简介
泛素化是一种可逆的翻译后修饰，在酵母和哺乳动物细胞的多个细胞位置上起到分选信号的作用，包括反式-高尔基网络、质膜和早期内体(卡兹曼等。, 2002;Bonifacino和Traub，2003年;希克和邓恩，2003年). 虽然细胞表面驻留的多肽可以通过内化暂时下调，但受体和转运体的调节性降解需要在细胞后传递到溶酶体，这一过程可以通过泛素化发出信号(迪菲奥雷等。, 2003;杜普雷等。, 2004).
单个Ub（本文中称为单-Ub）的结合被认为足以作为酵母和哺乳动物细胞中的内吞和空泡分选信号(希克，2001年;莫塞森等。, 2003). 然而，最近的证据表明，多个单-Ub（指定的多分子-Ub）或Ub链（指定的聚合-Ub或聚-Ub）与动物细胞（例如，表皮生长因子受体[EGFR]、主要组织相容性复合体[MHC]I和MHC II）中的有效内吞货物识别相关；邓肯等。, 2006;黄等。, 2006;Ohmura-Hoshino公司等。, 2006;小腿等。, 2006;范·尼尔等。, 2006)以及在酵母中（例如，Gap1氨基酸渗透酶、Fur4p尿嘧啶渗透酶；施普林格等。, 1999;Dupre和Haguenauer-Tsapis，2001年;Soetens公司等。, 2001;杜普雷等。, 2004).
内化后，泛素化货物被肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶磷酸化底物（Hrs）和STAM的Ub-interacting基序（UIM）识别(Williams和Urbe，2007年)酵母Vps27和Hse1的哺乳动物同源物(Hurley和Emr，2006年). 这些是ESCRT 0的保守多域适配器（e（电子）内体秒运动c（c）复合体第页需要用于t吨运输；Hurley和Emr，2006年;Williams和Urbe，2007年). 除了识别泛素化的货物外，Hrs/STAM复合物还与PtdIns3P和网格蛋白重链结合，促进网格蛋白补充到早期内体的限制膜，这是内体双层涂层的主要组成部分(莱博格等。, 2002). Hrs/STAM复合物在双层涂层上识别和浓缩泛素化的货物是货物分离和靶向溶酶体的先决条件(莱博格等。, 2002). 从ESCRT0到ESCRTI、II和III的连续货物转移与内胚体成熟一致，表现为成分变化、管腔酸化和向内泡状芽变，导致形成富含多泡体的晚期内胚体（MVB；梅尔曼，1996年;穆克吉等。, 1997). MVB的形成确保了跨膜蛋白的细胞溶质域可被溶酶体蛋白酶利用，这是一个由溶酶体内融合促进的过程(格伦伯格和斯坦马克，2004年;Hurley和Emr，2006年).
聚-Ub或多聚-Ub在跨膜蛋白（如CD4、β2-肾上腺素能受体复合物、MHC I、MHC II和ENaC；Traub和Lukacs，2007年)建议需要多价相互作用来克服Ub与Ub结合的网格蛋白适配器（例如epsin和eps15；巴里雷等。, 2006;Hawryluk公司等。, 2006). 由于难以区分Ub作为内吞信号和溶酶体分选信号的作用，因此无法阐明Ub构型在溶酶体分拣中的重要性。虽然先前的观察表明，具有不同拓扑结构的短聚-Ub链可能介导溶酶体靶向质膜蛋白(斯塔布等。, 1997;吉萨等。, 2005;邓肯等。, 2006;卡姆斯蒂格等。, 2006;维穆特等。, 2007)，尚未确定溶酶体分选信号所必需和充分的Ub配置。由于epsin和eps15/eps15R的UIM、结合Ub的网格蛋白衔接子以及Hrs/STAM的UIM似乎对泛素化的货物识别至关重要，我们假设类似的原理可能适用于细胞表面和内体的Ub识别。
为了解决内溶酶体分选的Ub构型要求，我们使用嵌合模型和CD4，在其细胞质尾部暴露单U、多分子Ub或多U。利用荧光标记货物的荧光比率图像分析（FRIA），通过囊泡pH值测量，测定了不同Ub构型货物的细胞间转运动力学。结果表明，多聚体和聚合物Ub（而非单体Ub）均被内体分选机有效识别为溶酶体靶向信号，这与Hrs的Ub结合偏好一致。
材料和方法
单元格行
如前所述，COS-7、HEK293T、E36和ts20细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中生长(巴里雷等。, 2006). 用pIRES2-puro表达构建物（BD Biosciences，San Jose，CA）稳定转染HEK293T细胞，并在10μg/ml嘌呤霉素存在下选择CD4Tl-或CD4TlUb-表达克隆。
如前所述对COS-7、HEK293和ts20/E36细胞进行瞬时转染(巴里雷等。, 2006). 对于瞬时共转染，Ub变异体和货物cDNA以3:1质量比使用。
DNA结构和抗体
已经描述了来自钾离子通道Kir6.2的带有无Lys-less连接子（Tl）或四聚螺旋结构域（cc）的CD4-Ub嵌合体(泽兰吉等。, 1999;巴里雷等。, 2006). 使用野生型（wt）Ub和无Lys-less Ub（UbR）cDNA作为模板（由伊利诺伊州埃文斯顿西北大学L.Hicke博士提供），通过PCR突变（CD4Tl-UbRΔG和CD4Tl-UbΔG）删除Ub中的末端甘氨酸残基。通过重叠PCR将Lys残基插入CD4Tl-UbRΔG的UbR△G部分的6、29、48或63位。在CD4-1K中，CD4细胞质尾部（MSQIK（K）R（右）陆上通信线东南方K（K）KTCQCPHRFQ公司K（K）TCSPI）被RMSQI取代R（右）R（右）AA公司东南方R（右）用Arg替换Lys436和Lys442残基的KTCQCPHRFQ肽，用Ala替换双-Leu内吞基序，用下划线字母表示。因此，CD4-1K细胞质尾部包含单个Lys（在443位），并且缺少最后六个氨基酸残基。所有结构均通过DNA测序进行验证。描述了HA-tagged Ub、UbR、UbR63K和UbR48K（Y.Yarden，Weizman Institute，Rehovot，Israel的礼物）(莫塞森等。, 2003).
