优化多色免疫表型分析

简介

多色流式细胞术在免疫表型和免疫监测中的重要性在多种应用中日益增加。如今，研究和临床实验室在处理各种免疫学方面的问题时，都严重依赖流式细胞术对不同疾病环境以及健康免疫系统中的免疫成分进行表型和功能分析。流式细胞术是目前唯一能够适当分析免疫系统复杂成分的技术平台，即分别表征数十（或数百）种不同表型和功能的白细胞亚群，其中任何一种都可能与临床相关。因此，需要非常小心地开发多色流式细胞术分析，以确保由此生成的数据的可靠性。在本章中，我们将说明生成和优化复杂免疫表型小组以解决疫苗诱导的T细胞反应的过程。

随着能够测量多达20个参数的仪器的出现，进行更完整和更复杂分析的新可能性已经打开。这刺激了对保护相关性和疾病相关性的研究(1)这对于快速评估免疫干预措施是必要的。此外，有可能确定可归因于不同功能反应的表型独特的细胞亚群；这种分配可能会排除或至少减少进行耗时的功能分析以评估抗原特异性免疫反应的必要性。这是基于这样一种假设，即具有特定表型的细胞在特定的疾病环境中表示产生性免疫反应，而其他表型则表示无效反应或甚至细胞活动导致病理。值得注意的是，在不同的疾病背景和组织环境中，表型和反应的可取性之间的关系可能会有很大差异。

T细胞室在表型和功能上的复杂性是巨大的。不幸的是，几乎没有一个T细胞亚群可以通过一个甚至几个分子的表达来唯一识别，并且通常需要同时区分四个或更多分子的表达模式(2). 因此，多色流式细胞术（测量5种或更多颜色）的出现极大地影响了我们揭示T细胞生物学的能力。

然而，这种实验的设计、实施和分析的复杂性随着所用颜色的数量以几何级数增加；有许多障碍和问题必须解决。在本章中，我们描述了一些更常见的实验，并为成功进行多色实验制定了总体计划。

选择流式细胞仪的注意事项

目前用于研究和诊断的大多数机器通常测量6到12个参数。尽管本章将重点讨论15种颜色（17个参数）面板的开发，但所述过程适用于所有多色分析，无论是测量4种颜色还是18种颜色。抗体小组的精心研制最终将证明是有益的。

当今最先进的流式细胞仪可以同时测量20个参数——两个物理参数（细胞大小和粒度）以及18个荧光(表1). 如果在疫苗研究期间使用多色流式细胞术进行免疫表型分析，我们强烈建议购买这样的高端机器。尽管存在这种可能性，但目标并不是为所有科学问题开发18色面板。更重要的是，仪器中包含的荧光检测器越多，就可以为研究人员在分析开发方面提供更大的灵活性，因为检测器数量不会成为限制。通过提供从更多抗体结合物中进行选择的选项，这增加了将抗体调节到特定分析中需要评估的所有抗原的可能性。

表1说明了我们实验室中使用的LSR-II流式细胞仪的配置。由于绿色激光（532 nm激发）激发的所有荧光色素（Ax594除外）也可以在蓝色激光（488 nm激发）下测量，因此无需在该仪器中安装四个激光器。然而，与蓝色激光相比，绿色激光提高了免疫荧光灵敏度(三)，并规定检测额外的独特颜色（即Ax594，以获得总共18种颜色）。

初步考虑因素

随着越来越多的参数在单个样本中进行评估，坚持精细优化策略的重要性再怎么强调也不过分(4)随着参数的增加，多色分析的设计和分析变得更加复杂和耗时。为了说明设计和优化这种检测的过程，我们将讨论开发用于评估CD4的面板所采取的步骤⁺和CD8⁺人类外周血单个核细胞（PBMC）样本在接受不同抗病毒疫苗或治疗前后的T细胞反应。我们的目标是评估假定的T细胞激活对各自疫苗接种或治疗的反应。为此，分析小组必须包括淋巴细胞谱系标记（CD3、CD4、CD8）、分化标记（CCR7、CD27、CD28、CD45RA）以及细胞因子（IFN-γ、IL-2、TNF-α）和其他活化标记（CD107a，可能是CD154）的特异性抗体，以确定各自T细胞亚群的功能。

