重新审视小鼠线粒体DNA序列

摘要

简介

来自L细胞株衍生克隆LA9细胞系的mtDNA是第一个测序的小鼠mtDNA(1)并被视为标准参考（以下简称为LA9¹⁹⁸¹). 母体L菌株于20世纪40年代从100天龄雄性C3H/An小鼠的正常皮下气膜和脂肪组织中产生(2). 然而，自其发表以来，已经报告了一些小鼠mtDNA全序列，显示出与LA9参考的重要差异（表​（表1）。1). 这些差异可能是由于小鼠群体中存在多态性、LA9细胞系培养过程中获得的突变或测序错误所致。由于人类mtDNA相关疾病的小鼠模型开始产生(三——5)，并且由于该序列用于系统发育研究，包括比较分析，以估计人类mtDNA变体的潜在致病性，因此澄清这些不确定性具有重大意义。

从活体动物中获得的信息可用于10种不同mtDNA的完整序列小家鼠菌株。这些是：（i）C3H/He和其他六个属于B组（Castle's小鼠）小鼠近交系的菌株(6)[答/日(7)，新西兰B/B1NJ(8)、AKR/J及其衍生菌株SAMR1、SAMP1和SAMP8]；（ii）来自a组（瑞士小鼠）NOD/LtJ近交系NOD的同源衍生物。非H2^nb1型/左J(7); （iii）自发突变菌株SKH2/J(7); 和（iv）Mil P小鼠品系，是在意大利帕维亚附近捕获的一只野生雌性小鼠的后代(8). 我们在这里报告了另两个小鼠近交系的mtDNA序列，Balb/cJ，B组近交系(6)，在萨拉戈萨大学测序，以及E组近交系C57BL/6J(6)桑格研究所（Sanger Institute）从用于小鼠核基因组测序的相同DNA来源获得。此外，我们对LA9细胞株mtDNA（以下称为LA9）进行了全序列测定²⁰⁰²)和一个额外的L衍生细胞克隆（L929）mtDNA。

材料和方法

多态性分析

量化CoI公司通过RFLP分析获得6589个突变钕6C插入是通过引物延伸的等位基因特异性终止进行的，如其他地方所述(10)。

要确认CoI公司A6063C突变，进行RFLP分析。因此，使用以下引物通过PCR扩增出198 bp的片段：（i）Fw，GCATCTGTTCTGATTCTTGGCACGAGAGTTAAAATT（位置6023–6062，正向引物携带由小写字母a指示的不匹配）；（ii）版次，TCTAATCCTACTGTGAATTtTGGGGCTC（位置6190–6220，反向引物携带小写字母t指示的不匹配，以创建内部限制位点）。

引物产生的突变与C6063野生型版本一起为AcsI创造了两个识别位点，并在用这种酶消化后产生143、36和19 bp的三条带。当出现突变时，产生143和36 bp条带的限制性位点被破坏，出现179 bp的新条带。因此，分析中存在AcsI完全消化的内部控制。片段在5%聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳进行分析。注意，图中丢失了19 bp的频带​图11B。

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图1

LA9私人突变的RFLP确认和异质性程度(A类和F类)和L929 mtDNA(B类和C类)和在C57BL/6J mtDNA中检测到的特异性多形性瘤(D类和E类). 每个面板下的数字表示负责RFLP的核苷酸位置。材料和方法中描述了扩增产物和使用的不同限制性内切酶。

对于第三版合同A9348G多态性分析，用以下引物PCR扩增出一个含有9348位点的385 bp片段：（i）Fw，CGAAACCATAAATCAAGCCC（位置9072–9093）；（ii）CTCTCTTCTGGGTTATTCAGA版本（位置9435–9456）。

G9348版本为AspI生成一个识别位点，而当多态性A9348存在时，该限制位点被破坏。在含有0.5µg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中通过电泳观察片段。

这个钕3RFLP分析证实C9461T多态性。因此，使用以下引物通过PCR扩增出包含9461位点的204 bp片段：（i）Fw，TTCCAATTAGTAGATTCTCTGAAAAACCCAGAAGAGAGGTAT（位置9420–9460，正向引物携带由小写g指示的错配）；（ii）版本：AAATTTTATTGAGAATGGTAGACG（位置9600–9623）。