谷胱甘肽S公司-描述了包含一个（GST-Ub）、两个（GST-2Ub）和三个Ub（GST-3Ub）的转移酶（GST）融合(巴里耶尔等。, 2006). 通过PCR诱变构建了GST-Ub-L-Ub，在Ub和GST-Ub-Ub1A之间有一个10-氨基酸连接子，包含UbI44A。GST-4Ub是通过PCR扩增的Ub cDNA插入到GST-3Ub中而产生的。MBP-小时-小时6和MBP-HrsS270A-His6通过将pGEM-myc-Hrs和pGEM-myc-HrsS270A（由挪威奥斯陆挪威镭医院H.Stenmark博士提供）中的小鼠Hrs cDNA亚克隆到pMAL-c2中获得。C端子His6通过PCR引入。
使用了以下抗体：抗CD4:RPA-T4（BD Biosciences，Oakville，ON，Canada）、OKT4（Harlan Bioproducts，Indianapolis，IN）、大鼠单克隆抗体（Serotec，Raleigh，NC）和兔多克隆抗体（H-370，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）。Lamp1（H4A3）mAb由J.August（爱荷华大学）和J.Hildreth（爱荷华大学）开发，并从发育研究杂交瘤银行（爱荷华州爱荷华市）获得。兔抗-Hrs由H.Stenmark博士善意提供。抗-Ub是一种单克隆抗-Ub辣根过氧化物酶（HRP）偶联物（P4D1，sc-8017 Santa Cruz）。
水泡pH值测量
为了监测内化嵌合体、CD4和其他跨膜蛋白的内吞运输v（v）)根据CFTR（囊性纤维化跨膜电导调节器；沙尔马等。, 2004). 细胞表面CD4（OKT4）和Lamp1（发育研究杂交瘤库）通过将初级（1/100）和次级（1/100–500）Abs在37°C下共同常规孵育1 h，用相关的初级Ab和异硫氰酸荧光素（FITC）结合的山羊抗鼠次级Fab（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove）进行标记。然后清洗细胞（140 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、10 mM葡萄糖、0.1 mM CaCl2和1 mM氯化镁2pH值7.3），并在37°C下追逐30–90分钟。FRIA无法检测到模拟转染细胞中的液相抗体摄取（数据未显示）。
在FITC-葡聚糖或Oregon488-葡聚糖（50μg/ml，MW，10kDa，Molecular Probes，Eugene，or）存在下标记溶酶体过夜，并追踪>3h(诗人等。, 2006)或用5 mg/ml FITC-右旋糖酐加载15 min并追踪90 min。回收的内体用FITC-转铁蛋白（Tf；5μg/ml，37°C下45 min血清耗尽后1 h标记）标记，追踪10 min，在Axiovert 100倒置荧光显微镜（Carl Zeiss MicroImaging，加拿大安大略省多伦多市）上，在35°C下，使用配备有Hamamatsu ORCA-ER 1394（日本滨松）冷却CCD相机和Planachromat（63×，NA 1.4）物镜的Axiover 100倒置萤光显微镜上，对装载了FITC/Oregon488的内溶酶体进行成像。使用MetaFluor软件（宾夕法尼亚州唐宁镇的Molecular Devices）进行荧光比率图像采集和分析。使用535±25nm发射滤波器，在490±5-和440±10-nm激发波长下采集图像。
校准曲线，描述荧光比值和pH值之间的关系v（v）用于计算在两个激发波长下荧光背景减除后单个囊泡的管腔pH值。通过夹紧pH值进行现场校准v（v）4.5至7.4英寸K+-富培养基（135 mM KCl、10 mM NaCl、20 mM HEPES或20 mM MES、1 mM MgCl2和0.1 mM CaCl2)在存在10μM黑曲霉素和10μM莫能菌素（Sigma-Aldrich，Oakville，ON，Canada）的情况下，并记录荧光比率。在每个实验中，pH值v（v）确定了200-800个囊泡，排除了位于质膜下区域的囊泡。为了确保对每个构建体的囊泡数量进行评估，分析了三倍以上的细胞，以获得高循环效率的嵌合体（例如，CD4Tl和CD4Tl-UbRΔg）。作为内部控制，通过夹紧pH值对每个盖玻片进行一点校准v（v）莫能菌素和尼日尔菌素为6.5。pH的单峰或多峰高斯分布v（v）值是通过Origin 7.0软件（马萨诸塞州北安普敦的OriginLab）获得的。平均pH值v（v）由于数据的算术平均值与基于单峰分布拟合的高斯平均值相同，因此计算了每个囊泡的数量。每个条件下至少进行三个独立的实验。组成性表达CD4Tl-Ub的HEK293T细胞被Ub变异体和编码dsRed荧光蛋白的表达质粒以10:1的比例过度转染。仅对表达dsRed的细胞进行FRIA。平均pH值v（v）在三个或更多实验中获得的结果见补充表S1。
为了确认初级和次级抗体仍然与晚期内体中的CD4结合，测量了抗体结合的pH耐受性。在0°C下，将一级和HRP结合的二级抗体与表达CD4Tl的HEK293细胞结合后，细胞外培养液的pH值分别变为7.2、5.0和2.5，持续5分钟。使用Amplex-Red作为底物，通过荧光法测量HRP结合抗体的结合（数据未显示）。在pH值5.0时，抗体结合几乎没有改变，但在pH值2.5时减少了95%。
考虑到FITC的pH敏感性在pH＜5时降低（pK一～6.4），我们验证了pH值v（v）pH值下的测量v（v）<5。为此，用俄勒冈绿（75%）和FITC右旋糖酐（25%）的混合物加载溶酶体隔室，以提高酸性pH下的检测灵敏度，因为俄勒冈绿pK一为～4.7。FRIA表明，Oregon-Green/FITC-右旋糖酐负荷提供的pH值与仅存在FITC时获得的pH值相似，验证了pH值的推断程序v（v）<5仅基于FITC载荷（未显示数据）。所有实验均在COS-7中进行，关键实验在HEK293细胞中重复，结果相似。
免疫荧光显微镜
溶酶体用抗Lamp1抗体或FITC-右旋糖酐（50μg/ml，MW，10 kDa）标记，并按照pH值所述进行加载v（v）决心。表达嵌合体的细胞被允许在DMEM中内化CD4抗体（RPA-T4，BD Biosciences），该抗体与FITC-结合的山羊抗鼠Fab或TRITC-结合的山羊防鼠IgG复合0.75-1小时，并追踪0.5小时。在最后45分钟内，用FITC-Tf或TRITC-Tf（5μg/ml）标记细胞在45分钟血清耗尽后，观察回收的内体。使用蔡司LSM510激光共焦荧光显微镜采集单个光学切片，该显微镜配备有所述的63×/1.4（卡尔蔡司显微成像）Plan-Apochromat(勒沙德尔等。, 2004). 使用Adobe Photoshop（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems）软件处理图像。
重组蛋白纯化及下拉试验
