环腺苷酸依赖性蛋白激酶和钙调神经磷酸酶对Drp1可逆磷酸化调节线粒体分裂和细胞死亡

摘要

介绍

线粒体是不断融合和分裂的动态细胞器，正确调节线粒体分裂-融合平衡对细胞的同质化至关重要。事实上，视神经萎缩1（Opa1）和线粒体融合蛋白2（Mfn2）的突变是细胞器内外膜融合所必需的两种线粒体GTPase，分别导致神经退行性疾病(亚力山大等, 2000;德莱特等, 2000;祖克内尔等, 2004)线粒体裂变酶动力蛋白相关蛋白1（Drp1；也是动力蛋白样蛋白1的DLP1）的显性负突变最近与致命的人类出生缺陷有关(沃特汉姆等, 2007).

Drp1是大型GTP酶dynamin家族的成员。Drp1中的功能域包括氨基末端GTPase域和羧基末端GTPase-效应域（GED；图1B)后者参与分子内和分子间的相互作用，并调节GTPase活性(Hoppins公司等, 2007). Drp1通过适配器蛋白（包括线粒体外跨膜蛋白Fis1）从细胞溶质室募集到线粒体。与内吞运动动力素类似，Drp1被认为聚合成环状或螺旋状的上层结构，通过GTP水解依赖机制收缩并最终切断线粒体(Hoppins公司等, 2007). 虽然对细胞器的生物发生是必要的，但依赖于Drp1的线粒体断裂也是细胞凋亡的早期和关键事件，与前凋亡性B细胞淋巴瘤2（Bcl2）家族成员Bax的激活和线粒体外膜的通透性大致一致(Martinou&Youle，2006年).

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图1

Drp1 Ser 656作为PKA磷酸化位点的鉴定。(A类)内源性Drp1是从代谢标记为³²人事军官₄²⁻细胞在收集前用冈田酸（OA，300 nM，2小时）、calyculin A（Calyc A，25 nM，1小时）、毛喉素（20μM，1小时）或载体（对照）处理。条形图显示³²P合并归一化为Drp1水平并相对于对照（平均值±标准偏差n个=3–8个实验，^*P（P）<0.0005（以学生为准）t吨-测试）。(B类)Drp1的域图和可变域（VD）和GTPase效应域（GED；PKA共识下划线）之间边界的序列比对。(C类)GST–图纸1_GED公司（aa 643–755）融合蛋白磷酸化在体外含PKA和[γ-³²P] ATP。(D类)GFP和3×血凝素（HA）标记的野生型（WT）和Ser656Ala Drp1在代谢标记的COS细胞中表达³²P，然后用Drp1抗体免疫沉淀。(E类)3×HA–Drp1（WT/Ser656Ala）与空载体（−）或PKA共表达_c（c）代谢标记COS细胞中的（催化亚单位）³²P并在HA IP后进行分析。Drp1，动力相关蛋白1；绿色荧光蛋白；GST、谷胱甘肽S公司-转移酶；GTP，GTPase结构域；免疫印迹法；MID，中间域；PKA，cAMP依赖性蛋白激酶。

尽管Drp1在线粒体功能中至关重要，但这种膜重塑酶的翻译后调控尚不清楚。先前的工作表明，在Drp1的形态发生活性中，sumoylation和ubiquitination起作用(更努力等, 2004;中村等, 2006;瓦西亚克等, 2007)最近的一份报告在Drp1中发现了一个细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）位点，其磷酸化可能是线粒体网在有丝分裂过程中短暂破裂的原因(田口等, 2007).

在这里，我们在Drp1中确定了一个保守的磷酸化位点，该位点被第二信使依赖性激酶和磷酸酶、环腺苷酸依赖性蛋白激酶（PKA）和钙调神经磷酸酶（也称为蛋白磷酸酶2B；PP2B）靶向。具有去磷酸化和类似磷酸化取代的Drp1突变体对线粒体形态和凋亡敏感性产生相反的影响。我们的结果表明，cAMP可以部分通过抑制Drp1介导存活，Ser 656去磷酸化刺激Drp1的线粒体重构活性对程序性细胞死亡很重要。

