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致癌物。作者手稿；PMC 2007年11月20日发布。
以最终编辑形式发布为：
致癌物。2003年1月；22(2): 256–265.
数字对象标识：10.1038/sj.onc.1206113
PMCID公司：项目编号：C2034407
大厅：HALMS143840号
PMID：12527894

IL-8的表达及其与乳腺癌细胞雌激素受体阴性状态的关系

阿丽亚娜·弗伦德,1 科林·乔沃,1 Jean-Paul布鲁莱特,2 安妮克·卢卡斯,1 马蒂厄·拉克鲁瓦,1 安妮·利茨纳,1 弗朗索瓦斯·维格农,1和Gwendal Lazennec公司1,*
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

雌激素受体（ER）状态是乳腺癌管理中的一个重要参数，因为ER阳性乳腺癌的预后优于ER阴性乳腺癌。这种差异主要来自ER阳性肿瘤较低的侵袭性和侵袭性。在此，我们证明，IL-8在大多数ER阴性乳腺、卵巢细胞系和乳腺肿瘤样本中明显过度表达，而在ER阳性乳腺或卵巢细胞系中未检测到明显的IL-8水平。我们还从ER阴性的MDA-MB-231细胞中克隆了人IL-8，我们发现乳腺癌细胞产生的IL-8与单核细胞衍生的IL-8.相同。有趣的是，ER阴性乳腺癌细胞的侵袭潜能至少部分与白细胞介素-8（IL-8）的表达有关，但与IL-8受体水平无关。此外，IL-8使ER阳性乳腺癌细胞的侵袭力增加了2倍，从而证实了IL-8的抗侵袭作用。另一方面，雌激素受体在ER阴性细胞中的外源性表达导致IL-8水平下降。总之，我们的数据表明，IL-8的表达与乳腺癌和卵巢癌细胞的ER状态呈负相关。我们还支持IL-8表达与癌细胞更高侵袭潜能相关的观点在体外这表明IL-8可能是肿瘤侵袭性的新标志物。

关键词：氨基酸序列，碱基序列，乳腺肿瘤，遗传学，代谢，病理学，致癌性测试，癌症，导管，乳腺，遗传学，代谢，病理学，细胞分裂，药物效应，遗传学，女性，基因表达调节，新塑性，人类，白细胞介素-8，遗传学，代谢，药理学，分子序列数据，肿瘤侵袭性，受体，雌激素，代谢，肿瘤细胞，培养

介绍

乳腺癌是发达国家女性最常见的恶性肿瘤之一(皮萨尼，1992年). 在不同的预后因素中，雌激素受体缺乏一直与预后较差有关(Skoog等人，1987年). 已鉴定出两种雌激素受体（ERα和ERβ）(Green&Chambon，1986年;Mosselman等人，1996年). 大多数人类乳腺癌，至少在最初时，表达ERα，ERα的存在通常被认为是激素依赖性的标志，尽管只有60%的ERα阳性肿瘤对三苯氧胺辅助治疗有反应(麦奎尔，1975年). 相反，与正常组织相比，ERβ在大多数乳腺癌和卵巢癌中的表达较低(Pujol等人，1998年;Roger等人，2001年). 由于乳腺癌和卵巢癌中ERβ水平较低，本研究样本的ER阳性状态将指雌激素反应性ERα阳性细胞。

在寻找癌症侵袭性标记物的过程中，白细胞介素-8（IL-8）被怀疑在乳腺癌中起重要作用。由于转移是人类乳腺癌死亡的主要原因，我们试图研究转移潜能（侵袭性）增加与ER缺乏和IL-8表达变化相关的可能性。

IL-8是一种8,4 kDa蛋白，属于趋化因子CXC亚家族，其特征是有两个必需的半胱氨酸残基，由第三个中间氨基酸分隔(Baggiolini等人，1989年;松岛和奥本海姆，1989年). IL-8有两种主要形式，即72个氨基酸的单核细胞衍生形式，在单核细胞和巨噬细胞的培养物中占主导地位，以及具有五个额外N末端氨基酸的内皮形式，在组织细胞（如内皮细胞和成纤维细胞）的培养物中占主导地位(Terui等人，1998年).