GST-Ub融合蛋白基本上按所述进行纯化(巴里雷等。, 2006). 他的表达6-用0.3 mM IPTG（4 h，RT）在HB101细胞中诱导标记MBP-HrsS270A、MBP-Hrs 298X和MBP。MBP-小时-小时6在BL21（DE3）菌株中表达。对于Hrs下拉实验，通过使用直链淀粉珠进行亲和纯化来测定重组MBP-Hrs蛋白的细菌表达水平。接下来，将约65 pmol的融合蛋白与直链淀粉珠结合（过夜，4°C），洗涤三次（20 mM Tris-Cl，pH 7.4，200 mM NaCl，1 mM EDTA），并在4°C下与单-Ub（15μg，Sigma）、K48-（15μg/）或K63链接（6μg）多-Ub链（波士顿生物化学，马萨诸塞州剑桥市）培养2小时。结合蛋白用2×LSB洗脱。直接加载结合缓冲液中存在的6%的K63-和16%的K48连接的聚-Ub和单-Ub，以补偿P4D1抗-Ub抗体对K48聚-Ub的约两倍低的检测效率。
CD4-Ub嵌合体的细胞表面密度、内部化、再循环和稳定性
如前所述，基本上测量了CD4-Ub嵌合体的细胞表面密度和内部化(巴里雷等。, 2006)使用抗CD4抗体。剩余的抗CD4 Ab通过HRP偶联的山羊抗鼠抗体和AmplexRed作为荧光底物（分子探针）检测。荧光由OPTIMAstar（BMG Labtech，Offenburg，Germany）平板阅读器测量。
如前所述，通过生物素-链霉亲和素夹心技术监测嵌合体的回收(沙尔马等。, 2004)将抗CD4抗体和生物素化抗鼠抗体装入内体30min，然后用20μg/ml链霉亲和素（Sigma-Aldrich；4°C，1h）封闭细胞表面的生物素化次生抗体。通过将温度移至37°C 5–10分钟刺激内化货物的胞吐，并通过HRP结合的链霉亲和素和AmplexRed检测。回收效率表示为在平行样品中测量的内吞货物的%。
通过细胞表面结合的抗CD4抗体在37°C下0.5–20小时追踪期间在瞬时转染COS-7细胞中的消失动力学来监测质膜相关CD4嵌合体的周转。以Amplex-Red为底物，测定细胞表面结合的抗CD4抗体为HRP结合的次级抗体。
免疫沉淀和Western印迹
为了测定细胞表面和内体中各种CD4细胞的内源性泛素化水平，在37°C的瞬时转染COS-7细胞中用抗CD4（OKT4）Ab标记嵌合体30分钟。为了延迟泛素化嵌合体的降解，在培养基中补充20μg/ml亮蛋白肽、20μg/ml pepstatin和1μM巴非霉素A1。用含有10μg/ml亮氨酸肽和胃蛋白酶抑制素、100μM苯甲基磺酰氟、10μM MG132和10 mM NEM的RIPA缓冲液溶解细胞。在蛋白G琼脂糖（Invitrogen，Carlsbad，CA；2h，4°C）上分离抗CD4抗体复合物，用2×LSB洗脱结合蛋白，并用多克隆抗CD4（h-370，Santa Cruz Biotechnology）或单克隆抗Ub HRP-偶联物（P4D1，sc-8017；Santa Cru z Biotechnology。为了监测异源Ub的掺入，用HA标记的Ubwt、UbR、UbR63K或UbR48K瞬时转染表达CD4Tl-Ub的HEK293细胞。48小时后，细胞在上述RIPA缓冲液中溶解。用抗CD4大鼠单克隆抗体（Serotec）和蛋白G琼脂糖珠（Invitrogen）沉淀CD4Tl-Ub。结合蛋白用多克隆抗CD4抗体（H-370；Santa Cruz Biotechnology）或抗HA抗体（Covance；MMS-101R）进行探针。
如前所述，使用NIH Image 1.62软件对免疫印迹进行密度分析(沙尔马等。, 2004). 按照前面对CFTR的概述，进行了带有CD4Tl-Ub的Hrs免疫沉淀(沙尔马等。, 2004)进行了以下修改。表达CD4Tl-Ub的HEK293细胞与MG132孵育（10μM，1 h），并溶解150 mM NaCl、20 mM Tris-Cl和0.2%NP-40，pH 7.4，含有10μg/ml亮氨酸肽和胃蛋白酶抑制素，以及0.1 mM苯甲基磺酰氟、10μM MG132和10 mM NEM。嵌合体用OKT4抗体沉淀。
统计分析
实验重复至少三次或如所示。数据为平均值±SEM。显著性通过使用95%置信水平下的双尾p值计算，未配对t吨使用Prism软件（GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥）进行测试。
结果
CD4-Ub嵌合体作为溶酶体靶向信号探测泛素化
CD4被广泛用作跨膜货物分子的模型，以确定分拣信号的要求和充分性(佩尔钦·马修斯等。, 1989;投掷者等。, 1999). 截断的CD4由CD4（CD4Tl）的细胞外和跨膜结构域组成，默认靶向质膜，缺乏任何分选信号(贝丁格等。, 1988;巴里雷等。, 2006). 我们设计了三个CD4-Ub嵌合体，暴露出一个多-Ub链（CD4Tl-Ub）、一个不可稀释的单-Ub（CD4TI-UbRΔG）或一个四聚体不可稀释Ub（CD4 cc-UbR△G）作为其细胞质分选信号，以评估跨膜货物依赖于Ub的溶酶体分选的结构基础(a） ●●●●。
CD4-Ub嵌合体的表达和稳定性。（a） CD4-Ub嵌合体的示意图。CD4的细胞质尾部被柔性连接子（CD4Tl）或四聚螺旋结构域（CD4cc）和所示的Ub部分取代，如材料和方法（b）CD4Tl-Ub的多泛素化。将表达所示CD4嵌合体的COS-7瞬时细胞与OKT4抗CD4抗体在37℃孵育30分钟。CD4-Ab复合物在蛋白G珠上进行免疫分离。用HRP-结合的P4D1抗Ub抗体检测免疫沉淀物。（c） 在瞬时转染的HEK293细胞中用100μg/ml环己酰亚胺（CHX）抑制翻译后，测量CD4嵌合体的代谢稳定性。追踪后，用抗CD4抗体对等量的细胞裂解物进行免疫印迹。CD4Tl-Ub泛素化用星号（*）表示。（d） CD4-Ub嵌合物的降解动力学通过面板c中所示免疫印迹的密度测定法测定。数据为平均值±SEM；n=3-4。（e） 抑制溶酶体蛋白水解和货物运输可稳定CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG。在CHX追踪6小时后，在面板c中所述的bafilomycinA1（1μM）、MG132（20μM）或leupeptin+胃蛋白酶抑制素（5–5μg/ml）存在下测量CD4-Ub嵌合体的稳定性。（f） 对CD4Tl、CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG免疫印迹进行密度分析，如面板e所示。使用10μM的乳酸菌素。数据表示为初始货物量的百分比。平均值±SEM；n=3。
在CD4Tl-Ub中，wt-Ub与截断的CD4（CD4Tl）融合。为了防止Ub链的形成，所有赖氨酸残基都被精氨酸取代，并且Ub部分的C末端Gly残基也被删除（CD4Tl-UbRΔG，、a和b）。Gly残基的缺失阻止了泛素化机制的可能招募(雷耶斯·图尔库等。, 2006). 最后，模拟多重单泛素化(哈格隆德等。, 2003)，CD4Tl-UbRΔG的细胞质连接子被Kir6.2通道的cc四聚结构域取代（CD4cc-UbR△G；元等。, 2003). 这个四聚结构域引发了可溶性和嵌合蛋白质的齐聚(巴里雷等。, 2006)并假设暴露四聚体，不可稀释的Ub。
