美国国家科学院院刊。2007年10月16日；104(42): 16633–16638.
衰老过程中p53功能下降：老年人肿瘤发病率增加的可能机制
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冯朝晖
*新泽西州新泽西医学和牙科大学新泽西癌症研究所，新泽西州，新不伦瑞克08903；
胡文伟（Wenwei Hu）
*新泽西州新泽西医学和牙科大学新泽西癌症研究所，新泽西州，新不伦瑞克08903；
安吉丽卡·特雷斯基
*新泽西州新不伦瑞克市新泽西医学和牙科大学新泽西癌症研究所，邮编08903；
伊娃·埃尔南多
†纽约州纽约市10021，纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系；和
卡洛斯·科尔登·卡多
†纽约州纽约市10021，纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系；和
阿诺德·莱文
*新泽西州新泽西医学和牙科大学新泽西癌症研究所，新泽西州，新不伦瑞克08903；
‡新泽西州普林斯顿高级研究所自然科学学院08540
*新泽西州新泽西医学和牙科大学新泽西癌症研究所，新泽西州，新不伦瑞克08903；
†纽约州纽约市10021，纪念斯隆-凯特琳癌症中心病理学系；和
‡新泽西州普林斯顿高级研究所自然科学学院08540
作者：Arnold J.Levine，2007年8月25日
.作者贡献：Z.F.、W.H.和A.J.L.设计的研究；Z.F.、W.H.、A.K.T.和E.H.进行了研究；Z.F.、W.H.、C.C.-C.和A.J.L.分析数据；Z.F.、W.H.和A.J.L.撰写了这篇论文。
摘要
癌症是一种衰老疾病。个体细胞在一生中的突变积累被认为是原因。在这项工作中，我们探索了一个额外的假设：p53功能是否会随着年龄的增长而下降，这会导致衰老过程中突变频率和肿瘤发生率的增加？在几个近交系衰老小鼠的不同组织中，发现p53对γ射线照射的反应效率显著下降，包括p53转录活性降低和p53依赖性凋亡。这种下降是由于应激后p53蛋白稳定性下降所致。的功能共济失调毛细血管扩张突变（ATM）激酶随着年龄的增长而显著下降，这可能是p53对辐射反应下降的原因。在培养的衰老小鼠脾细胞中也观察到p53对其他应激反应的下降。有趣的是，这种p53反应降低的发生时间与小鼠的寿命相关；寿命更长的小鼠会随着时间的推移延迟p53活性下降的开始。这些结果表明，由于p53介导的细胞凋亡或衰老在应激反应中的保真度下降，老年人的突变固定性增强，这为肿瘤发生与衰老过程之间的相关性提供了一个合理的解释。
关键词：凋亡，共济失调毛细血管扩张突变（ATM），肿瘤发生
癌症主要是老年人的疾病(1). 大多数肿瘤发生在生命的最后四分之一，频率随时间呈指数增长。小鼠（平均寿命2至3年）经常在1.5至2年后患上肿瘤，而狗（平均寿命12至16年）在10年后患肿瘤最多，而人类（平均寿命75年）在50至55岁后患肿瘤的频率增加(1–三). 这一观察结果被认为是由个体细胞（体细胞组织）中致癌基因或抑癌基因的DNA突变在一生中积累引起的(4). 这一假设得到了来自人类和动物模型的大量证据的支持，这些证据表明许多肿瘤含有关键的抑癌基因和致癌基因的突变。抑癌基因p53是人类肿瘤中最常见的突变基因，超过50%的肿瘤中含有突变第53页基因或p53途径(5). p53蛋白可被多种应激信号激活，并通过其靶基因的转录调控导致各种细胞反应，包括凋亡、细胞周期阻滞或衰老(5). 在某些情况下，p53正常功能的破坏是肿瘤发生或发展的先决条件。通过在生命早期预防这些肿瘤，第53页也是一个重要的长寿保证基因。例如，第53页-空白小鼠均在数月内死于肿瘤，杂合p53突变小鼠在一年或更长时间内发生肿瘤(6). 杂合性Li–Fraumeni综合征患者第53页基因显示30岁时癌症发病率为50%(7).