本研究的双重目的是确定IL-8在人类乳腺癌细胞系中的表达是否存在差异，特别关注雌激素受体水平，并研究IL-8异位表达对乳腺癌细胞系增殖和侵袭的影响。

结果

IL-8被认为是乳腺癌的潜在转移因子(De Larco等人，2001年)然而，没有研究调查IL-8表达在雌激素受体（ER）阴性乳腺癌侵袭性中的潜在参与。因此，我们对一组乳腺癌细胞株进行了研究，以确定IL-8是否与ER状态相关，以及IL-8表达的差异是否可以反映ER阴性和ER阳性乳腺癌细胞的侵袭潜能。

我们首先检测了IL-8在两种不同模型细胞系中的表达：MDA-MB-231（ER阴性）和MCF-7（ER阳性）细胞。通过使用IL-8探针进行northern blot，我们观察到MDA-MB-231和MCF-7细胞中IL-8表达的显著差异。IL-8在MDA-MB-231细胞中高表达，在MCF-7细胞中未检测到(图1A). 此外，E2处理并不影响MCF-7和MDA-MB-231细胞中IL-8 RNA的水平，而是诱导MCF-7细胞中pS2的表达，证实了这些细胞的反应性(图1A). 在蛋白质水平上，IL-8也仅限于MDA-MB-231细胞(图1B).

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IL-8在MDA-MB-231细胞中高度表达。A.用乙醇载体或E2（10）处理MDA-MB-231或MCF-7细胞−9M） 持续4、12或48小时。RNA用于使用IL-8探针的northern分析。用western blot分析经乙醇载体或E2（10）处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞中IL-8蛋白的含量−9M） 持续48小时。C.通过MDA-MB-231总RNA与IL-8特异性引物的逆转录反应扩增IL-8 cDNA。PCR产物的大小约为900 bp，而1kb标记物（外源性）（M）的大小为900 bp。D.克隆后，对PCR产物进行测序。该序列与已知的IL-8序列100%同源。

为了确定我们观察结果的相关性，必须确保MDA-MB-231细胞产生的IL-8具有功能。因此，我们用人IL-8 cDNA的特异性引物进行RT-PCR，从MDA-MB-231细胞中克隆出IL-8。我们分离出一段IL-8片段，该片段由cDNA的前877 bp组成，并包含该蛋白的完整开放阅读框(图1C). 测序结果表明，MDA-MB-231细胞产生的IL-8与72 aa单核细胞形式的IL-8-和一个经典的27 aa信号肽相对应，该信号肽是最活跃的IL-8形式(图1D).

然后，我们分析了IL-8在MDA-MB-231细胞中的过度表达是否是ER阴性和ER阳性乳腺癌细胞之间的一般差异。我们选择了三个阴性和三个阳性乳腺癌细胞系，通过northern blot评估IL-8的表达(图2). 有趣的是，没有一个ER阳性细胞株表达可检测到的IL-8 RNA水平，而两个ER阴性乳腺癌细胞株（MDA-MB-231和MDA-MB-436）表达高水平的IL-9，SK-BR3细胞没有显示出明显的IL-8-水平(图2). 此外，雌二醇并没有改变ER-阴性或ER-阳性癌细胞中IL-8的表达，而强烈诱导ER-阳性细胞中pS2的表达（雌激素反应性的标志物）。

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IL-8 RNA在乳腺癌细胞中有差异表达。培养ER阴性（上面板）或ER阳性（下面板）乳腺癌细胞，并用雌二醇处理或不处理（E2:10−9M） 持续48小时。提取后，使用20μg来自不同细胞的总RNA进行Northern印迹，并与IL-8或pS2探针杂交。用RNA 28S探针检查等负荷。这里显示了一个典型实验的数据。