我们还希望包括一个活性标记，以提高细胞因子检测的敏感性，因为非特异性结合到死细胞的抗体结合物导致的假阳性事件可能会产生误导性结果。有许多死亡细胞标记物可用，包括DNA插入染料（EMA、PI、7-AAD、DAPI）、磷脂酰丝氨酸结合试剂（膜联蛋白V）和胺反应染料（UViD、ViViD、GrViD、OrViD）。据报道，后者最稳定，可以与细胞内流式细胞术结合使用，这需要细胞的固定和渗透(5). 此外，在确定死亡细胞的最高比例方面，他们的排名超过了PI和annexin V(5).

流式细胞术在研究和诊断中得到了广泛的应用，这在一定程度上得益于可用的荧光试剂的数量不断增加。虽然一些用于标记抗体的更经典的染料，如藻红蛋白（PE），具有较宽的发射光谱，但一些较新的试剂具有较窄的发射光谱。这一点很重要，因为它最大限度地减少了对其他荧光检测器的溢出，这一过程降低了在这些检测器中测量所需荧光的灵敏度。最近引入的被称为量子点（Q-dots）的半导体纳米晶体提供了许多由紫色激光激发的不同荧光粒子(6). 然而，Q-dot试剂并不能很好地用于所有抗体，并且很难对细胞内分子的检测进行优化。对于所有的荧光色素，尤其是Q-点，人们必须意识到，未结合的粒子可能会相互作用，形成聚集体。这些聚集物需要通过快速高速旋转抗体稀释液来最小化，因为它们非特定地标记一些细胞。

开发多色面板时，灵敏度是一个严重问题。试剂的灵敏度由三个因素决定：该光谱区域的细胞自身荧光、抗体结合物的性能（荧光色素的亮度、分子的表达水平）、，以及与同一细胞连接的其他抗体偶联物的存在（导致荧光溢出到同一检测器）。重要的是要认识到，由于亮度差异很大，并非所有的荧光颜料都能提供相同的灵敏度。此外，由于溢出荧光的累积干扰，包括更多试剂通常会降低给定抗体结合物的灵敏度。

为了对所有待分析的抗原保持最高的可能敏感性，必须通过测试抗体结合物和假定试剂盒的迭代过程来确定最佳试剂盒。在每个阶段，将面板的性能与前一步进行比较，以了解哪些交互作用导致灵敏度损失，从而指示面板是否需要调整。

网格

最初，我们会列出一份感兴趣的抗原列表，即分析中要包含的抗原“愿望列表”。如果不是所有人都能被纳入最后的小组，那么包含重要性排名是很有用的。随后将抗原分为以下三类之一：

1. 初级抗原是那些具有良好特征并能识别广泛细胞亚群的细胞。它们的表达通常是“开”或“关”，并用于对感兴趣的细胞亚群（例如CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20）进行选通。
2. 次级抗原每个细胞的相对分子密度也很高。然而，它们的表达模式通常是连续的（例如CD27、CD28、CD45RA/RO、干扰素-γ（IFN-γ）、穿孔素）。
3. 三级抗原仅在低水平表达（例如CD25、趋化因子受体）。无特征抗原也属于这一类。

为了能够为每种感兴趣的抗原选择最佳抗体结合物，需要对每种抗原测试多种试剂。我们的方法是购买许多一级试剂，二级试剂更少，三级抗原只购买一到两种试剂（具有最亮的荧光色素，例如PE、别藻蓝蛋白（APC））。这是昂贵的，但投资是值得的，因为它将允许为手头的研究问题开发理想的试剂面板。面板通常是为随后分析大量样本而开发的，因此抗体的总支出总是很大的。拥有高度优化的面板所带来的收益将抵消仅测试有限数量的初始偶联物所带来的信息成本；不要吝啬测试和优化阶段！