衰老是一个自然过程，细胞或生物体的许多正常生物功能逐渐下降。据报道，动物和人类的DNA修复、细胞增殖调节和免疫反应的功能随着年龄的增长而下降(8,9). 这些发现共同提出了一个有趣的假设：p53蛋白的功能是否会随着年龄的增长而下降，这可能会导致衰老过程中突变频率和肿瘤发生率的增加以及DNA突变的积累？为了探索这一假设，在这项工作中，我们研究了几种近交系小鼠中p53蛋白的活性和p53对各种应激反应的效率，以及它们的年龄函数。
结果
衰老小鼠p53转录活性降低。
作为一种转录因子，p53蛋白调节许多靶基因的转录(5). 为了探讨p53功能是否随着年龄的增长而下降，在年轻和老年小鼠中测试了p53转录活性。对不同年龄的性别匹配的C57BL/6小鼠进行γ射线照射（IR，5Gy），于IR后6h处死，收集不同组织。一组p53靶基因的mRNA水平，包括p21基因,彪马,Bax公司,Fas公司,MDM2型、和细胞周期蛋白G1采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测IR前后的、。他们参与细胞周期阻滞的调控(p21基因)，凋亡(彪马,Bax公司、和Fas公司)和p53通路的负调控(MDM2型和细胞周期蛋白G1). IR对这些基因的诱导依赖于p53，因为它们在不同组织中的诱导程度或诱导程度都很低第53页−/−小鼠与第53页+/+小鼠（数据未显示）。脾脏是一个放射敏感性组织，对IR有很高的p53反应，这些基因显然是由IR诱导的(). 有趣的是，与6个月大的小鼠相比，这些基因的诱导倍数在衰老小鼠（20或25个月大雌性和28个月大雄性）中持续降低了近两倍（对于6个月龄的p53调节基因）。除脾脏外，在各种组织中也观察到类似结果，包括肾脏、胸腺、心脏、肺、大脑、肌肉、小肠和皮肤。红外光谱在所有这些组织中的诱导水平持续降低p21基因在大多数组织中含量较低MDM2型和细胞周期蛋白G1在老年小鼠中，尽管不同组织之间的差异程度不同(). 这些结果表明，衰老小鼠的p53转录活性下降，这不是组织特异性的，而是一种普遍现象。在IR后的不同时间点（6、12和24小时）测量这六个基因的诱导动力学。与年龄较大的小鼠（20或25个月大）相比，6个月大的雌性C57BL/6小鼠在IR后的所有时间点都持续观察到脾脏中显著较高的基因诱导（数据未显示），排除了这些p53靶基因的诱导实际上并不低，只是在衰老小鼠中较慢的可能性。
衰老小鼠中p53转录活性降低。对不同年龄（M，月龄）的性别匹配的C57BL/6小鼠进行5 Gy IR处理，并于IR后6h处死小鼠。实时PCR检测IR前后脾脏中p53靶基因的mRNA表达。每个基因的相对诱导倍数计算为辐照小鼠与同龄未辐照小鼠的mRNA表达水平。所有表达水平均归一化为肌动蛋白。每组至少使用五只小鼠。
表1。
衰老C57BL/6雌性小鼠不同组织中p53转录活性降低
| 组织 | 年龄，月 | 基因
|
|---|
| p21基因 | MDM2型 | 细胞周期蛋白G1 |
|---|
| 肾 | 6 | 22.4 ± 1.9 | 2.8 ± 0.4 | 5.8 ± 0.8 |
| 20 | 12.2 ± 4.3 | 1.9 ± 0.7 | 2.7 ± 1.1 |
| 胸腺 | 6 | 17.4 ± 1.7 | 2.1 ± 0.3 | 6.2 ± 0.7 |
| 20 | 7.6 ± 2.3 | 1.8 ± 0.6 | 4.0 ± 1.0 |
| 心脏 | 6 | 15.1 ± 0.7 | 2.2 ± 0.4 | 1.7 ± 0.3 |
| 20 | 6.0 ± 1.4 | 1.6±0.8 | 1.8 ± 0.6 |
| 肺 | 6 | 10.2 ± 1.8 | 3.5 ± 0.7 | 7.4 ± 1.2 |
| 20 | 6.3 ± 1.6 | 2.4 ± 0.6 | 5.8 ± 1.7 |
| 大脑 | 6 | 10.5 ± 1.1 | 1.6 ± 0.3 | 2.1 ± 0.3 |
| 20 | 5.4±0.9 | 1.0±0.2 | 1.3 ± 0.2 |