结果

Drp1磷酸化抑制线粒体分裂

Drp1组装成二聚体、四聚体和高阶低聚物，低聚物加速GTP水解(Hoppins公司等, 2007). 表达表位标记的Drp1的细胞提取物的化学交联表明，去磷模拟Ser656Ala突变和磷酸模拟Ser656 Asp突变均不影响Drp1齐聚(补充图1A在线）。类似提取物的GTP-琼脂糖下拉试验表明，Ser 656磷酸化对GTP结合没有定性影响(补充图1B在线）。类似地，[γ-³²P] 用重组Drp1进行的GTP水解试验表明，Ser 656磷酸化并不调节Drp1的固有GTPase活性(补充图1C在线）。

为了分析Ser 656磷酸化对Drp1线粒体重组活性的影响，我们将Ser 656突变体Drp1的表达与RNA干扰（RNAi）介导的内源性蛋白沉默相结合。为此，构建了共表达Drp1定向短发夹（sh）RNA和绿色荧光蛋白（GFP）标记的Drp1的质粒，通过shRNA靶序列的沉默突变使其具有RNAi抗性(补充图2A在线）。瞬时转染CV1成纤维细胞，用GFP标记的野生型和突变型Drp1替代内源性Drp1，并通过外荧光图像的数字形态计量学评估线粒体形状的变化。与用野生型GFP–Drp1替代的细胞相比，磷酸化突变体的表达导致线粒体显著伸长，并且通常在核周聚集(图2A、B)可能是因为线粒体融合不平衡。相反的表型——短而分散的线粒体的丰度与Drp1 Ser656Ala相关，表明该突变是超形态的(图2A、B). 这些双向效应最好用Ser 656的磷酸化抑制Drp1的剪断活性来解释。

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图2

磷酸化位点突变体Drp1对线粒体形态的影响。(A类)CV1成纤维细胞免疫荧光标记线粒体的表观荧光显微照片，其中内源性Drp1被野生型（WT）、Ser656Ala和Ser656Asp GFP–Drp1取代（转染细胞概述）。(B类)通过计算机辅助图像分析，量化用WT、Ser656Ala（A）和Ser656Asp（D）GFP–Drp1替代的CV1细胞中的线粒体面积（每个条件下60–80个细胞的六个实验的平均值±标准偏差，归一化为WT）。^*P（P）<0.01,^**P（P）<5×10⁻⁴由学生的t吨-测试。Drp1，动力相关蛋白1；绿色荧光蛋白。

为了在不同的细胞类型中使用不同的方法确认这些结果，我们生成了克隆PC12细胞系，其中内源性Drp1被野生型和Ser 656突变型GFP–Drp1稳定替换(补充图2B在线）。在超薄切片的透射电子显微照片中测量线粒体轮廓，我们发现与野生型相比，Drp1 Ser656Asp-中线粒体的横截面积和长度（主轴）显著增加，而Ser656Ala表达的PC12细胞减少(补充图3C在线）。含有超形态（Ser656Ala）突变体的细胞具有超微结构正常的线粒体，而低形态（Ser6.56Asp）Drp1的表达经常导致线粒体在不同溶解阶段肿胀并伴有线粒体。此外，我们有时注意到Drp1 Ser656As融合细胞内线粒体内外膜分离(补充图3A、B在线）。因此，长时间表达Drp1 Ser656Asp抑制线粒体分裂导致线粒体功能障碍。我们在这些Drp1抑制细胞（数据未显示）中观察到的生长速度较慢和培养基酸化程度增加与ATP生成减少以及从氧化代谢转变为糖酵解代谢相一致。

交感神经活性促进Drp1磷酸化

产生磷酸化特异性Drp1抗体来追踪Drp1活性体内我们将心肌作为PKA活性肾上腺素能调节的典型系统。腹膜内注射β-肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素导致快速剥离的心脏组织中免疫沉淀的Drp1的Ser 656磷酸化可重复增加。接受应激和运动疗法（15分钟强迫游泳）的小鼠在PKA部位也表现出心脏源性Drp1过度磷酸化(图3A).