由于产生细胞通常分泌IL-8，我们随后在收集的乳腺癌和卵巢癌细胞系中测定了IL-8的分泌，以评估这是否适用于一般癌症细胞。我们用ELISA法分析了ER阴性和ER阳性乳腺癌细胞分泌IL-8的情况(图3A、B). 有趣的是，ER阴性乳腺癌细胞分泌的IL-8数量不等，从0.1到336 ng IL-8/ml/48h/百万细胞不等。另一方面，令人惊讶的是，检测到的ER阳性乳腺癌细胞均未分泌显著水平的IL-8。为了评估这种产生模式是否对乳腺癌细胞具有特异性，我们分析了宫颈癌（Hela）和卵巢癌细胞株（PEO14、BG1、PEO4）的IL-8分泌情况(图3C). 同样，也观察到相同的模式：ER-阳性癌细胞没有显著分泌IL-8，ER-阴性癌细胞分泌不同数量的IL-8。非常有趣的是，Hela细胞中ERα或ERβ的外源性表达导致这些细胞中IL-8的表达降低约50%(图3D)证实ER的存在与IL-8的表达呈负相关。这使我们确定IL-8的表达是否与ERβ状态相关。我们首先通过一种雌激素反应报告体构建的瞬时转染试验来检测我们细胞系的雌激素反应性(图3E). 正如预期的那样，只有ERα阳性细胞株（BT-474、CAMA-1、MCF-7、T47D、ZR-75-1、PEO4和BG1）对雌二醇有反应。然后我们通过RT-PCR分析这些细胞的ERβ含量(图3F). 我们观察到，除了MDA-MB-468细胞外，ERβ在不同细胞系中的表达不同且较低。考虑到这些细胞的无反应性，ERβ的表达可能过低或导致蛋白质的突变形式。但最重要的结论是，我们没有看到ERβ和IL-8水平之间的任何相关性。

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IL-8优先由ER阴性癌细胞分泌。A.ER阴性乳腺癌细胞。B.ER阳性乳腺癌细胞。C.ER阴性宫颈癌（Hela）或卵巢细胞（PEO14）或ER阳性卵巢癌细胞（BG1、PEO4）。细胞接种在培养基中的六孔板中。生长48小时后，从每个孔收集1.5 ml培养基，通过ELISA评估IL-8水平。结果表示为ng IL-8/ml/48h/百万细胞，代表三个独立实验的平均值±SD。在MOI 100时，用Ad5、Ad-hERα或Ad-hERβ腺病毒感染D.Hela细胞（见材料和方法）。表达48小时后，收集培养基并用Elisa分析IL-8含量。结果表示为ng IL-8/ml/48h/百万细胞，代表三个独立实验的平均值±SD。用ERE2-TK-LUC报告子瞬时转染法测定不同细胞系的雌激素反应性。细胞在对照载体乙醇或10的存在下生长24小时−9M E2号。结果显示，在β-半乳糖苷酶活性归一化后，E2存在时报告基因活性的诱导倍数与无配体（n=3）时的活性相比。如材料和方法部分所述，通过半定量PCR测定不同细胞系中F.ERβ的表达。将ERβ表达归一化为rS9水平后，结果以任意单位表示，并表示两个实验的平均值。

为了扩展我们的在体外观察IL-8在ER阴性和ER阳性癌细胞中的差异表达，我们用RT-PCR分析了14例乳腺肿瘤标本中IL-8的表达。通过RT-PCR测定ERα和ERβ状态(图4A)并通过ELISA(图4B). 首先，通过RT-PCR，我们没有发现14个样本中ERβ表达的显著差异，而ERα状态与Elisa数据完全一致。此外，在可比较的扩增周期数下，ERβ的表达弱于ERα的表达（见材料和方法）。这证实了我们实验室之前的工作，证明ERβ在乳腺肿瘤中的表达较弱，并且ER阳性样本确实为ERα阳性(Brouillet等人，2001年). 我们观察到，大多数ER阴性肿瘤（5/7）表达可检测的IL-8水平，尽管其中两个肿瘤不含显著水平的IL-8(图4A、C). 相反，在任何ER阳性乳腺癌组织中均未检测到IL-8(图4A、C). 当我们评估7个ER阳性和ER阴性肿瘤组之间IL-8 mRNA水平的表达时，我们发现仅在ER阴性肿瘤中IL-8优先表达的组之间存在显著差异（p=0.001）。我们还评估了样本中的PR水平，但PR和IL-8水平之间没有相关性(图4B).