为了证明三种模型蛋白的差异泛素化，在抗CD4抗体结合和内吞作用后，对细胞表面驻留和内部化的CD4-Ub嵌合体进行免疫分离，如材料和方法。这种方法排除了与内质网（ER）和高尔基体室相关的泛素化嵌合体的检测。用抗Ub检测免疫沉淀物表明CD4Tl-Ub受到多泛素化作用。相比之下，我们无法检测到Ub与CD4Tl-UbRΔG和CD4cc-UbR△G的结合(b） ，支持了这些融合蛋白在体内暴露单个共价连接的Ub的预测。
Poly-Ub和Multimeric-Ub代谢性破坏CD4报告蛋白
在环己酰亚胺（CHX）抑制蛋白质合成后，通过免疫印迹法测定嵌合体的代谢稳定性。CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG的周转率都明显快于CD4Tl或CD4Tl-UbRΔG(、c和d）。CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG的加速降解，至少部分可归因于溶酶体蛋白水解，因为它阻止了溶酶体酸化和由巴非霉素A1（一种液泡H+-ATP酶抑制剂或通过leupeptin/胃蛋白酶抑制素阻断溶酶体组织蛋白酶，显著延缓降解(、e和f；范·威特等。, 1995;安尼托等。, 1996). 半胱氨酸蛋白酶和蛋白酶体抑制剂MG132和乳胱氨酸蛋白酶也可以通过耗尽内源性Ub和/或干扰货物发芽进入MVB来稳定嵌合体，如泛素化EGF和PDGF（血小板衍生生长因子）受体的文献所述(隆格瓦等。, 2002;、e和f）。
为了证实CD4-Ub嵌合体的差异稳定性，接下来测定其质膜周转率。将限制在质膜上的嵌合体用抗CD4抗体标记在冰上，然后在37°C下追逐0–20小时。通过HRP-偶联抗鼠抗体和Amplex-Red存在时产生的荧光来测量细胞表面残留的抗CD4抗体。细胞表面残留抗体表示为初始量的百分比(a，请参阅材料和方法). 单泛素化CD4Tl-UbRΔG（T1/2～9.8 h）类似于CD4Tl（T1/2～16 h），比CD4Tl-Ub慢几倍（T1/2～25分钟）或CD4cc-URΔG（T1/2～34分钟），分别代表多泛素和多泛素货物(a） ●●●●。
CD4-Ub嵌合体的稳定性、内化和再循环。（a） 通过瞬时转染COS-7细胞中细胞表面结合的抗CD4抗体的消失来监测嵌合体质膜池的周转。在冰上用抗CD4抗体标记细胞1小时，然后在37°C下追踪0.5–20小时。如中所述，在HRP-共轭二级抗体和AmplexRed存在的情况下，通过荧光法测量留在细胞表面的抗体材料和方法.对细胞蛋白的荧光进行了标准化。平均值±SEM；n=3。（b） CD4-Ub嵌合体的内化率。嵌合体的内分泌速率通过COS-7细胞中的抗CD4 Ab摄取来测量，如材料和方法。数据以细胞表面CD4-Ub嵌合体初始数量的百分比表示。平均值±SEM；n=3–5。（c） 使用生物素-链霉亲和素夹心技术在瞬时转染的COS-7细胞中测量嵌合体的回收效率，如材料和方法回收率表示为内部化货物的百分比。平均值±SEM；n=3–5。
嵌合体的质膜周转由其在恒定生物合成下的内化、降解和再循环速率决定（补充图S1a）。多和多泛素化嵌合体的加速内化可能通过增加分选内体中的货物浓度，促进其更快的溶酶体降解。我们和其他人已经证明，多泛素和多泛素货物的内部化速度明显快于单泛素货物(斯普林格尔等。, 1999;巴里雷等。, 2006;Hawryluk公司等。, 2006). 通过测量嵌合体对抗CD4抗体的初始摄取率，也证实了这些差异(b） ●●●●。多聚CD4cc-UbRΔG和多泛素化CD4Tl-Ub的细胞内吞作用比CD4Tl、CD4T1-UbR△G或CD4Tl-UbR快3-4倍（～45–50%/5min）(b；巴里雷等。, 2006). 重要的是，单泛素化货物（CD4Tl-UbRΔG和CD4T1-UbR）的内化显著（~13%/min和~8%/min），与CD4Tl报告分子的内化相当（~12%/min）。因此可以想象，这是由大量流内吞作用介导的(巴里雷等。, 2006). 单泛素化货物的细胞表面密度相对较高，尽管其内部化速度较慢，但这确保了对内吞囊泡进行足够的抗体标记，以用于免疫定位和pH值测量（见下文）。
Poly-Ub和Multimeric-Ub阻碍再循环并将报告分子靶向溶酶体
除了加速内化外，内体滞留和溶酶体分选可能是错误折叠的CFTR和酵母H所提出的多泛素化和多泛素化模型货物的快速细胞表面周转的原因+-ATP酶(沙尔马等。, 2004;刘和张，2006)和其他泛素化的膜蛋白(格伦伯格和斯坦马克，2004年;Traub和Lukacs，2007年). 为了解决这些可能性，嵌合体的回收率由生物素-链霉亲和素夹心技术测定，如材料和方法。虽然34-38%的内吞CD4Tl和单泛素化CD4Tl-UbRΔG在5分钟内返回细胞表面，但多泛素化和多泛素化合物的回收效率降低了两到三倍（11-14%/5分钟；c） ●●●●。有趣的是，与CD4Tl-UbRΔG相比，保存CD4T1-UbR中的末端甘氨酸使循环效率降低了50%(b和c），而它对内化没有明显的影响(巴里雷等。, 2006)这表明末端甘氨酸可能有助于溶酶体分选。这些结果共同表明，加速内化和缺陷再循环都有助于含多聚和多聚Ub模型蛋白的快速细胞表面周转。
通过使用细胞器标记和激光共聚焦荧光显微镜在HEK293和COS-7细胞中的共定位研究，首次确定了内吞嵌合体的目的地。用抗CD4抗体和荧光团结合的二次Fab内化标记嵌合体，并在37℃无抗体培养基中追踪30分钟。CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG主要靶向溶酶体，由液相标记葡聚糖鉴定()或Lamp1免疫染色（数据未显示），并且大部分被排除在再循环内体之外，通过FITC-Tf观察(a） ●●●●。相反，内吞的CD4Tl-UbRΔG携带一个与CD4Tl类似的不可稀释的Ub，被分类为再循环内体，并从溶酶体中排除(b） ●●●●。考虑到上述实验都不允许我们描述泛素构型作为溶酶体转运信号的重要性，因为它对内吞作用有复合作用（参见b） 我们设计了一种检测嵌合体从早期内体向溶酶体转移动力学的方法。该分析监测pH值v（v）并依赖于溶酶体内隔间的不同pH值。
内化CD4-Ub嵌合体的亚细胞定位。（a） 内部化的CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG与溶酶体共定位，避免了HEK293细胞中内体的再循环。嵌合体被抗CD4抗体和FITC-共轭二级Fab内吞。溶酶体和再循环内体分别用FITC-右旋糖酐和TRITC-Tf标记。通过免疫染色将内化右旋糖酐与Lamp1共定位（数据未显示）。用激光共聚焦荧光显微镜获得单个光学切片。棒材，10μm。（b） 内部化的CD4Tl和CD4Tl-UbRΔG与再循环内体共定位，并从溶酶体中排除。循环内体、溶酶体和CD4嵌合体的染色如图a所示。Bar，10μm。
监测活细胞早期内泌体中泛素化货物的分选
再循环内体的管腔pH值比分选内体的pH值（pH～5.9～6.3）更碱性（pH～6.4～6.5），而早期内体成熟为MVB/晚期内体和溶酶体时，其酸化程度分别为pH～5.5～6和<5.5(穆克吉等。, 1997; 补充图S1a）。因此，通过荧光比率图像分析（FRIA；参见材料和方法)，使用货到FITC，一种对pH敏感的荧光团(Ohkuma和Poole，1978年).