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图3

细胞中Drp1-Ser 656磷酸化的调节体内. (A类)小鼠接受腹腔注射溶媒或异丙肾上腺素（20 mg/kg；左侧）或强迫游泳或休息15分钟（右侧）。从快速剥离的心肌中免疫沉淀Drp1，并用磷酸特异性抗体分析Ser 656磷酸化（pS656 Drp1）。多条带很可能对应于剪接变体。(B类)用磷酸酶抑制剂FK506（1μM）、环孢菌素A（CsA，1μM⁺/0.1μM BayK8644（25K/BayK）激活L-型Ca²⁺频道。对磷酸化-Ser 656和总Drp1的总裂解产物进行了检测。(C类)用FK506（FK，1μM）或载体预孵育15分钟的PC12细胞用forskolin（10μM）±staurosporine（STS，2μM）处理60分钟，然后按指示对总裂解物进行免疫印迹。(D类)将稳定表达GFP–Drp1 WT或Ser656Ala的PC12细胞与staurosporine（1μM）孵育指定时间（小时），并对总裂解物进行Drp1 Ser 656磷酸化分析。数据代表至少三个独立实验。Drp1，动力相关蛋白1；绿色荧光蛋白；PKA、cAMP依赖性蛋白激酶、pS40 TH、磷酸化-Ser 40酪氨酸羟化酶。

Drp1 Ser 656确定凋亡敏感性

为了研究钙或葡萄孢霉素诱导的去磷酸化和激活Drp1是否与程序性细胞死亡相关，我们转向了内源性Drp1被野生型、Ser656Ala突变和Ser656Asp突变GFP–Drp1取代的PC12细胞系。每个Drp1变异体的两个或三个独立分离克隆用于控制克隆选择人工制品。除GFP–Drp1 Ser656Asp表达的细胞系增殖速度约为其他细胞系的一半外，所有细胞系的细胞形态、生长速度和自发细胞死亡均具有可比性，反映了RNAi耗尽Drp1的HeLa细胞的表型(贝纳德等, 2007). 就对凋亡刺激的敏感性而言，表达野生型GFP–Drp1的细胞株与平行选择的GFP阴性细胞株没有区别（数据未显示）。

低形态和超形态的Drp1突变体对几种凋亡诱导剂的反应对细胞活性表现出相反的影响。尽管存在超微结构异常的线粒体，但表达假磷酸化Drp1亚型（Ser656Asp）的细胞在1μM staurosporine中的存活时间比野生型和Drp1 Ser656Ala表达细胞长得多(图4A). Drp1 Ser656Asp表达细胞对staurosporine的反应也显示caspase活性显著减弱(图4B)对拓扑异构酶抑制剂依托泊苷、钙离子载体A23187和过氧化氢表现出部分抗性。相反，与野生型Drp1相比，组成性去磷酸化的Ser→Ala突变体对同一组损伤具有更高的敏感性（如两个克隆细胞系所示图4C、D和补充图4A在线）。一个例外是化疗药物阿霉素，它具有多效性作用，通过凋亡和非凋亡机制促进细胞死亡(Gewirtz，1999年). 阿霉素在很大程度上不分青红皂白地杀死Drp1基因型的细胞(补充图4B在线）。这些实验表明，Ser 656处Drp1的磷酸化状态设置了凋亡细胞死亡的阈值。

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图4

Drp1 Ser 656决定细胞凋亡敏感性。稳定替代野生型（WT）和Ser 656突变GFP–Drp1替代内源性Drp1的PC12细胞在指定时间内受到攻击(A类)或使用指定剂量的staurosporine或etoposide持续48小时，然后进行caspase活性(B类)和生存能力(A、 C、D)分析。数据（四次测定的平均值±标准偏差）代表三次或三次以上的独立实验。对每个Drp1基因型的两到三个克隆系进行了分析（此处显示两个Drp1 Ser656Ala系以进行比较）。Drp1，动力相关蛋白1；绿色荧光蛋白。

讨论

在这里，我们报道了在大GTPase Drp1中发现的一个保守的磷酸化位点，该位点控制该酶的线粒体切断活性和线粒体依赖性细胞死亡。PKA介导Ser 656磷酸化在体外在完整的细胞中发生，并对交感神经活动作出反应体内钙动员导致该部位的去磷酸化，使用特定抑制剂的研究已确定钙调神经磷酸酶为相关磷酸酶。通过突变为丙氨酸阻断Ser 656的磷酸化使Drp1过度活跃，并使细胞对各种凋亡损伤敏感，而Ser656Asp突变导致的Drp1假磷酸化则具有相反的效果。这些结果强调了Drp1在细胞凋亡中的关键作用，并为线粒体形态发生的第二信使调控提供了分子机制。