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IL-8在ER阴性乳腺肿瘤中优先表达。A.采用RT-PCR分析14例患者的ER阴性（左侧）或阳性（右侧）乳腺肿瘤的ERα、ERβ和IL-8表达。rS9被用作样品间等扩增的控制。除ERβ（35个周期）外，所有标记物均进行了29个周期。用ELISA法对每个肿瘤样本中的雌激素受体（ER）和孕酮受体（PR）进行定量。结果以fmol/mg蛋白质表示。C.样本中IL-8水平的表示。IL-8水平已归一化为rS9水平，结果以任意单位表示。

我们的第二个目标是评估IL-8的表达是否与ER阴性癌细胞的高侵袭性相关。体外在transwells中通过由基质凝胶组成的重组基膜进行细胞侵袭试验。我们观察到，除SKBR-3（不表达显著的IL-8水平）外，所有ER阴性乳腺癌细胞都具有高度侵袭性(图5A). 相反，ER-阳性乳腺癌细胞的侵袭能力很低(图5B). 子宫内膜癌和卵巢癌细胞也观察到ER阴性癌细胞具有较高的侵袭潜能，而ER阳性卵巢癌细胞则表现出较低的侵袭能力，这表明这是癌细胞的普遍现象(图5C). 当比较不同细胞系之间IL-8水平与其侵袭潜能时，Spearman和Kendall检验表明这两个变量是相关的（K=0.5883，Spa=0.7293）。

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癌细胞的侵袭潜能。细胞被镀在横孔或控制板上。迁移24h后，迁移细胞的百分比表示为三个独立实验的平均值±SD。A.ER阴性乳腺癌细胞。B.ER阳性乳腺癌细胞。C.ER阴性宫颈癌或卵巢细胞或ER阳性卵巢癌细胞图3.

下一步是分析IL-8影响癌细胞侵袭和增殖的机制。IL-8通过特定受体（CXCR1和CXCR2）发挥作用。因此，为了评估IL-8对癌细胞的生物学效应，重要的是检查IL-8受体（CXCR1和CXCR2）是否存在于不同的细胞系中。这是通过RT-PCR进行的，以提高灵敏度。CXCR1受体的表达水平很低（数据未显示）。相反，CXCR2存在于不同的细胞系中，MCF-7和MDA-MB-435细胞除外(图6A). ER状态与CXCR2水平之间没有相关性，因为大多数ER阴性或阳性细胞株都表达较高水平的该受体。

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IL-8的表达与IL-8受体水平无关，并且促进侵袭但不促进增殖。A.使用CXCR2特异性引物通过RT-PCR监测CXCR2的表达。这里显示了一个具有代表性的实验。使用rS9引物进行PCR，以检查相同的反转录和扩增。B.左侧面板。用IL-8 cDNA的正义（IL-8）或反义（IL-8AS）版本转染ZR-75-1细胞。转染24h后，将细胞置于transwell或对照板上。侵袭开始后24h，用荧光素酶法检测迁移细胞。对照迁移细胞的百分比设置为100。结果表示为对照迁移细胞的百分比，并表示三个实验的平均值±SD。右侧面板。同样的实验，但将重组IL-8（0.15μg/ml）添加到培养基中。C.反义IL-8对ER阴性MDA-MB-231细胞侵袭的影响。D.IL-8不修饰在体外乳腺癌细胞增殖。用载体或IL-8（0.05μg/ml或0.15μg/ml）治疗第2、4和6天，测定ZR-75-1和MDA-MB-231细胞的增殖率。结果代表四次测定的平均值（SD<15%）。