| 小肠 | 6 | 4.1 ± 0.7 | 3.2 ± 0.6 | 5.7 ± 0.8 |
| 20 | 2.8 ± 1.2 | 2.2 ± 0.7 | 3.8 ± 1.0 |
| 肌肉 | 6 | 9.1 ± 1.8 | 2.2 ± 0.3 | 1.4 ± 0.2 |
| 20 | 6.6 ± 2.0 | 2.1 ± 0.5 | 1.5 ± 0.2 |
| 皮肤 | 6 | 2.9 ± 0.7 | 2.7 ± 0.8 | 2.4 ± 0.6 |
| 20 | 2.0 ± 0.8 | 1.5 ± 0.7 | 1.4 ± 0.8 |
在其他近交系小鼠（包括DBA2和BALB/c）中也观察到p53转录活性随年龄的下降。与C57BL/6小鼠的观察结果一致，IR对DBA2和BALB/c系雄性和雌性老年小鼠脾脏中这些p53靶基因的诱导显著降低()表明这种p53转录活性降低是衰老小鼠的普遍现象。总之，这些数据清楚地表明，p53转录活性，或者更准确地说，mRNA的稳态水平，在衰老小鼠中显著降低。
表2。
衰老BALB/c和DBA2小鼠脾脏中p53转录活性降低
| 基因 | BALB/c公司
| 数据库A2
|
|---|
女性
| 男性
| 女性
| 男性
|
|---|
| 6个月 | 23个月 | 6个月 | 24个月 | 6个月 | 20个月 | 6个月 | 20个月 |
|---|
| p21基因 | 20.2 ± 3.7 | 12.4 ± 3.6 | 23.0 ± 2.1 | 10.2 ± 3.6 | 61.3 ± 5.1 | 35±6.7 | 42.5±4.9 | 16.0 ± 4.0 |
| MDM2型 | 5.2 ± 0.7 | 2.1 ± 1.1 | 7.8 ± 1.0 | 2.5 ± 1.2 | 4.7 ± 0.6 | 3.0 ± 1.3 | 6.2 ± 0.8 | 3.9 ± 1.1 |
| 细胞周期蛋白G1 | 6.3 ± 1.1 | 3.4 ± 1.0 | 7.3 ± 1.4 | 4.0 ± 1.5 | 8.9 ± 0.7 | 5.2 ± 1.6 | 10.8 ± 1.4 | 6.2 ± 1.8 |
| 彪马 | 11.6 ± 2.0 | 4.0 ± 1.7 | 12.2 ± 1.2 | 4.1 ± 2.0 | 17.4 ± 1.9 | 10.2 ± 3.2 | 12.9 ± 2.1 | 6.7±2.3 |
| Bax公司 | 4.6 ± 0.9 | 2.1 ± 0.8 | 6.4 ± 1.2 | 3.1 ± 1.8 | 7.8 ± 0.7 | 4.2 ± 1.7 | 6.5 ± 1.0 | 3.7 ± 1.3 |
| Fas公司 | 4.8 ± 0.5 | 1.8 ± 0.7 | 4.6±0.7 | 2.8±0.8 | 5.2 ± 1.0 | 2.2 ± 0.8 | 4.7 ± 0.6 | 2.5 ± 1.0 |
这些数据还清楚地表明，雄性和雌性C57BL/6小鼠p53转录活性下降的起始年龄不同；男性的寿命比女性晚。男性在28个月时观察到下降，而不是20个月时，而女性在20个月已经观察到下降(). 有趣的是，几项针对大量小鼠的研究报告称，C57BL/6雄性比雌性寿命长2-3个月(10,11). 本研究中使用的C57BL/6小鼠来自美国国家老龄研究所/美国国立卫生研究院（马里兰州贝塞斯达），具有相同的性二型寿命(www.nia.nih.gov/researchinformation/scienceficresources/agedrodentcolonieshandbook/strainsurvivalinformation.htm). 这一发现表明，这种p53转录活性下降的发病年龄与C57BL/6小鼠的寿命相关，而不仅仅与它们的年龄相关：寿命更长的小鼠延迟了p53活性下降的发生时间。在寿命短于C57BL/6（≈2个月）的DBA2小鼠中进行了类似的观察；DBA2男性（20个月龄）的p53转录活性比C57BL/6男性更早下降().