为了验证该分析，确定了FITC-共轭Tf、右旋糖酐和EGF的目的地。FRIA分析证实，内化的Tf仅限于轻度酸性（pHv（v）6.35±0.08，n=3）再循环内体，而右旋糖酐和EGF在酸性（pH）中积累v（v）4.60±0.08和4.98±0.15，n=3）溶酶体(a） ●●●●。这些pH值v（v）数值与成纤维细胞、BHK和CHO细胞中各自细胞器的数值相似(穆克吉等。, 1997). 平均pH值v（v）文本和补充表S1中显示了三个或更多独立实验中获得的值，而单个实验的结果如图所示。
通过水泡pH值（pH）监测内部货物分拣v（v）)测量。（a） pH值验证v（v）通过监测HEK293细胞中的转铁蛋白（Tf）、表皮生长因子（EGF）和右旋糖酐分选进行测量。FITC-右旋糖酐和FITC-Tf的加载协议如所述材料和方法。血清耗尽的细胞内化生物素-EGF和FITC-链霉亲和素1小时，并在37°C下追逐2小时。pH值v（v）在COS-7（右旋糖酐）细胞中也得到了类似的结果。平均（±SEM）pHv（v）并指出了单个实验中分析的囊泡数量。平均pH值v（v）补充表S1总结了≥3个独立实验。（b） CD4Tl-Ub溶酶体递送动力学。抗CD4抗体和FITC缀合的二级Fab在0°C下与转染的HEK293细胞结合1小时。然后将温度升高到37°C，持续1、15或30分钟，并将pH值v（v）（c）表达CD4Tl-和CD4T1-Ub-的HEK293细胞可以在37°c下内化抗CD4初级抗体和FITC-结合次级Fab 1小时，并在FRIA前追赶30分钟。在COS-7细胞中也获得了类似的结果（数据未显示）。
为了确定早期内体和溶酶体以及其他目的地之间货物的分拣动力学，在HEK293细胞中用抗CD4 Ab和次级FITC-Fab标记CD4Tl和CD4Tl-Ub。在不含Ab的培养基中，将温度升至37°C，持续1–30分钟，然后pHv（v）CD4Tl-Ub在15分钟内到达早期内体（pH～6.2），在随后的15分钟追踪中到达溶酶体（pH至4.8）(b） ●●●●。CD4Tl在再循环内体中积累缓慢，与其降低的内化率一致(巴里雷等。, 2006)甚至在追捕90分钟后也在那里被发现，可能是由于多次内吞和外吞(b和未显示）。当一级和二级抗体内化1小时并在37°C下追逐30分钟时，也获得了类似的结果(c） 后续研究中使用的方案。
Poly-Ub和Multimeric-Ub在早期内切体被识别为溶酶体分选信号
为了研究可作为有效溶酶体靶向信号的Ub构型，将暴露多聚、多聚或单U b的嵌合体的细胞后运输与c.虽然在30分钟追踪期间，从早期内体中清除了内部化的CD4Tl-Ub并将其传递到溶酶体，但含有单个Ub部分的CD4T-UbRΔG仍保留在具有特征pH值的隔间中v（v）分选内体（pHv（v）6.56 ± 0.08;穆克吉等。, 1997)即使在COS-7和HEK293细胞中追捕90分钟也无法到达溶酶体(a和补充表S1）。CD4Tl-UbR也主要积聚在早期内体（pHv（v）= 6.01 ± 0.05;a和补充表S1）。双峰pH值表明CD4Tl-UbR溶酶体的有限积累（～10%）v（v）分布可以解释为通过可能有助于溶酶体分选的末端Gly残基招募泛素化机制(Hochstrasser，2006年). CD4Tl-UbΔG溶酶体递送的适度延迟与该假设一致(a） ●●●●。
CD4-Ub嵌合体的溶酶体分选需要多聚-Ub或多分-Ub。（a） FRIA监测COS-7细胞中显示的CD4嵌合体的细胞后分选，如c.数据表示为pH频率v（v）和pH值的平均值v（v）±单个实验的SEM（另见补充表S1）。（b） 不变链-Ub嵌合体的溶酶体分类。缺失其内化基序的截短不变链（IiT）、IiT-Ub和IiT-UbRΔG的细胞后转运由pH值决定v（v）使用一级抗-Ii和FITC共轭二级Fab片段与FRIA进行测量，如材料和方法。（c） pH值v（v）测定了内含CD4cc-、CD4cc-Ub-和CD4cc-UbRΔG的内化囊泡的c.（d）。CD4Tl和CD4Tl-UbRΔG的多重聚合是通过在冰上依次与抗CD4抗体（OKT4）、生物素化次级抗体和链霉亲和素FITC孵育细胞来实现的。在37°C的无抗体培养基中开始内化30分钟，pHv（v）通过FRIA测定。（e）通过pH值确定CD4cc-UbRI44A和CD4cc-UbR的后核分选v（v）测量值如面板a所示。
当Mono-Ub与三聚体不变链的截断变体融合时，它无法作为有效的溶酶体分选信号发挥作用，缺乏内源性内化信号(Bonifacino和Traub，2003年;b） ●●●●。尽管IiT-UbRΔG在弱酸性（pH）下积聚v（v）6.57±0.03）个隔间，在30分钟追踪中完成了IiT-Ub的溶酶体输送(b） ●●●●。因此，单单克隆抗体不能被识别为溶酶体分选信号，这与报告蛋白无关，并且也用CD4作为载体进行了确认（参见补充图S4）。
值得注意的是，CD4Tl-UbRΔG通过两种不同的方法多重聚合，恢复了嵌合体溶酶体的递送。在30分钟追逐高酸性小泡（pH值为v（v）分别为4.94±0.09、4.82±0.14和4.88±0.16；c和补充表S1）。相反，CD4cc仅限于再循环的内体（pHv（v）6.46±0.09，n=3），排除了cc结构域作为溶酶体分选基序的作用(c） ●●●●。作为第二种技术，CD4Tl-UbRΔG与初级抗体、生物素化次级抗体和链霉亲和素交联，以诱导嵌合体的非共价聚集。这种方法也改变了嵌合体的路线，但不是CD4Tl，从再循环内体进入溶酶体(d） 这意味着多分子Ub可以被识别为有效的溶酶体分选信号。
Ub44Ile对CD4cc-UbRΔG的溶酶体分选至关重要
Ub44Ile周围的疏水斑块需要作为Ub-结合域的结合面，包括Hrs、STAM、epsin和eps15的UIM(希克，2001年;费希尔等。, 2003;希克和邓恩，2003年). 为了证明UIM-Ub相互作用在CD4cc-UbRΔG溶酶体靶向中的相关性，将Ub44Ile突变为Alav（v）与wt对应物相比，CD4cc-UbRI44A被路由到再循环内体，（pHv（v）6.38±0.10，n=3，e） ●●●●。同时，Ile44Ala突变也恢复了CD4cc-UbRI44A的细胞表面稳定性和再循环(、a和c）。这些结果证实了以下推论：为了有效地靶向溶酶体并防止导致报告分子在细胞表面代谢失稳的结构性循环，需要识别多个Ub部分。