在进行之前，需要仔细滴定所有抗体并记录最佳滴定度。然后在单色实验中系统筛选所有可用于感兴趣抗原的抗体结合物，包括不同的抗体克隆和单个检测器中读取的不同染料。对于那些已知仅在小细胞亚群上表达的抗原，对这些亚群的样本进行特殊染色，以便随后分析抗体筛查结果。在对单个淋巴细胞进行仔细门控后，创建点图来比较各种试剂的性能。结果按检测器和染料分组，并为每个检测器选择最佳抗体结合物，然后将抗原插入网格(图1). 这样的网格，其中点图按抗原排序与。检测器对于随后选择可能的抗体组合以在潜在的多色面板中进行测试非常有用。

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图1

抗原/检测器网格

在y轴上读取指示的抗原。对于CCR7和CD27，共同分析CD45RA表达（x轴），而对于CD45RA，共同分析CCR7。对于CD107a，CD4的表达显示在x轴上，而对于CD154、IFN-γ、IL-2、MIP-1β和TNF-α，CD8的表达显示于x轴上。橙色边框突出显示待测试抗体面板中包含的抗体，而绿色边框标记面板中未使用的检测器，可能会被利用以在分析中包含更多标记。蓝色框表示所选抗体组中不包括的抗原。表右侧的数字表示一级（1°）、二级（2°）和三级（3°）抗原。

在为不同抗原分配候选检测器的过程中，首先考虑那些只有很少抗体结合物可用的抗原和/或那些不容易获得良好标记的抗原。通常，明亮的荧光色素，如PE和APC，优先选择用于弱抗原，在弱抗原中，每个细胞只表达少量分子，或那些仅由极少数细胞表达的分子（三级抗原）。从最难的抗原（很少有抗体结合物选项，仅在一小部分T细胞亚群上表达）开始，这里CD107a，对选项进行比较，并确定和标记最佳染色。这意味着阻断为CD107a选择的其他抗原的检测器，这可以很容易地使用网格显示。对所有三级抗原重复此过程，然后对所有二级抗原重复该过程，直到完成初级抗原，如CD3，CD4和CD8由相对较大比例的细胞以高分子密度表达，并且通常有大量抗体结合物可供选择。理想情况下，将在第一轮测试中对评估这些试剂不同组合的多个不同小组（可能是半打或更多）进行测试。

评估候选抗体小组

为了评估哪种（如果有的话）选定的假定抗体组将对所有感兴趣的抗原进行可靠染色，细胞不仅与组成一个抗体组的全套抗体一起培养，还与其中的子集一起培养。这允许识别产生干扰问题（即灵敏度降低）的抗体结合物。理想情况下，首先确定标记主要亚群（如CD4）的基本抗体名册⁺和CD8⁺T细胞。在随后的样品中，一次添加一个剩余的抗体，以评估每个添加的试剂对整个染色模式的影响。在此过程中，按分析过程中门控所需的顺序添加抗体是有意义的。可通过这种方式快速检测替代抗体结合物，从而逐步形成最终抗体组。

在中所示的示例中图2，一次添加一个抗体结合物，并相应创建点图，以描述用相应试剂实现的标记，以及对样品中包含的其他试剂的任何假定影响。图3A说明添加CD28后死亡细胞标记物ViViD的敏感性降低^聚乙烯Cy5由于在本示例中，ViViD与抗体结合物同时添加，因此对这种现象有两种可能的解释：1）它可能表明CD28中存在某种物质^聚乙烯Cy5干扰ViViD反应的抗体制备（例如胺、游离蛋白），或2）以相对较高的浓度（100μl中25μl）使用该抗体偶联物足以稀释ViViD以降低其染色强度。对此的解决方案是对表面标记物特异性的ViViD和抗体缀合物进行单独的孵育。