为了证实IL-8参与侵袭，我们进行了在体外ZR-75-1细胞的侵袭试验，该细胞已用IL-8有义或IL-8反义质粒以及荧光素酶报告基因瞬时转染(图6B). 这使我们能够只跟踪转染细胞。用IL-8敏感载体转染的ZR-75-1细胞表现出两倍的侵袭增强，而反敏感载体则没有效果，可能是因为这些细胞中IL-8水平很低(图6B). 另一方面，向培养基中添加重组IL-8也会增加ZR-75-1细胞的侵袭性。这些数据证实IL-8在癌细胞的侵袭中发挥作用。有趣的是，在ER阴性MDA-MB-231细胞中转染IL-8反义结构后，细胞的侵袭性降低了约20%，证实了IL-8的促侵袭作用(图6C).

由于IL-8影响侵袭，我们想知道它是否也可以改变在体外乳腺癌细胞增殖。因此，我们用两种剂量的IL-8处理ZR-75-1和MDA-MB-231细胞(图6D). IL-8并不影响这两种细胞的增殖，尽管这些细胞表达IL-8受体(图6A)证实IL-8的主要作用与侵袭有关。

讨论

α-趋化因子家族成员，如IL-8，被认为是潜在参与肿瘤生长和进展的肿瘤细胞产物。本研究的目的是评估IL-8是否与ER状态相关，以及IL-8能否解释ER阴性乳腺癌细胞的高侵袭性。

从MDA-MB-231细胞中克隆IL-8 cDNA表明，其序列与72个氨基酸单核细胞衍生形式完全相同。这种形式实际上是不同IL-8亚型中最活跃的，与79个氨基酸形式相比，在白血病细胞中不显示促凋亡特征(Terui等人，1999年).

更重要的是，我们发现IL-8在ER阴性乳腺癌细胞中过度表达。在ER阴性和ER阳性乳腺癌细胞中，IL-8的表达有很大差异。在ER阳性的乳腺癌细胞系中，不仅培养基中的IL-8 RNA，而且IL-8的分泌水平都极低，而在ER阴性的乳腺癌细胞中，IL-8的表达是阳性的，并且是可变的。从卵巢癌细胞中获得的结果可以看出，ER阴性细胞和ER阳性细胞之间的表达存在相同的差异。ERβ的表达较低，不同细胞系之间存在差异，因为我们只能通过RT-PCR检测ERβRNA，而不能检测ERβ蛋白（数据未显示）。ERβ表达与IL-8水平无相关性，提示ERα是ER阳性乳腺癌和卵巢癌细胞中主要的雌激素受体，是与IL-8-表达相关的受体。此外，对肿瘤样本的分析证实了ERα阴性细胞中IL-8高表达的一般模式，并表明ERα阴性和ERα阳性乳腺肿瘤在IL-8表达方面存在统计差异。

IL-8由包括结肠在内的多种人类癌细胞产生(Brew等人，1997年)、黑色素瘤(Schadendorf等人，1993年)，前列腺(Greene等人，1997年)，卵巢(Lee等人，2000年;Xu&Fidler，2000年)或乳房(Basolo等人，1993年;De Larco等人，2001年;Green等人，1997年;Youngs等人，1997年)但据我们所知，这是ERα状态和IL-8表达之间负相关的首次证明。IL-8不仅存在于正常乳腺中，也存在于癌性乳腺中(Basolo等人，1993年).

一些研究表明，复发性前列腺癌、乳腺癌或卵巢癌患者的血清或外周血白细胞中IL-8水平较高(Ivarsson等人，1998年;Merogi等人，1997年;Veltri等人，1999年)和癌组织(Green等人，1997年). 相反，其他研究表明，IL-8在乳腺肿瘤中的表达在正常组织和癌组织中是相同的(Speirs等人，1996年). 有趣的是，IL-6的表达与ER状态相关(Fontanini等人，1999年)这表明IL-6和IL-8是相反的标记物。