衰老小鼠p53依赖性细胞凋亡降低。
p53的主要功能之一是诱导细胞凋亡以应对应激。为了研究p53诱导细胞凋亡的功能是否也随着年龄的增长而下降，年轻和衰老小鼠被照射（5 Gy）；然后分离脾细胞，并使用流式细胞仪中的Annexin V染色检测凋亡细胞。在6个月大的C57BL/6小鼠中，脾细胞在IR作用下发生p53依赖性凋亡（IR后6小时和24小时的凋亡细胞分别为30–35%和20–25%），并且在IR中很少有细胞（<5%）死于凋亡第53页−/−C57BL/6小鼠(A类和B). 28月龄雄性和20或25月龄雌性小鼠的脾脏中观察到的凋亡细胞明显少于年轻小鼠( A类和B). 这些结果通过TUNEL测定得到证实；IR后6h，6月龄、20月龄和25月龄雌性小鼠的凋亡细胞数分别为45±6%、25±8%和20±8%(D类). 在老年DBA2和BALB/c小鼠中观察到类似结果(C). 这些结果表明，p53在细胞凋亡中的功能随着年龄的增长而下降。20个月龄雄性和雌性C57BL/6小鼠对IR的凋亡反应存在明显差异( A类和B); 与幼年小鼠相比，雌性小鼠的凋亡反应较差，而雄性小鼠在20个月龄但不是28个月龄时的凋亡反应仍与幼年鼠非常接近。这些数据与20个月龄雄性和雌性C57BL/6小鼠之间观察到的p53转录活性差异一致，这进一步表明p53功能下降的发病年龄与这些小鼠的寿命相关。
衰老小鼠p53依赖性细胞凋亡减少。用5 Gy IR处理不同年龄（M，月龄）的性别匹配的C57BL/6、BALB/c和DBA2小鼠，处死小鼠，于IR后6和24 h收集脾组织(A–C)分离脾细胞，用Annexin V染色，并在流式细胞仪中分析以检测凋亡细胞。(D类)TUNEL法用于检测C57BL/6小鼠福尔马林固定的脾脏组织中的凋亡细胞。
衰老小鼠对IR反应时p53蛋白积累减少。
这些结果表明，p53介导的转录和凋亡在老年小鼠中均减少，因此p53对应激反应的效率随着年龄的增长而下降。为了进一步研究衰老小鼠p53功能下降的机制，采用ELISA和Western blotting检测p53蛋白水平。老年小鼠对IR反应的p53蛋白稳定能力显著下降；幼年C57BL/6小鼠在IR后6 h脾脏中p53蛋白水平被诱导约7–8倍，而老年小鼠仅为2–3倍( A–C). 在DBA2和BALB/c小鼠中观察到类似的结果( D类和E类). 这些数据再次表明，20个月大的雄性和雌性C57BL/6小鼠在p53蛋白稳定性方面存在明显差异。
衰老小鼠IR后p53蛋白积累减少。用5 Gy IR处理不同年龄（M，月）的性别匹配的C57BL/6、BALB/c和DBA2小鼠，并在IR后6h处死(A类,B,D类、和E类)和蛋白质印迹(C)分别测量IR前后脾脏中的p53蛋白水平。相对诱导倍数计算为受照小鼠与6个月龄未受照同性别小鼠的p53蛋白质水平。
6个月龄和20个月龄C57BL/6小鼠的p53基础蛋白水平保持在相同水平，并在其寿命的后期下降（≈40–50%），这在25个月龄雌性和28个月龄雄性小鼠中观察到( A类和B). MDM2是p53蛋白的关键负调控因子，其基本表达水平在年轻和衰老小鼠的蛋白质水平上没有显著差异()或mRNA（数据未显示）。两种p53泛素连接酶Cop1或Pirh2的基础mRNA水平无差异(12,13)在年轻和老龄C57BL/6小鼠之间观察到（数据未显示）。这些结果表明，衰老过程中p53功能的下降并不是由p53负调控因子（包括MDM2、Cop1或Pirh2）的基础表达上调引起的。