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图2

多色分析面板的渐进式结构

为了确定为多色面板选择的抗体结合物是否产生信号干扰，用组成面板的抗体子集标记一系列样品。第一个样品只含有一个抗体结合物（加上ViViD以排除死细胞），而每个后续样品含有一个以上的抗体结合物。每一行描绘了单个样本的曲线图，每一点添加的抗体结合物显示在每一行的左侧。对于每个样本，都会创建点图，这些点图遵循分析期间使用的选通策略，只要可以预测。这允许识别与其他抗体结合物产生信号干扰的抗体结合物，或者在当前抗体组合中不能产生足够的检测灵敏度。

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图3

解决问题

面板评估中的彩色框如图所示图2此处进行了放大，以便更好地可视化所发现的问题。

这些伪彩色图还表明CD3标记不成功，或者至少不够亮，无法区分CD3^{销售时点情报系统}和CD3^否定细胞。这是由于Cytostim（BD Biosciences的抗CD3和抗CD28抗体制剂）刺激对所有T细胞提供强烈的激活刺激，导致CD3分子严重下调。用相同的抗体混合物对未刺激的PBMC样品进行平行标记表明抗体结合物确实表现良好(图3B). 我们感兴趣的患者样本最终将在流式细胞术分析之前用肽刺激，预计肽刺激不会诱导如此极端的CD3下调，尽管在开始研究之前必须验证这一点。注意，这说明了面板开发的一个重要方面：在所有阶段，假定面板必须在最终分析的准确条件下进行测试；实验过程中有一些方面可能会影响灵敏度，而仅仅标记未经处理的新鲜细胞是无法揭示的。

CD28检测中的明显灵敏度损失如所示图3C描述CD127（x轴）与CD4上CD28（y轴）的表达^{销售时点情报系统}CD27型^否定CD45RA^否定添加IFN-γ前后的T细胞^{空气污染指数}结合。在上部面板中（无IFN-γ^{空气污染指数})，CD28^{销售时点情报系统}和CD28^否定细胞明显分离，而在下部面板中（IFN-γ^{空气污染指数}补充道）阴性细胞群似乎向阳性细胞群分散，阻碍了这两个细胞组分的明确区分。显示CD28的伪彩色图与。IFN-γ表达表明，在这种情况下，APC没有得到充分补偿，导致大量溢出到其他检测器，尤其是G660，它专门用于测量CD28^聚乙烯Cy5在当前面板中。问题是APC荧光是通过用IFN-γ标记CompBeads实现的^{空气污染指数}亮度低于PBMC样品中的亮度。因此，软件无法对信号进行适当补偿，因为它没有任何关于比补偿控制样本中的信号亮的信号行为的信息。这种溢出可以通过调整补偿矩阵来纠正。一旦纠正，CD28的分离得到了显著改善，尽管仍然存在因IFN-γ的加入而导致的灵敏度损失^{空气污染指数}在面板中。这种损失是由于G660检测器（针对PE-Cy5）中负总体的溢出诱导扩散造成的（有关此现象的完整解释，请参阅(7). 这个特定问题的长期解决方案是为该探测器包括一个基于细胞的补偿控制，确保补偿控制至少与实验样品一样明亮。对于其他探测器，基于珠子的补偿控制足够明亮，因此可以进行适当的补偿计算。

图3D强调IL-2检测很弱，即使在刺激培养基中添加了CD154特异性抗体结合物，CD154表达检测也很有限，这是检测活化CD4上该分子的最佳标记策略⁺T细胞(8). 预计CD4的较大比例⁺细胞将产生IL-2，其水平高于当前标记的水平。其他CD154和IL-2特异性抗体结合物必须在该抗体小组的背景下进行评估，以确定更好的组合。