关于IL-8受体，我们观察到CXCR1在所有受试细胞系中的表达极低，而大多数受试细胞显示CXCR2的良好表达，与ER状态无关。CXCR1和CXCR2由两个不同的基因编码(Sprenger等人，1994年;Sprenger等人，1994年b)已证明在大多数癌细胞中表达，与肿瘤分级无明显相关性(Miller等人，1998年;Muller等人，2001年). 相反，Müller等人最近发现CXCR4和CCR7这两种其他参与趋化和侵袭反应的趋化因子受体在乳腺癌细胞以及恶性乳腺肿瘤和转移瘤中高度表达(Muller等人，2001年). 我们的结果表明，IL-8含量而不是CXCR1或CXCR2表达可以被视为ER阴性乳腺癌的标志物。

一个重要的问题是评估IL-8的表达是否与ER阴性乳腺癌细胞系的侵袭潜能相关。我们证明，与迁移率均匀较低的ER阳性癌细胞相比，大多数ER阴性乳腺癌或卵巢癌细胞的侵袭率更高，这表明ER状态与细胞的侵袭潜能之间存在普遍的负相关。并非所有细胞都存在这种相关性，这表明其他因素可能会调节每个细胞的侵袭潜能。这与一些报道一致，这些报道描述了ER阳性乳腺癌细胞通常比ER阴性乳腺癌细胞侵袭性小(Madsen&Briand，1990年;Sommers等人，1994年;汤普森等人，1992年). 人类乳腺癌中ER的缺乏与预后较差有关(Skoog等人，1987年). 此外，ER的外源性表达下调了Hela细胞中IL-8的表达。值得一提的是，我们和其他人之前已经证明，在ER阴性乳腺癌细胞中引入ERα或ERβ会降低细胞的侵袭性(Garcia等人，1992年;Lazennec等人，2001年). 迄今为止，无法对这种现象作出真正的解释。我们的新数据表明，转染ERα或ERβ的细胞中IL-8的表达降低可能至少部分解释了这些细胞侵袭性降低的原因。

此外，我们还发现IL-8的外源性表达增加了ER阳性乳腺癌细胞侵袭率的两倍，而不影响在体外这些细胞的增殖率，证实了IL-8的促侵袭作用。当IL-8被转染到癌细胞中时，两者的肿瘤抑制作用(Lee等人，2000年;Nakashima等人，1996年)、和促销(Inoue等人，2000年;Luca等人，1997年)已观察到体内取决于单元类型。

我们的数据表明，IL-8的表达与ER状态呈负相关，并且在侵袭性癌细胞中优先表达，这表明IL-8表达与肿瘤进展/侵袭性之间存在潜在的相关性。然而，现有研究仍处于初步阶段，无法就此问题得出结论。事实上，在异种小鼠模型中，这个问题仍然存在争议。大多数研究表明IL-8的表达与前列腺肿瘤的发生有关(Greene等人，1997年)，卵巢(Yoneda等人，1998年)和乳房(De Larco等人，2001年)癌症。其他报告表明IL-8的高表达抑制卵巢癌的肿瘤进展(Lee等人，2000年)对前列腺癌的影响微乎其微(Balbay等人，1999年)在裸鼠中的发育。IL-8减少裸鼠卵巢肿瘤进展的一个假设可能是癌组织中性粒细胞浸润增加，导致蛋白酶或凋亡剂释放，从而杀死癌细胞。这个假设可以解释这些研究之间的差异。

在乳腺癌患者中，IL-8的表达是否与人类的不良预后相关尚需评估。但是，到目前为止，还没有对大型人类乳腺肿瘤标本进行过广泛的研究，似乎IL-8的表达与代表不同临床阶段的肿瘤细胞的转移潜能或肿瘤预后之间没有明确的相关性。

IL-8参与宿主细胞增殖、血管生成、迁移或浸润的研究似乎很复杂，需要综合考虑从细胞培养、动物模型和大量临床研究中获得的数据。

材料和方法

细胞培养

细胞保存在补充10%胎牛血清（FCS）和庆大霉素的ATCC推荐的培养基中。为了进行转染分析，将细胞接种在6孔板上。为了使细胞脱离类固醇，将其培养在无酚无红DMEM/F12中，并添加10%的CDFCS（碳葡聚糖处理的FCS），培养4天。