衰老小鼠ATM激酶功能降低。(A类)用5 Gy IR处理不同年龄的性别匹配的C57BL/6、BALB/c和DBA2小鼠，并用Western blotting检测IR前后脾脏组织中不同基因的蛋白质水平(B–D类)不同基因的基础蛋白水平(B和D类)和ATM的mRNA水平(C)分别用Western blotting和real-time PCR在未受照射小鼠的脾组织中检测。ATM的表达水平归一化为肌动蛋白。
降低共济失调毛细血管扩张突变（ATM）激酶在衰老小鼠中的表达和功能。
ATM激酶是p53应激反应的重要且研究最深入的上游介质之一。IR通过诱导1981年Ser-1981 ATM激酶的自磷酸化激活ATM诱导的双标记DNA断裂(14). 激活的ATM激酶在Ser-395磷酸化MDM2，在Ser-15磷酸化p53，这是p53对IR的反应激活的初始步骤，然后导致p53蛋白的稳定(15). 人类和小鼠的ATM功能缺陷会导致p53功能缺陷和对IR反应的延迟，也会导致过早衰老(16). 如所示 A类和B在年龄较大的雄性（28月龄）和雌性（20月龄）C57BL/6小鼠中，总ATM蛋白水平和IR后决定ATM激酶活性的Ser-1981磷酸化显著降低。与该观察结果一致，IR后，老年小鼠中p53 Ser-18（相当于人类Ser-15）的磷酸化水平显著降低。在年龄较大的C57BL/6小鼠中检测到ATM的mRNA水平显著降低（降低50–60%）(C). 在老年DBA2和BALB/c小鼠中观察到类似结果( A类和C). 这些数据表明，ATM功能降低对衰老过程中p53对IR的反应效率有显著影响。在C57BL/6小鼠中，与20个月大的雄性和雌性之间p53反应的差异一致，雌性与同龄雄性相比，在IR反应中，Ser-1981的ATM蛋白和磷酸化水平显著降低( A类和B)，这进一步表明ATM功能的下降是p53对IR的反应随着年龄的增长而下降的主要原因。
p53通路活性随年龄的下降并不是由所有信号转导通路随年龄的普遍下降引起的。另外两种信号转导途径IGF-1-AKT和mTOR在长寿调节中起作用(17)和肿瘤发生，并在应激条件下受p53负调控(18,19)在p53通路效率已经显著下降的同一年龄段保持相同的活性。在20个月大的雌性C57BL/6小鼠中第页-AKT（473型）和第页-分别决定AKT和S6K活性的S6K（Thr-389）与6个月大的小鼠保持相同，AKT和S6K的总蛋白水平也保持不变(D类). DBA2中观察到类似结果(D类)和BALB/c小鼠。这两条通路的活性确实随着年龄的增长而降低，但与ATM和p53通路相比，在小鼠的寿命中要晚得多。AKT和S6K的总蛋白水平以及第页-AKT（473型）和第页-25个月龄女性的S6K（Thr-389）显著降低(D类)和28个月龄雄性C57BL/6小鼠（数据未显示）。显然，随着年龄的增长，不同的信号转导途径功能下降的速度不同。这一观察结果往往消除了以下解释：小鼠的所有系统都会随着年龄的增长而衰退，而这种普遍的低效率是导致观察到的p53活性下降的原因。
衰老小鼠对各种应激信号的p53反应降低。