将引物产生的突变与C9461野生型结合，产生BclI的识别位点。因此，T9461多态性的存在破坏了限制位点。片段在5%聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳进行分析。

要检查钕2LA9中存在4794T多态性²⁰⁰²用以下引物PCR扩增出148 bp的片段：Fw，ACTCATACATAGCTCTATAAACCTATTTTAT（位置4753–4792，正向引物携带由小写字母a指示的错配）；版次：TAGGGTGGAAAAATATTTAGGTGGG（位置4877–4900）。

这个148 bp的扩增子包含两个SspI限制位点，产生三个72、63和13 bp的DNA片段。此外，在LA9中，PCR产生的突变与T4794版本结合²⁰⁰²细胞系产生SspI的第三个识别位点，而当存在C4794多态性时该限制性位点不存在。新的限制位点允许剪切72 bp的带，从而产生40和32 bp的带。请注意，图中丢失了13 bp的频带​图1A。1A.在10%聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳观察碎片。

要分析钕5LA9中存在T12049C多态性²⁰⁰²（相当于C57BL/6J中的12048）用以下引物扩增出包含该位点的174 bp片段：Fw，CTGTAGCCTTTGTCACATGATATATATAGAAA（位置12013–12047，正向引物携带由小写g表示的不匹配）；版次：TTCCCACCCTTCTCAGCCAATG（位置12 164–12 186）。

这种PCR产生的突变为EcoRI创造了一个识别位点，该位点在LA9中被破坏²⁰⁰²细胞系（12049C）。使用5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析产生的限制性片段。

结果

不同小鼠株mtDNA的比较表明，只有NZB/B1NJ和Mil P mtDNA的序列与LA9有很大差异¹⁹⁸¹mtDNA（身份=16 197，NZB/B1NJ有12个缺口；恒等式=16 202，Mil P为12个间隙），并且相互之间（恒等式=16 236，没有间隙）。相反，所调查的所有其他小鼠菌株的mtDNA序列相互之间以及与LA9非常相似¹⁹⁸¹mtDNA（表​（表1）。1). 有趣的是，就近交系而言，这些线粒体DNA之间预测的进化关系（数据未显示）与它们的系谱非常吻合(6). 这一观察结果强烈表明，除NZB/B1NJ外，所有调查的近交系都有一个最近的共同雌性祖先，无论它们属于a组（瑞士小鼠）、B组（卡斯尔小鼠）还是E组（C57相关系）(6)。

如表所示​表1，1除一个位点外，C3H/He、Balb/cJ、A/J和NOD/LtJ自交系衍生的线粒体DNA在所有位点上都是相同的tRNA^精氨酸基因（LA9中的9818位¹⁹⁸¹序列和9821在其余近交系小鼠序列中的位置）。这种差异主要是由于tRNA^精氨酸DHU-loop，在小鼠中似乎是一个高度多态性位点(7). 除此基因座外，其他小鼠品系与前一组的差异仅在于一个（AKR/J和SKH2/J）、两个（SAMR1和C57BL/6J）、四个（SAMP1）或五个（SAMP8）额外碱基。值得注意的是，线粒体DNA的非编码区（也称为D型回路)在所有这些小鼠菌株中，它们是相同的，但与遗传距离较远的小鼠菌株NZB/B1NJ和Mil P不同（前者有8个错配和1个核苷酸缺口，前者有9个错配，Mil P有1个核苷酸间隙，而NZB/B1NJ与Mil P之间有7个错配且没有缺口）。虽然mtDNA非编码区严格保守，但相关小鼠菌株之间编码序列的变化与人类mtDNA中所描述的情况形成鲜明对比(11以及其中的参考）。

值得一提的是，相关小鼠近交系的核苷酸数量在16299到16301 bp之间，差异是由于As在tRNA^精氨酸DHU回路。此外，在无关菌株NZB/B1NJ和Mil P中，在tRNA^赛斯T环（数据未显示）和线粒体DNA非编码区中的一个核苷酸(D回路)这将序列的大小扩大到16303bp。