尽管Drp1 Ser656Asp表达的PC12细胞的线粒体表现出明显的超微结构异常，但其对凋亡损伤的保护作用可能与直觉相反。然而，我们的发现与Drp1缺失细胞系中报道的凋亡抵抗、增殖障碍和生物能量缺陷相类似(李等, 2004;贝纳德等, 2007)从而支持Ser 656磷酸化灭活Drp1的结论。作为一种癌源性细胞系，PC12细胞适合在厌氧条件下生长。Drp1磷酸化/失活是否促进了糖酵解ATP生成能力较低的原代神经元等细胞的存活尚待研究。

值得注意的是，许多生长因子和激素通过细胞内cAMP水平的变化来调节细胞代谢，Drp1被确定为PKA效应器。虽然线粒体形态和生物能量学之间的关系很复杂(库普曼等, 2005;贝纳德等, 2007)有证据表明cAMP与线粒体重塑有关(阿尔托等, 2002;穆勒等, 2005). 关于PKA在细胞凋亡中的作用，以前的研究表明线粒体相关的PKA活性对细胞生存至关重要(原田等, 1999;阿法塔蒂等, 2003). 我们的研究发现，假磷酸化的Drp1可以减弱细胞凋亡，这意味着Drp1是线粒体PKA的重要生存促进底物。

丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙调神经磷酸酶是胞浆钙流量的主要传感器之一，在免疫细胞和神经系统中具有特别重要和独特的作用(阿兰布鲁等, 2004). 在神经元中，已知会导致胞浆钙大量升高的缺血状态已被证明会使线粒体断裂(Rintoul公司等, 2003;巴尔苏姆等, 2006;扎内利等, 2006). 钙调神经磷酸酶介导的Drp1激活在多大程度上参与了神经元钙超载的病理后遗症，是另一个值得进一步研究的问题。

Ser 656磷酸化通过Drp1活性抑制线粒体断裂的机制尚未解决。尽管磷酸化位点战略性地位于GTPase效应域附近，但我们在体外研究没有显示Ser 656变异体之间寡聚物组装或GTP结合和水解的差异。Drp1磷酸化可能影响酶的亚细胞分布、泛素化或sumoylation和/或与尚未识别的效应蛋白或调节蛋白的关联。

最近在Drp1中发现了一个CDK磷酸化位点，该位点仅位于Ser 656的N端20个残基(田口等, 2007). 有趣的是，相应的丙氨酸突变体Drp1被证明可以促进线粒体伸长，这表明该位点的磷酸化激活了该酶。在缺乏Drp1结构信息的情况下，很难预测CDK和PKA磷酸化位点在三维空间内的距离。然而，相邻磷酸化位点对酶的相反调节已被充分证明(Hudmon&Schulman，2002年). CDK和PKA磷酸化如何对Drp1活性产生相反的影响？也许一个位点的磷酸化阻止了激酶的进入或将磷酸酶招募到另一个位点。事实上，我们的结果暗示了不同的磷酸酶通过多位点磷酸化调节Drp1，因为PP1/PP2A抑制剂增加了总的³²P并入Drp1而非Ser 656磷酸化。不管涉及的确切机制如何，通过多种激酶和磷酸酶对Drp1进行可逆磷酸化，将该酶连接到一个复杂的调节网络中，该网络允许线粒体快速重塑以响应内在和外在信号。

方法

代谢标记和在体外磷酸化。用0.5 mCi/ml对COS细胞或PC12细胞进行代谢标记³²人事军官₄²⁻在含有1%透析胎牛血清的无磷培养基中培养4–5小时，在最后1–2小时内添加抑制剂和激动剂。在裂解缓冲液（1%Triton X-100，150 mM NaCl，20 mM Tris（pH 7.5），1 mM EDTA，1 mM-EGTA，1 m Mβ-甘油磷酸，1 mM-Na）中进行体外表达或内源性Drp1的免疫沉淀_三VO（旁白）₄，1 mM钠₄P（P）₂哦₇，1μM微囊藻毒素-LR，1 mM苯甲基磺酰基氟化物，1μg/ml亮氨酸肽，1 mM-苯甲脒）。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离免疫沉淀物，免疫印迹法检测Drp1并分析³²磷成像仪并入。³²P信号被Drp1化学发光信号分割，以获得磷酸化的相对水平。加载每个样品的几个不同体积，以确保信号在检测的线性范围内。可以在中找到其他方法补充信息在线。

补充信息位于EMBO报告联机(http://www.emboreports.org).

补充材料

致谢

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