p53蛋白可以被各种应激信号激活。压力信号的性质决定了基因表达反应，并最终决定了暴露的结果。因此，在衰老过程中研究p53功能是否也受到应激信号（IR除外）的影响是很有意义的。我们首先测试了从小鼠分离的培养脾细胞是否可以用整个小鼠IR模拟p53反应的实验结果。在幼年野生型小鼠经IR处理的脾细胞中观察到p53靶基因的明显依赖性诱导和凋亡( A–C); 这些基因没有诱导或边缘诱导（<2倍），并且在第53页−/−脾细胞（数据未显示）。p53在转录中的作用(A类)和凋亡(C)老年小鼠脾细胞显著减少，这与p53蛋白积累水平显著降低密切相关(B). 这些结果与在整只小鼠中进行的实验一致，表明培养的脾细胞可以用来模拟体内p53功能实验。这些数据强烈表明，幼年和老年小鼠对IR的p53反应效率不同是由于细胞的不同性质，而不是不同的体内细胞或组织的微环境。该实验还排除了幼年和老年小鼠的体型或体脂差异影响IR效率的可能性。
从衰老小鼠分离的培养脾细胞对各种应激信号的p53反应降低。从6月龄和21月龄雌性C57BL/6小鼠分离脾细胞，并暴露于各种应激信号。(A–C)用IR（5Gy）处理细胞，并在IR后6h收集(A类)用实时PCR检测mRNA水平。用肌动蛋白归一化后，基因诱导倍数计算为辐照细胞与未辐照细胞的基因表达水平。(B)用ELISA法检测p53蛋白水平。(C)在流式细胞仪中通过膜联蛋白V染色检测凋亡细胞。(D–F型)从2个月大的p53−/−或p53+/+中分离脾细胞(D类)和6个月大或21个月大(E类和F类)雌性野生型C57BL/6小鼠，暴露于足叶乙甙（ETP，10μM，持续10 h）、阿霉素（ADR，200 ng/ml，持续24 h）、ALLN（10μM）、放线菌素D（ACTD，2 nM，持续24小时）或紫杉醇（20 nM，连续24 h）。Annexin V染色在流式细胞仪中检测凋亡细胞(D类和E类)用ELISA法测定p53蛋白水平(F类). p53蛋白诱导倍数计算为相同小鼠中处理细胞与未处理细胞的p53水平。
用各种应激信号处理脾细胞，研究衰老小鼠的p53反应。压力信号包括：(我)依托泊苷和(ii（ii）)阿霉素和IR都能诱导双链DNA断裂；(三)放线菌素D水平低，阻碍核糖体RNA合成；(iv（四）)泛素介导的26S蛋白酶体降解抑制剂ALLN；和(v（v）)紫杉醇能破坏微管。每一种应激信号诱导的细胞凋亡都与p53相关：第53页+/+脾细胞与第53页−/−从C57BL/6雌性小鼠（2个月大）中分离出的(D类). 凋亡细胞的数量(E类)p53蛋白积累水平(F类)应激后，从老年雌性C57BL/6小鼠分离的脾细胞均显著低于年轻小鼠。有趣的是，年轻和老年小鼠的p53反应（包括凋亡和p53蛋白积累）因不同的应激信号而不同。IR、足叶乙甙、阿霉素和ALLN的差异最大，而放线菌素D和紫杉醇的差异较小。这些数据表明，在衰老过程中，不同信号通路的效率下降程度不同，这再次表明，衰老过程对细胞中所有p53介导的反应的作用并不相同，这里的观察结果并不是小鼠所有功能普遍下降的结果。用葡萄糖饥饿或AMP激酶激活剂AICAR进一步处理脾细胞，以关闭mTOR通路(20). S6K活动（第页-通过蛋白质印迹检测到的Thr-389）在年轻和老年小鼠的脾细胞中降低到相似的程度（数据未显示），这表明当p53对许多其他p53介导的应激的反应已经显著降低时，21个月大的小鼠对营养饥饿的mTOR活性保持正常。
讨论