小鼠近交系mtDNA序列与LA9的比较¹⁹⁸¹揭示了15个位点的差异：8个位于开放阅读框（ORF），4个位于tRNA或rRNA基因，只有3个位于D回路值得注意的是，ORF中只有一个取代是沉默的，其余的引起在两个蛋白编码基因的阅读框中插入一个完整的密码子(钕3和Nd4升)以及五个位点中一个氨基酸的替代（表​（表2）。2). 事实上LA9¹⁹⁸¹缺少两个完整的密码子，在多态性位点上只有八个AstRNA^精氨酸DHU-loop解释了其mtDNA的较短大小（16295 bp）。不同来源线粒体DNA的大小变化使得对其比较的描述变得复杂。因此，为了避免混淆，我们选择给出我们正在评论的序列的实际编号，如果不同，则按照相应的LA9编号¹⁹⁸¹括号中。

原则上，LA9之间的差异¹⁹⁸¹近交系小鼠株可能表明LA9 mtDNA和迄今为止描述的其他近交系的遗传来源不同，NZB/B1NJ mtDNA似乎也是如此。线粒体DNA的差异可以加强这种解释D回路顺序。然而，有趣的是D回路区域，在远缘菌株NZB/B1NJ和Mil P的mtDNA之间也保守。这增加了LA9之间差异的可能性¹⁹⁸¹并且小鼠衍生的序列可能是由于在细胞培养的寿命期间获得的多态性，或者是由于早期测序中的测序错误。

为了区分这两种可能性，我们对LA9细胞株mtDNA（以下称为LA9²⁰⁰²)和一个额外的L衍生细胞克隆（L929）mtDNA。L929细胞克隆（ATCC CCL-1）于1948年通过毛细管单细胞分离技术建立，是第一个从亲本L株衍生的细胞系(12). 微卫星分析使我们能够从C57BL/6J、C3H/He、Balb/cJ和CBA/J中区分两个L克隆（LA9和L929），但不能在它们之间进行区分，从而支持它们的遗传关系（数据未显示）。LA9的mtDNA之间的相似性²⁰⁰²、L929、Balb/cJ、C57BL/6J和其他近交系表明，参考序列中检测到的大多数有问题的位点很可能是由于测序错误引起的（表​（表1）。1). 然而，我们在LA9的两个位点发现了相同的核苷酸²⁰⁰²如LA9所述¹⁹⁸¹，与L929和小鼠近交mtDNAs中显示的不同[位置4794在钕2和12 049（12 042）在钕5]. 此外，L929 mtDNA也显示了一些位点[位于CoI公司以及在位置13 887（13 879）处插入C钕6]与LA9不同¹⁹⁸¹，LA9²⁰⁰²和其他已知的小鼠mtDNA序列（表​（表1）。1). 此外，我们无法解决L929和LA9之间的差异¹⁹⁸¹在As的延伸长度中tRNA^精氨酸DHU回路，自LA9²⁰⁰²序列（9个As）不同于L929（10个As）和LA9¹⁹⁸¹（八个As）。为了充分保证获得的序列信息的准确性，并确定观察到的变异的异质性或同质性，所有差异位置都通过RFLP分析进行了确认（图。​（图1）1)或等位基因特异性引物延伸终止（图。​（图2）。2). 我们在L929 mtDNA中检测到了异质性位点（位于CoI公司)，温度为18%_重量和82%A_公吨（图。​（图1B）。1B） ●●●●。此外，L929长度多态性是由于在基因的第13887（13879）位插入了一个C而引起的钕6该基因被发现是异质的，它存在于52%的线粒体DNA分子中（图。​（图2B）。2B） ●●●●。L929的额外私人多态性（位于CoI公司)或LA9[位置4794 in钕2和位置12 049（12 042）在钕5]在RFLP分析的分辨率范围内是同质的（图。​（图1A，1A、 C和F）。所有这些变异都代表培养中获得的克隆特异性突变(10,13)。