质粒

CMV-LUC报告子（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）被用作入侵检测的内部对照，与巨细胞病毒（CMV）启动子控制下的荧光素酶基因相对应。pShuttle-IL-8 sense和pShutter-IL-8 AS（反义）包含克隆到pShutter载体（加利福尼亚州帕洛阿尔托市Clontech）的人类IL-8 cDNA序列1-877。用于监测我们细胞雌激素反应性的荧光素酶报告质粒ERE2-TK-LUC包含克隆在最小单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子上游的共有雌激素反应元件（ERE）的两个拷贝。CMV-GAL报告子被用作内部对照，与巨细胞病毒（CMV）启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因相对应。

瞬时转染

3.105转染前24小时，细胞被置于无酚红DMEM-F12加10%CDFCS的6孔板中。通过脂质感染（lipofectamine，Invitrogen，Groningen，荷兰）进行转染，每孔使用2μg pShuttle、pShutterle-IL-8 sense或pShutter-IL-8 AS以及2μg内部参考报告质粒（CMV-LUC）。脂肪感染后36小时，收集细胞，并在LKB光度计上使用Renilla荧光素酶分析系统（威斯康星州麦迪逊市Promega）检测荧光素酶活性。为了测定细胞的雌激素反应性，通过脂质体转染每孔2μg ERE2-TK-LUC和0.8μg内控CMV-GAL。如前所述测定β-半乳糖苷酶和荧光素酶(Lazennec等人，1997年).

RNA提取和逆转录酶聚合酶链式反应

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）分离总RNA。使用随机引物和Superscript II酶（Invitrogen）进行逆转录。PCR使用铂进行塔克聚合酶（Invitrogen）和1:40的反转录反应。在94°C下循环30秒，在60°C下1分钟，在72°C下进行1分钟30秒，共进行29次（ERα，rS9，IL-8，CXCR2）或35次（ERβ）。每个PCR的十分之一在琼脂糖凝胶上电泳。对于Northern blot分析，电泳20μg总RNA，然后与不同探针杂交。使用的底漆（s：感官，as：防感官）为：

CXCR2：TTGGCTCTCTTCAGGGCACTT（TTGGCTTTCTT）
CXCR2作为：CAGGGCACAATCTCCGGCTCAC公司
ERαs：AAAAGACCGAAGAGAGAGGAAT公司
ERαasATCCGGAACCGAGTAG公司
ERβs：GGTCCATCGCCAGTTATCACATC公司
ERβ为：CAGCTCTTTGCGCCGGTTTTATC公司
IL8：AGGTGCAGTTTTGCCAAGGAG公司
IL8作为：GCAGACTAGGTTGCCAGATTTA公司
RS9：CAGGCGCAGAGTGGAAGC公司
RS9为：CGCGAGCGTGGGTGATGGAC公司

Northern Blot分析

在1%琼脂糖甲醛凝胶上加载等量的RNA（每车道20μg）。然后将RNA转移到尼龙膜上。然后在65°C的杂交溶液（1 mM EDTA，7%SDS，0.5 M Na）中将膜与不同的探针杂交2高性能操作4pH值7.2）。用人28S探针确认所有微孔中RNA的载量相等。

全细胞提取物制备和Western blot

如前所述制备细胞提取物(Lazennec等人，2001年). 将30μg全细胞提取物蛋白进行SDS-PAGE，然后电转移到硝酸纤维素膜上。用抗IL-8抗体（MAB-208，R&D Systems，Minneapolis，MN）（1:1000）检测印迹，然后用山羊抗鼠Gig辣根过氧化物酶结合抗体（1μg/ml）孵育。使用ECL试剂盒（伊利诺伊州阿灵顿Amersham Pharmacia Biotech）进行检测。