人们提出了几种不同的理论来解释为什么所有动物和植物都会随着时间而衰老。遗传理论认为生物体的寿命是由许多基因的不同等位基因组合而成的(21). 通过降低IGF途径活性的突变，蠕虫、苍蝇和小鼠有可能延长其平均寿命(17). 这些观察结果将该基因网络（IGF-1、AKT和mTOR）的特征明确的作用与能量代谢、代谢率和热量限制联系起来，这也延长了动物的寿命(17,22). 同样，Sir-2同源基因水平的增加延长了寿命，并将代谢过程与基因表达模式的遗传控制联系起来(22). 如果野生菌株果蝇属在它们生命周期的后期繁殖，那么这些种群的寿命就会延长(23). 因此，生育后代的年龄可以反馈并选择具有延长寿命的等位基因的人群。同样，肿瘤等疾病也会在许多生物体生命周期的最后四分之一出现，包括小鼠、狗和人类(1). 几乎没有证据表明，这种观察是这些动物代谢率的结果，甚至是致癌基因或抑癌基因中发生的不同突变数量导致癌症的结果。相反，影响突变率的DNA修复过程和可以消除突变细胞的凋亡过程，以及可能有助于消除或预防某些（病毒诱导的）肿瘤的免疫系统，都会随着年龄的增长而下降，尤其是在生物体寿命的最后四分之一(8,9).
反对基因决定寿命的主要论点之一是，进化选择在产生后代后停止作用，这会导致环境和内部熵力，使生物体的效率降低，并容易发生疾病。因此，在这个理论中，随机过程决定寿命。每个物种都有一个相似的函数，它描述了种群寿命的曲线，只有平均死亡年龄的差异是物种特有的。在这种情况下，脊椎动物延长寿命的策略是让成年人保留使用干细胞池再生许多组织的能力。只有当干细胞数量减少时，生物体才会衰老。表达高于野生型p53蛋白水平的小鼠对癌症更具抵抗力，但由于这些干细胞亚群的凋亡率较高，它们会在较年轻的时候死亡(24,25). p53蛋白过少的小鼠因未能消除含有突变的干细胞而早死于癌症(6).
癌症被认为主要是老年人的疾病，因为它需要时间在身体的单个细胞中积累一系列突变，然后才能发展成克隆性肿瘤。在这些肿瘤细胞的基因组中检测到数百个错误，其中一些可能是导致肿瘤的原因(26). 这项研究提供了癌症发病较晚的第二个原因。p53通路的效率随着年龄的增长而下降，这是机体寿命的函数。p53通路确保了细胞周期分裂期间事件的保真度，并对可能导致细胞分裂突变和错误的压力作出反应(5). p53蛋白的缺失会导致基因组不稳定和肿瘤。DNA损伤（IR）后，ATM激酶检测DNA断裂并通过磷酸化向p53和MDM2发出信号，这导致MDM2活性降低，p53水平和活性增加(14,15). 这种激活的p53转录了一系列导致细胞周期停滞、衰老或凋亡的基因。这项工作表明，由于ATM激酶活性较低，导致p53 Ser-15磷酸化较少，因此在老年小鼠中无法有效检测到某些类型的DNA损伤。p53对六个不同基因的转录均显著降低，包括参与凋亡、细胞周期阻滞和衰老的基因，这表明这些数据的可重复性。这些结果为老年人细胞凋亡减少提供了一种机制(27)这是一个普遍的现象，来自几个近交系小鼠的各种组织显示出相同的结果，而几个不同的应激信号都未能强有力地激活p53功能。有趣的是，在包括脾脏、心脏、肺、胸腺、肾脏、肝脏和皮肤在内的所有受试组织中，衰老C57BL/6小鼠的脾脏在IR反应中表现出ATM mRNA表达和p53蛋白积累水平的最严重降低（数据未显示），这可能是脾脏淋巴瘤是衰老C57BL/6小鼠中最常见的肿瘤的原因之一。