E1酶失活阻碍CD4Tl-Ub溶酶体传递
为了证明泛素结合确实是CD4Tl-Ub溶酶体分选所必需的，我们利用了含有温度敏感性E1-Ub激活酶的ts20细胞系。免疫印迹法证实，在40°C的温度下，3小时内可实现热敏E1酶的完全下调(a） ●●●●。Ub结合对于CD4Tl-Ub溶酶体靶向必不可少，因为E1酶的热失活显著阻碍了ts20细胞中CD4T1-Ub溶菌体的积累(b、 顶部面板）。相反，40°C暴露对含有野生型E1酶的E36细胞的溶酶体递送没有影响(b、 顶部面板）。值得注意的是，在ts20细胞中，四聚体CD4cc-UbRΔG的有效溶酶体靶向在非容许温度下被保留，这表明分拣机械的泛素化对于泛素化的货物分拣不是必不可少的(b、 底部面板）。
E1酶失活会损害CD4Tl-Ub的Ub链形成和溶酶体分选，但不会损害CD4cc-UbRΔG。（a） E1酶的热失活在40°C的ts20中完成，但在E36细胞中未完成。使用ECL用抗E1抗体探测等量的细胞裂解物。（b） 表达所示结构的Ts20和E36细胞在40°C下培养3小时，以下调E1 Ub激活酶。pH值v（v）通过FRIA测定了内吞CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG。
K63连接的Ub链作为溶酶体靶向信号
为了阐明被认为是溶酶体分选信号的多-Ub链构型，在位置6、29、48或63处将单个Lys残基重新插入UbRΔG。CD4Tl-UbRΔG63K的溶酶体靶向性在30分钟追踪中部分恢复，因为～58%的货物到达溶酶体(a） ●●●●。溶酶体传递对48K的效率较低，反映为细胞内货物的约21%溶酶体积累，而6K或29K替代物则无法检测到(a） ●●●●。内胚体分选机械的饱和不能解释UbRΔG6K、UbR△G29K和UbRδG48K的再循环，因为相应嵌合体的细胞表面密度增加了约四倍，而其内部化相对于CD4Tl-Ub减弱了约75%（补充图S1b）。因此，K63和K48似乎是第一个Ub共轭的优先受体位点。
Ub链构型对CD4-Ub嵌合体内化和细胞后分选的影响。（a） 通过FRIA监测瞬时转染COS-7细胞中CD4Tl-UbRΔG6K、-UbR△G29K、-Ub RΔG 48K和-Ub R△G 63K的后核分选，如c.显示较大pH值队列的囊泡v（v）有灰色阴影。（b） 用HA标记的Ub变异体瞬时转染COS-7细胞的免疫印迹分析。用SDS-PAGE分离等量的细胞裂解物，并用抗HA抗体进行检测。（c）UbR的瞬时共表达，而不是wt-Ub，可防止CD4Tl-Ub的溶酶体积聚。通过pH值监测嵌合体的细胞后命运v（v）如中所示c在COS-7细胞中以1:3-4的质粒比率瞬时共存CD4TlUb和Ubs变体。（d） 在UbR63K或UbR48K过度表达的情况下，通过pH值监测CD4Tl-Ub的细胞后分选v（v）如有必要，追踪时间延长至90分钟。在稳定表达CD4Tl-Ub的HEK293细胞中，并以10:1的比例转染编码Ub变体和dsRed荧光蛋白的质粒，获得了类似的结果。对表达dsRed的细胞进行FRIA。（e） Ub变异体过度表达时CD4Tl-Ub的内化率。通过抗CD4抗体摄取试验测量瞬时共转染COS-7细胞的内吞率，如材料和方法。平均值±SEM；n=3*相对于模拟转染的CD4Tl-Ub，p>0.05。
为了限制CD4Tl-Ub上的Ub链配置，嵌合体与含有单个Lys（UbR63K或UbR48K）或无Lys残基（UbR）的HA标记突变Ub共表达。预计UbR的过表达终止了Ub链的延伸，而UbR63K和UbR48K仅分别将链构型限制为K63-和K48-连接的聚Ub。通过免疫印迹HEK293细胞裂解物和抗-HA抗体，观察Ub变体与细胞蛋白的可比表达和结合(b） ●●●●。在COS-7细胞中也获得了类似的结果（数据未显示）。酸碱度v（v）测量结果证实，在30–90分钟的追逐过程中，UbR的过度表达（而不是wt-Ub）阻止了CD4Tl-Ub的溶酶体递送（pHv（v）∼6.5,c） 可以想象，通过终止链延伸。wt和UbR对Tf受体循环和Lamp1或CD4cc-UbRΔG溶酶体分选均无明显影响，排除了Ub过度表达对溶酶体分拣的非特异性影响（补充图S2a）。
虽然在30分钟追踪后，在UbR63K存在的情况下，CD4Tl-Ub的溶酶体完全积累，但如果UbR48K表达，则至少需要90分钟(c） ●●●●。考虑到Ub变异体的可比表达水平(b和附图S2）及其与CD4Tl-Ub的结合（附图S2。
Hrs与K63连接的多泛素链的优先结合
Hrs是ESCRT0的成员之一，已被证明在早期内体的泛素化货物识别和溶酶体分选中发挥关键作用(希克和邓恩，2003年;莱博格等。, 2003). 抑制Hrs功能可延缓许多泛素化膜蛋白的溶酶体降解(巴赫等。, 2003). 共免疫沉淀证明泛素化CD4Tl-Ub与Hrs的相互作用。根据免疫印迹分析，CD4Tl-Ub而非CD4Tl的免疫沉淀物含有Hrs(a和数据未显示）。此外，特定小干扰RNA（siRNA）对Hrs的下调抑制了CD4Tl-Ub的溶酶体传递，证实Hrs参与了CD4T-Ub的胞后分选（数据未显示）。
内源性和重组Hrs的Ub结合特异性。（a）HEK293细胞中Hrs与CD4Tl-Ub的关联。用OKT4抗CD4抗体检测免疫沉淀的CD4Tl-Ub和指示的抗体。加载100微克裂解物（lys）。（b） 用HeLa细胞裂解液培养等量的含有一个、两个、三个或四个串联Ubs的GST融合蛋白，如材料和方法用免疫印迹法观察结合小时（顶面）和E1 Ub激活酶（中面）。GST-2Ub的突变变异体描述于材料和方法。装载10%的裂解物（lys）。通过Ponceau染色观察GST-Ub融合（底部面板）。（c） K63链接的Ub链与重组Hrs的优先结合。类似数量的MBP、wt或突变的MBP-Hrs融合蛋白与直链淀粉珠结合，并与K48-（左面板）、K63链接聚-Ub链（中面板）或单-Ub（右面板）孵育。使用P4D1抗Ub抗体通过免疫印迹法显示结合的Ub。根据材料和方法.