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图2

等位基因特异性引物延伸终止试验旨在确定在tRNA^精氨酸基因(A类)，的钕6基因(B类)和L链复制源(C类). 注意，（A）中C3H mtDNA样本的延伸长度不能超过1 nt，因为其特殊的四个Ts+九个As序列，而其余样本含有三个Ts+n个作为，具有n个=八、九或十。（A）和（C）中没有标签的线表示未延伸的底漆。在（B）或（C）中标记为7/C、11/A或12/A的线表示在各自的多态性轨道中对七个Cs或11或12As的控制。

RFLP分析证实了两个C57BL/6J特异性多态性也是同质的（图。​（图1D1D和E）。有趣的是，我们在Balb/cJ线粒体DNA序列中没有发现任何异质性位点，但我们在桑格研究所的C57BL/6J序列中发现了一个长度轨迹多态性位点，由11或12个As组成（起始位置5172）在一个短的非编码片段中提议包含mtDNA L链的复制起源(14). 等位基因特异性引物延伸终止（图。​（图2C）2C） 证明该基因座在一个无线粒体DNA的细胞系的DNA样本中是同质的，该细胞系重新填充了来自C57BL/6J、Balb/cJ或CBA/J小鼠血小板的线粒体DNA(10,15). 然而，在从C57BL/6J小鼠肝脏和C3H/He小鼠衍生细胞中分离的DNA样本中，该位点是11和12 As的异质性（图。​（图2C）。2C） ●●●●。请注意，该图中10As处的终止信号是由于携带10As的核假基因引起的（未发表的结果）。在人类中也记录到了单个个体mtDNA非编码区的类似异质体长度变异(16). 最后，结合测序分析和等位基因特异性引物延伸终止，我们可以确认在tRNA^精氨酸DHU回路：As拉伸的长度变化（图​（图2A2A和​和3），三)以及由九个as加一个T组成的C3H/He衍生细胞的特定序列（图。​（图3三)。

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图3

代表性色谱图，说明小鼠mtDNA-编码的高度多态性位点中迄今描述的各种可行序列tRNA^精氨酸基因。每个面板上都标明了DNA的来源。

应该指出的是，尽管确认的错误有很多(10)Bibb及其同事在20世纪80年代早期进行的测序工作提供了一个非常高质量的序列，错误频率仅为0.08%。

讨论

根据总体数据，我们认为L929和LA9 mtDNAs都显示出在其生命周期内作为独立克隆获得的固定多态性和异质多态性，而这些多态性很可能在建立L细胞的小鼠中不存在。令人担忧的是，我们已经发现证据证明L929克隆特异性的同质和异质突变对线粒体呼吸链的正常功能具有表型影响(10,15)，这也可能是LA9特异性突变的情况。应特别提及tRNA^精氨酸该基因具有八个As（LA9¹⁹⁸¹、SAMR1、SAMP1、SAMP8和C57BL/6J mtDNAs）、九个As（LA9²⁰⁰²、Balb/cJ、NOD/LtJ、SKH2/J和AKR/J）、九As加一T（C3H/He）或十As（L929、A/J、Mil P和NZB/B1NJ mtDNAs）。有趣的是，最近有报道称，As延伸的长度可以调节与衰老相关的耳聋小鼠核基因座的病理表达(7)。

根据这里提供的数据，由于以下原因，应该重新考虑小鼠mtDNA的参考序列。（i） 它包含七个替换错误，三个单核苷酸插入，一个碱基和两个三联体缺失。（ii）LA9中的两个克隆限制性多态性位置并不代表原始C3H/An小鼠中存在的野生型，它们可能具有致病性。（iii）自LA9以来¹⁹⁸¹，LA9²⁰⁰²和L929在多态性位点上仍存在差异tRNA^精氨酸是小鼠株mtDNA中一个高度可变的基因座，我们无法预测该基因座在原始C3H/An小鼠中更可能的序列。

因此，我们建议将C57BL/6J mtDNA序列作为小鼠参考序列，以获得真正的参考序列而不是共识序列。这样，小鼠核基因组和线粒体基因组的参考序列也会匹配。注意，如果遵循这些建议，小鼠mtDNA参考序列的大小将从16295增加到16299，核苷酸编号应相应修改。

致谢

笔记

DDBJ/EMBL/GenBank登录号⁺AJ489607、AY172335和AJ512208

参考文献