IL-8酶联免疫吸附试验

按照制造商的建议，通过ELISA测定培养上清中的IL-8浓度。简单地说，将样品添加到96周的微量滴定板中，该板涂有单克隆抗IL-8抗体（MAB-208，4μg/ml，R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）。2h后，将微孔冲洗三次，并添加生物素化抗IL-8抗体（BAF-208，20 ng/ml，R&D Systems）。培养2小时后，将平板清洗三次，并提供链霉亲和素-HRP结合物（RPN1231，Amersham-Pharmacia，白金汉郡，英国），将平板培养20分钟。再次清洗平板，并添加染色底物（Sigma Fast OPD，Sigma，St Louis，MO）。在450 nm处读取极板。

重组腺病毒的构建、繁殖和感染

本研究中使用的腺病毒已在前面描述过(Lazennec等人，2001年). 简而言之，野生型人类ER（hERα）或hERβcDNA的完整编码序列在pACsk12CMV5穿梭载体的BamHI位点亚克隆。为了获得重组病毒，许可HEK-293细胞（人类胚胎肾细胞）与pACsk12CMV5或重组pACsk12-CMV5-hER质粒以及包含腺病毒基因组剩余部分的pJM17共同转染。质粒的体内重组产生感染性病毒颗粒-非重组腺病毒Ad5或重组腺病毒-Ad-hERα和Ad-hERβ。Hela细胞以100倍感染率（MOI）感染DMEM/F12 10%CDFCS中的不同腺病毒过夜。第二天，更换培养基，让细胞表达IL-8 48小时，然后收集培养基。

通过Matrigel入侵，雷尼利亚荧光素酶测定和MTT测定

细胞在补充有10%FCS的DMEM/F12中的6孔培养板中培养过夜。如上文所述，将2μg pShuttle IL-8 sense或pShutter IL-8 AS或2μg控制载体pShuttele与2μg CMV-LUC载体联合转染。如前所述，使用12孔聚碳酸酯过滤器（12μm孔径）Transwells（纽约州科宁市科宁市科斯塔）进行侵入检测(Platet&Garcia，1998年). 迁移24小时后，收集迁移至过滤器下侧的细胞和控制板中的细胞，并如上所述测量荧光素酶活性。Matrigel浸润细胞的百分比由浸润细胞的荧光素酶活性与总细胞的荧光素酶活性之比表示。

如前所述，在没有转染的情况下也进行了相同类型的实验，以确定每个细胞系的侵袭潜能(Lazennec等人，2001年).

细胞增殖研究

细胞在10%CDFCS DMEM/F12中保存4天，然后以20000个细胞/孔接种在24孔培养皿中的10%CDFCS DMAM/F12中，补充或不补充重组人IL-8（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）。2天、4天或6天后，用DABA（二氨基苯甲酸）对总细胞DNA进行定量，如前所述(Lazennec等人，2001年).

肿瘤材料和肿瘤样本处理

该研究包括14例原发性乳腺浸润性导管癌，送往实验室进行ER和PR状态的常规分析。将冷冻活检样品在液氮中研磨成细粉，然后使用Dounce均质器在10mM Tris pH 7.4、1.5 mM EDTA、4.2 mM Thioglycerol、5 mM Molybidic acid中均质。在4°C下以100 000 g的浓度旋转匀浆1 h，产生100 000 g上清液，立即用于使用ABBOTT ER EIA单克隆试剂盒和ABBOTT PR单克隆试剂箱（法国Rungis，ABBOTT）进行ER和PR评估。

统计分析

统计分析。为了比较不同细胞系群体之间的IL-8分泌水平或侵袭潜能，采用了Kruskal-Wallis单因素方差分析（按等级），因为所分析的变量不是正态分布的，各组是独立的。为了寻找IL-8分泌水平和细胞系入侵潜力之间的相关性，我们估计了Kendall和Spearman秩的相关系数，然后将其与零值进行了测试。所有试验的P值显著性水平均设置为0.05。

致谢

我们感谢T.Maudelonde博士对手稿的批评性阅读和J.P.Daures教授的统计分析。我们感谢南特大学医院的病媒中心在法国控制肌病协会（AFM）的支持下生产腺病毒。这项工作得到了ARC（癌症防治协会，第4302号赠款）、国家癌症防治委员会（加德委员会）、INSERM和CNRS的资助。

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