最后，对于PD-1检测所选试剂是否与面板中的其他试剂一起提供足够的检测灵敏度，本实验没有得出任何结论(图3E). 原因是PD-1通常在健康个体的T细胞上以非常低的水平表达，其在记忆CD8上的表达上调⁺对控制不佳的慢性持续性病毒（如人类免疫缺陷病毒（HIV））具有特异性的T细胞(9). 因此，需要对HIV感染者的PBMC或刺激数天的细胞进行重新评估。

值得注意的是，“误差扩散”（不精确测量和补偿的结果(7))荧光色素抗原对之间可能存在很大差异。标记在淋巴细胞上高度表达的抗原，如CD3、CD4、CD8和CD45，通常会产生明亮的信号强度。QD655标记的抗CD4抗体（由V655检测器测量，看见表1)即使在CD4的平均荧光强度（MFI）之后，G660检测器也会显示出明显的扩散误差，R660检测器的扩散误差较小^否定和CD4^{销售时点情报系统}单元格已正确对齐(图4A). 这是因为所有三个探测器（V655、G660和R660）测量的波长非常相似（640 nm到680 nm）。然而，与R660探测器相比，G660探测器受到V655探测器中应测量的非常亮的信号的影响更为严重。因此，CD4上检测到的PE-Cy5信号（在G660检测器上）的最小荧光强度^否定和CD4^{销售时点情报系统}细胞非常不同(图4B) (三,10). 这也适用于其他抗体和荧光色素组合。因此，建议密切监测其他检测器中的传播误差，并尽可能通过改变抗体组合来防止这种影响(图4B). 在本例中，降低抗CD4抗体^QD655型抗体滴度为1/10^第个消除了G660探测器中显著的扩散误差，同时仍然提供了CD4之间的良好分离^否定和CD4^{销售时点情报系统}细胞。

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图4

荧光信号的传播误差

答：。对单抗体结合物标记的样本进行了传播误差分析。对于每个样本，与所添加抗体结合物（x轴）相关的检测器与实验中使用的所有其他检测器（y轴）相对应。这允许快速检测扩散误差，这将降低其他检测器的灵敏度，例如用CD4获得的灵敏度^QD655型.将试剂稀释1/10可消除此问题。B。QD655的展开误差^{销售时点情报系统}电池降低了G660探测器对PE-Cy5的灵敏度^{销售时点情报系统}QD655上的信号^{销售时点情报系统}单元格（红线）。先前滴定量的抗CD4抗体出现严重传播错误^QD655型G660检测器中的（V655）可通过使用较低滴度的抗CD4抗体进行校正^QD655型抗体或用另一种抗CD4缀合物如抗CD4取代^{空气污染指数}抗体（R660）。

样品制备

每个样本的细胞数量在很大程度上取决于所解决的科学问题，例如，人们是否有兴趣分析总的T细胞或仅分析T细胞的子集。需要估计获得的细胞总数，以包括足够的相关细胞群事件，以便提供可进行统计评估的明确定义的亚群和结果。

大多数抗体在室温或4°C（流式细胞术分析中最常用的两种培养温度）下结合良好。在我们的实验室中，细胞通常在室温下进行标记。然而，在某些情况下，发现在更高（37°C）温度下培养可以增加抗体与其抗原的结合。已经发现趋化因子和趋化因子受体对细胞分离和染色技术的变化异常敏感(11). 大多数（但不是全部）这些分子的最佳方案是在37°C下用Ficoll-gradient进行淋巴细胞富集，然后进行标记。这种趋化因子受体的一个很好的例子是CCR5。相反，其他抗原，如CXCR6，不能很好地耐受37°C的孵育，导致检测严重减少甚至取消(11).