为了研究Hrs的Ub结合特异性，我们使用包含1–4串联Ub部分的GST融合蛋白，模拟K63连接Ub链的线性构型(霍夫曼和皮卡，2001年). 虽然Hrs随着GST-2Ub、GST-3Ub和GST-4Ub的下降而恢复，但内源性Hrs最小或无与GST-Ub相关(b） ●●●●。通过GST-Ub-Ub1A中的Ile44Ala取代消除UIM识别位点之一足以抑制Hrs结合(b、 车道3和7）。通过柔性连接物（GST-Ub-L-Ub）增加两个Ub部分之间的距离对Hrs结合是允许的，并使融合蛋白可被E1-激活酶访问(b、 车道3和6）。值得注意的是，E1 Ub激活酶也与GST-Ub结合，这意味着GST-Ub的错误折叠不能解释其缺乏Hrs结合(b、 中间面板）。鉴于GST的二聚化倾向，这些结果支持了Hrs与泛素化多肽结合所必需的多价相互作用的概念。Hrs与Ub-结合适配器子集（例如STAM、eps15和TSG101）的同源和异源齐聚可能解释了早期内体的这种现象(巴赫等。, 2003).
为了评估重组Hrs结合特异性，在体外测定了单-Ub、K63-和K48-连接的Ub链与融合到麦芽糖结合蛋白（MBP）的Hrs的关联。将相当数量的重组MBP-Hrs与直链淀粉颗粒结合，并与单-Ub、K63-和K48-链接的Ub链孵育。用抗Ub抗体进行免疫印迹可观察到结合的Ub。尽管包含UIM的全长或C末端截短的Hrs（Hrs298X）均不能结合可检测的单-Ub，但大量K63链接的聚-Ub链被拉下(c） ●●●●。K48连接的Ub链的恢复明显减弱(c） ●●●●。此外，Hrs UIM中S270A突变破坏了Ub识别(米勒等。, 2004)，显著减少了Ub结合(c） ●●●●。这些体外观察结果与体内依赖于Ub的内体分选机制对K63连接的Ub链的优先识别一致。
MARCH-IV泛素化CD4的溶酶体分选信号
疱疹病毒已被证明编码哺乳动物蛋白质的病毒同源物。免疫识别调节剂（MIR）家族成员哺乳动物同源物的几个候选基因与病毒E3-Ub连接酶共享催化域(Coscoy和Ganem，2000年;Coscoy公司等。, 2001). 根据其结构特征，MIR被指定为MARCH家族成员(巴特等。, 2004). MARCH-IV泛素化物的E3连接酶活性及下调细胞表面CD4(曼苏里等。, 2003). 为了检验抗体链拓扑结构在MARCH-IV诱导的CD4下调中的相关性，CD4胞质尾部四个赖氨酸残基中的三个被消除，以防止多个抗体链的形成（参见材料和方法). 此外，我们突变了di-Leu基序以最小化CD4的Ub-非依赖性排序。
根据pH值v（v）测量结果表明，CD4-1K仅限于在没有MARCH-IV的情况下再循环内体，而MARCH-IV的过度表达在45分钟的追踪中激发了CD4-1K的溶酶体传递(a） ●●●●。值得注意的是，即使经过90分钟的追踪，泛素化无法达到的无Lys-less CD4（CD4-4R）变体仍然存在于早期内体中(A） ●●●●。同样，MARCH-II共表达时未观察到CD4-1K的溶酶体递送，而MARCH-III共表达未能下调CD4(巴特等。, 2004; 数据未显示）。
CD4-1K溶酶体靶向需要多泛素化。（a） 通过FRIA监测瞬时转染COS-7细胞中存在或不存在MARCH-IV和wt-Ub时CD4-1K和CD4-4R的细胞后分选。将Abs内化1.5小时，并在指定的时间内追赶。（b） 如面板a所述，在存在MARCH-IV和UbR、UbR63K或UbR48K的情况下监测CD4-1K的后细胞分选。追踪时间为45或90分钟。
通过UbR过度表达防止多-Ub链形成抑制MARCH-IV诱导的CD4-1K溶酶体递送(b） ●●●●。另一方面，与wt-Ub共表达或不表达相比，UbR48K的过度表达支持CD4-1K的溶酶体到达，而UbR68K的延迟(、a和b）。有趣的是，也通过wt-Ub、UbR、UbR63K和UbR48K的共表达来探测全长CD4的溶酶体靶向效率，也记录了类似的敏感性（补充图S4）。这些观察结果表明，只有一个Lys残基对MARCH-IV依赖的泛素化敏感，并且符合CD4高效溶酶体分选的多泛素化要求。
讨论
利用具有不同Ub构型的模型蛋白和CD4的MARCH-IV依赖性泛素化，我们确定了有效溶酶体分选内化跨膜货物所必需和充分的Ub构型。利用免疫细胞化学、药理学和功能方法，以及FRIA通过活细胞中的囊泡pH值测量来跟踪货物运输，我们提供了令人信服的证据，表明多聚-Ub和多分子-Ub，而非单体Ub，构成了内吞跨膜蛋白的有效溶酶体靶向信号。体内外poly-Ub链与内源性和重组Hrs的优先结合符合功能数据。
多泛素化作为溶酶体靶向信号的相关性
