倍型B18-DR3和B57-DR7之间存在强烈的连锁不平衡。然而，没有发现基因型与表型之间的关联，B18-DR3单倍型的高TNFα生成不能通过分型进一步区分(35)这表明它对基因表达没有直接影响。当然，基因编码区也可能存在多态性，正如在附近的淋巴毒素α基因中发现的那样(44). 然而，关于−308 TNFA2，有证据表明，在TNFα水平与预后不良相关的疾病中，它的比例过高。据报道，该等位基因产生的TNFα更高体外现在，我们在报告基因分析中显示TNFA2启动子的转录率增加。这些观察结果开始证明−308变异具有生物学意义。
人类IL-1基因簇在第2染色体上的多态性已被确定，并且与许多自身免疫性疾病的相关性也已被描述(45–47). a的等位基因塔克IL-1β基因的I限制性片段长度多态性与高IL-1β产生表型和银屑病有关（F.S.di Giovine，个人通讯）。由于传染病的选择性压力，人群中可能存在不同的细胞因子基因型。可能是特定的细胞因子基因型有助于根除感染性疾病，但通过产生“促炎”表型，它们易患慢性炎症疾病或更严重的炎症疾病，临床结果更差，无论最初的触发事件是感染源、自身免疫，还是任何足以刺激炎症反应的原因。目前正在广泛的人类疾病中测试这种可能性。
致谢
我们感谢杰拉尔德·克拉布特里（Gerald Crabtree）、弗朗西斯科·迪吉奥文（Francesco di Giovine）、詹姆斯·洛伦斯（James Lorens）和马丁·尼克林（Martin Nicklin）的建议和讨论。这项工作得到了关节炎和风湿病委员会科普曼旅行奖学金（A.G.W.）、关节炎和风湿委员会（G.W.D.）的项目拨款、罗纳-普伦茨-罗勒的拨款以及国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（H.O.M.）的拨款的支持。
缩写
| 肿瘤坏死因子α | 肿瘤坏死因子α |
| TNFA公司 | TNFα基因 |
| 磁流体控制 | 主要组织相容性复合体 |
| SLE公司 | 系统性红斑狼疮 |
| CAT公司 | 氯霉素乙酰转移酶 |
| 电磁感应加速器 | 电泳迁移率测定 |
| 伊利诺伊州 | 白细胞介素 |
| 项目管理局 | 佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯 |
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