在含有细胞外和细胞内蛋白抗体的面板中，需要应用顺序标记协议。如果要包括死细胞标记染料，如胺反应染料，我们建议先用死细胞标记染色培养样品，然后再进行细胞表面标记标记、固定/渗透，最后标记细胞内标记。值得注意的是，并非所有的死细胞标记染料都与细胞内标记所需的固定/渗透过程兼容(12). 同样，一些串联染料在光谱上不完全稳定于标记细胞内标记所需的固定/渗透程序，导致明显的补偿误差。这是否适用于假定抗体组中包含的任何试剂，可以通过比较两个标记有相同抗体结合物主混合物的样品来确定，抗体结合物的主混合物针对每个组中包括的所有细胞表面标记物，并在流式采集之前将其中一个样品提交固定/渗透细胞仪。两个样品中试剂性能的比较将迅速表明个别试剂与该程序的潜在不相容性，因此，与细胞内蛋白质的伴随检测。为了避免治疗导致选择性表面分子下调的问题，阻止通过传统的细胞表面标记检测到它们（例如，T细胞刺激时CD3下调，看见图3A)它们可以用检测细胞因子的相同两步方案在细胞内标记。然而，选择用于细胞外标记的抗体缀合物在用于细胞内标记时可能表现不佳，因为似乎并非所有的荧光染料都适用于用于检测细胞内蛋白质的抗体缀合物（数据未显示）。

正确的补偿

任何使用一种以上颜色的流式细胞术实验都需要包括用含有相关荧光色素的单抗结合物标记的样品进行补偿。必须注意，补偿管中的正信号至少与相应荧光色度的测试样品中的最亮信号一样亮。此外，应始终使用样品中使用的相同荧光色素进行补偿，而不仅仅是给定检测器的所有可能荧光色素中的一种（例如，PE-Cy5或PE-Ax647用于G660），作为发射光谱，因此，溢出到必须进行补偿的其他检测器中，不同的荧光色素和染料之间可能存在显著差异。

可以通过用抗体结合物标记细胞或抗体捕获珠（CompBeads）来制备补偿对照物。理想情况下，抗mIgGκ包被的CompBeads应用于抗人抗体偶联物，因为所有事件都是阳性的，信号峰通常很窄。然而，当所选择的抗体结合物不是mIgGκ克隆时，这是不可能的，在这种情况下，细胞将被标记有问题的试剂。每个检测器的阴性和阳性对照必须使用相同的抗体结合载体，因为细胞具有与CompBeads截然不同的自荧光特性，即未标记的细胞必须用作补偿样品的阴性对照，其中细胞标记为阳性对照而非CompBeads和反之亦然。如果不尊重这一点，样品将无法得到适当补偿(图5).

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图5

同类比较补偿

两个假彩色图都描绘了标记有抗CD3的同一PBMC样本^PE-Cy5.5抗体。使用该样品对PE-Cy5.5荧光进行补偿。然而，对于左点图，使用未标记的CompBeads作为PE-Cy5.5^否定对照，而未标记的PBMC用于右点图。

控制

从项目一开始就纳入所有必要的控制措施至关重要，因为没有适当的控制措施可以显著降低其他完整研究的影响。有三类控制：1）仪器设置和验证，2）门控控制，以及3）生物控制。

应每天进行仪器验证，并在每次单独实验之前验证系统的稳定性。这包括调整仪器参数（例如，单个探测器和滤光片的电压），以确保其性能随时间的推移而稳定，并且可以比较在不同日期获得的测量值，以便进行分析。这是验证长期研究中数据比较的先决条件。为了在获取实验样品之前对机器进行评估，我们通过测量安装的光电倍增管（PMT）测量的所有波长中以已知荧光强度发射的荧光珠样品来进行质量控制。此外，对于面板中使用的每种荧光色素，需要采集一个单独标记的样品（细胞或珠），以便随后可以通过分析软件计算溢出到其他PMT中的荧光，以进行适当的光谱补偿（见上文）。