这种下降不仅仅是因为熵力平等地作用于小鼠的所有信号转导途径。与IGF-1-AKT-mTOR途径相比，p53途径的效率在更早的年龄下降。此外，C57BL/6小鼠p53通路效率的下降与这些小鼠的寿命有关；男性的寿命比女性长，p53功能的下降在男性中发生的时间晚于女性。这种与p53功能下降有关的性别二型性暗示了激素对这一过程的调节。在人类中，女性比男性寿命更长，在更大的年龄患上癌症，这表明癌症的发病年龄和寿命之间存在类似的联系。本研究的结果表明，p53通路的效率随着年龄的增长而下降，预测了老年人突变（由DNA修复下降引起）和突变固定（由p53介导的凋亡下降引起）的增加率，特别是在应激反应中。这种p53功能的下降，以及一生中累积的突变，可以解释为什么年龄较大的个体细胞分裂的保真度较低，错误率较高，肿瘤发生率较高。
材料和方法
小鼠应变和IR。
C57BL/6、BALB/c和DBA2小鼠购自美国国家老龄研究所/美国国立卫生研究院（马里兰州贝塞斯达）。年龄和性别匹配的小鼠接受5 Gy的137 Csγ源全身IR。在IR后的不同时间处死小鼠，并采集不同组织进行进一步实验。每组至少使用五只小鼠。
脾细胞的制备和治疗。
通过在两块磨砂玻璃载玻片的磨砂端之间挑开脾细胞来分离脾细胞。用Tris·NH耗尽红细胞4Cl溶液（17 mM Tris·HCl/0.83%NH4Cl），并在含有10%FBS和5×10的RPMI培养基1640中培养细胞−3mM 2-巯基乙醇。ALLN购自Calbiochem（加利福尼亚州拉荷亚）。放线菌素D、阿霉素和紫杉醇购自西格玛（密苏里州圣路易斯）。用不同剂量的这些化学物质或IR处理细胞不同时间。
Western Blot分析和ELISA。
采用标准Western blotting分析蛋白质表达。本实验室制备了MDM2抗体（2A10）。Anti-p53（FL393）（sc-6243）和Anti-ATM（sc-23921）购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。抗磷ATM（Ser-1981）（4526）、抗磷p53（Ser-15）（9284）、抗S6K（9202）和抗磷-S6K（Thr-389）（9206）购自Cell Signaling（Danvers，MA）。抗β-肌动蛋白（A5441）购自Sigma。根据制造商的说明，使用小鼠总p53 ELISA试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）检测小鼠组织中的p53蛋白水平。
定量实时PCR。
用RNeasy试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚市奇亚根）从细胞或小鼠组织中制备总RNA，并用DNase I处理以去除残留的基因组DNA。在7000 ABI序列检测系统中使用Taqman PCR Mix（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行实时PCR，一式三份。所有引物均购自Applied Biosystems。基因表达归一化为β-肌动蛋白基因。
细胞凋亡的测量。
为了检测凋亡细胞，用Nexin试剂盒（Guava Technologies，Inc.，Hayward，CA）中的Annexin V对脾细胞进行染色，并根据制造商的说明在流式细胞仪（Guava-Technologies公司）中进行分析。采用TUNEL法检测在10%中性福尔马林缓冲溶液中固定24小时的脾组织中的凋亡细胞。
致谢
这项工作得到了乳腺癌研究基金会和国家癌症研究所（CA087497）的资助。
工具书类
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