即使流式细胞仪已经设置和验证，理想的抗体小组已经确定，门控控制和生物控制对于每个实验都至关重要。选通控制也被称为“荧光减一”（FMO）控制，因为除一种抗体外，所有抗体都用于标记FMO控制——通常是针对弱抗原的抗体。对于未知表达的抗原和三级抗原（见上文），应包括此类FMO控制。

研究项目之间的相关生物控制将有所不同。例如，如果在标记和流式细胞术分析之前对细胞进行刺激或其他处理，则包括未经处理的、“仅联合刺激”对照组或进行过对照处理的样品。在时间进程实验中，需要一个“时间零点”样本来确定基线测量值，在研究患者样本时，研究健康捐赠者的相应样本通常具有指导意义。

多色流式细胞术数据的分析和显示

首先，科学问题需要非常明确的定义。使用多色流式细胞术，人们很容易被多方面的结果淹没。观察由所用抗体的每一种可能组合定义的每一个亚群是不可能的，也是没有指导意义的。相反，需要提前确定要检查的是什么，并使用连续门控策略，以获得清晰可解释的数据。然而，如果以后出现另一个科学问题，数据总是可以在不同的角度下重新分析。

应使用具有“逻辑”（双指数）标度的图进行初步分析，该图允许正确显示高强度和低强度以及负值的荧光信号(10,13).

传统的点图或其变体（假彩色图、热图、斑马图等）以及逻辑图不一定是表示多色流式细胞术结果的最佳方式。然而，在以更统一的表示形式呈现消化后的结果之前，展示应用的选通策略的单个示例是有用的。有许多可能的方法来共同说明从大型数据集中获得的结果。没有金标准，因为不同类型的表示可能更适合于一种类型的分析。

如上所述，应用于数据分析的门控策略的示例应始终包含在出版物中，即使是作为在线可用的补充数据。这是所提供数据的组成部分，因为它有助于理解最终分析以及与独立出版物中的其他数据集进行比较。在我们示例中应用的分层门控策略中(图6)我们首先通过在前向散射中具有相似的高度（FSC-H）和面积（FSC-a）测量来选择单线。接下来，在小淋巴细胞周围设置一个门，如果包括一个转储通道，那么在激活T细胞（ViViD^否定CD3（CD3）^{销售时点情报系统}). 然后将其分为CD4⁺和CD8⁺亚群，并对每个亚群分别进行活化标记物和免疫反应蛋白分析。需要注意的是，激活和响应标记的门需要为单个细胞谱系或子集单独创建。例如，CD45RA在CD4上的表达门将非常不同⁺和CD8⁺T细胞。这种门控树的发布使其他人能够更全面地评估所呈现的结果，并为在其他实验室复制实验铺平道路。

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图6

选通策略

序贯门控策略在CD4分析中的应用⁺和CD8⁺T细胞的反应如门和箭头所示。健康供体PBMC在CD107a存在下与抗CD3和抗CD28抗体孵育^Ax680型和莫能新。

注意，CD3分子通过细胞内标记可见。在对单个细胞进行门控后，缩小了对小淋巴细胞的分析范围。直播CD3⁺T细胞被鉴定并进一步细分为CD4⁺和CD8⁺T细胞。随后对这些进行了激活标记物和感兴趣的细胞因子分析。对可能的抗原组合的一些伪彩色图进行了说明。

总结

多色实验的实施和优化可能非常困难；然而，在最后的实验中，花尽可能多的时间尝试变化并详细了解每个试剂（和每个标记步骤）对荧光分布的影响是极其重要的。由此产生的数据集将更容易解释，并提供有关实验条件的丰富信息来源。虽然面板开发仍主要是经验开发，但我们希望启发式方法和经验将很快转化为可用于帮助开发此类面板的算法。

致谢

脚注

参与者信息

尤兰达·D·马恩克，NIAID疫苗研究中心免疫技术科客座研究员，NIH，马里兰州贝塞斯达。

马里奥·罗德勒，马里兰州贝塞斯达NIAID疫苗研究中心免疫技术科高级研究员。

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