虽然单泛素化最初是作为酵母中质膜受体和转运体（Ste2p或半乳糖Gal2p和麦芽糖转运体）的内吞信号被发现的(卢塞罗和拉古纳斯，1997年;特雷尔等。, 1998;霍拉克和沃尔夫，2001年)最近的分析表明，多个Ub附着可以比单Ub更有效地触发货物内部化（例如，Ste2p、a因子受体Ste3p、a因素转运体Ste6p和锌转运体；Kolling和Hollenberg，1994年;Galan和Haguenauer-Tsapis，1997年;特雷尔等。, 1998;吉坦和艾德，2000年;罗斯和戴维斯，2000年). 在动物细胞中，需要多聚体或多聚体Ub，但不是不可预期的Ub修饰来发出模型蛋白快速内吞的信号(巴里雷等。, 2006;Hawryluk公司等。, 2006). 一致地，许多质膜蛋白的多聚或多聚单泛素化被证明参与了其细胞表面密度的调节（综述见Traub和Lukacs，2007年). 配体诱导的TrkA受体下调以及MIR K3介导的MHC I泛素化需要K63连接的多-Ub链形成(邓肯等。, 2006;吉萨等。, 2005). 另一方面，活化的二聚酪氨酸激酶受体（例如EGFR）经历多重单泛素化和多泛素化(哈格隆德等。, 2003;吉萨等。, 2005). MHC-II复合物的多泛素化在限制抗原肽提呈方面也很关键(Ohmura-Hoshino公司等。, 2006;小腿等。, 2006;范·尼尔等。, 2006). MIR家族多泛素酸的病毒编码E3-Ub连接酶可产生多种免疫识别分子，包括B7.2、ICAM-I、CD1d、CD4和干扰素γ受体1(莱纳等。, 2005;锂等。, 2007). 通道、转运体和其他受体（AQP2、ENac、β2肾上腺素能受体-阿雷斯丁复合物、TRPV4、CFTR和ClC-5）对内化也必不可少(斯塔布等。, 1997;谢诺伊等。, 2001;Hryciw公司等。, 2004;沙尔马等。, 2004;卡姆斯提格等。, 2006;韦吉尔斯基等。, 2006;维穆特等。, 2007). 这些观察结果共同强调了多和多单泛素化作为自主内吞信号的普遍性和功能重要性，并加强了它们作为溶酶体靶向信号的相关性。
通过囊泡pH测定监测溶酶体货物分拣的多泛素化或多单泛素化需求
考虑到货物泛素化信号来自早期内体的内化和溶酶体靶向以及加速内化本身可能导致内溶酶体货物流量增加(Bonifacino和Traub，2003年)因此，必须设计一种检测方法来监测内吞货物目的地的动态。这是通过实施FRIA分析来实现的，该分析基于溶酶体腔室的特征酸化模式来确定货物分子的细胞后定位(穆克吉等。, 1997). 尽管分选和再循环内体以及MVB和溶酶体具有不同的管腔pH，TGN pH～6.2–6.6与再循环内体重叠(Sun-Wada公司等。, 2004). 因此，通过与Tf受体（TfR；)生物素-亲和素夹心技术对回收效率的量化(c） ●●●●。
一些证据支持我们的结论，即内化模型蛋白和CD4需要多聚或多聚Ub修饰才能从内体有效靶向MVB/溶酶体。1） 根据形态学、生物化学和功能分析，通过将不可稀释的Ub（UbRΔG）融合到截断的CD4或Ii（类似于UbR与CD4Tl-Ub或CD4的过度表达）来防止Ub链结合，足以将这些货物重新运送到回收内体。另一方面，通过在UbRΔG中引入单个Lys残基（K63），CD4Tl-UbR△G的组成性再循环可以转化为溶酶体靶向。CD4嵌合体的再循环倾向与其溶酶体靶向效率成反比，这证实了内体在确定泛素化货物在分选内体时的目的地方面的作用。2） E1-Ub激活酶的热变性严重抑制了ts20细胞中多泛素化CD4Tl-Ub的溶酶体递送。这种抑制是特异性的，因为E1失活不能干扰TfR的循环和Lamp1或CD4cc-UbRΔG的溶酶体传递，后者是具有泛素非依赖性分选信号的货物分子。3） 单泛素化CD4Tl-UbRΔG的多重聚合通过遗传和生化手段完成，恢复了嵌合体的溶酶体靶向性。这意味着Ub依赖的内体分选机制具有识别Ub链和多聚体Ub的可塑性。后一种现象在经历多重单泛素化和多泛素化的活化二聚酪氨酸激酶受体的脱敏中具有特殊意义(哈格隆德等。, 2003;吉萨等。, 2005)以及具有单泛素化亚基的寡聚多肽，如ROMK1 K+通道(林等。, 2005). 值得注意的是，组成性三聚体化未能将Ii-UbRΔG重新定向到溶酶体，而四聚体单-Ub在CD4cc-UbR△G的背景下快速传递到MVB/溶酶体。这表明溶酶体分选至少需要暴露四个Ub部分，尽管我们不能排除三聚作用掩盖了Ii-UbRΔG中UIM结合表面的可能性。4） 最后，我们表明，通过UbI44A突变破坏Ub-UIM–相互作用表面阻止了CD4Tcc-UbRΔG MVB/溶酶体的分选和恢复再循环，证实了Ub-结合蛋白在嵌合体溶酶体分选中至关重要的概念。
早期内分泌物中多和多泛素化物的识别
鉴于Ub识别作为一种内吞信号的生化和功能特征，观察到依赖于Ub的内胚体分选机制优先识别多泛素和多泛素而不是单泛素货物并不完全令人惊讶(Williams和Urbe，2007年). 虽然解码Ub作为一个排序基序依赖于不同细胞位置的不同适配器集，但Ub Ile44疏水性斑块的主要识别是由一个共同的α-螺旋Ub结合域介导的，即细胞表面和排序内体适配器的UIM(希克等。, 2005;Hurley和Emr，2006年). Eps15/15R和epsin，即质膜氯氰菊酯适配器，分别包含两个和三个UIM(Bonifacino和Traub，2003年;希克和邓恩，2003年). 内体适配器STAM有一个单一的UIM，而Hrs含有UIM的双面变体DUIM，它能够同时结合两个Ub，亲和力与UIM相当(乌尔韦等。, 2003;平野等。, 2006). 体外结合研究表明，UIM与单克隆抗体结合的亲和力极低，在0.1–2 mM范围内(Shekhtman和Cowburn，2002年;费希尔等。, 2003). 这可能解释了mono-Ub无法作为内部化服务(巴里雷等。, 2006)哺乳动物细胞跨膜转运的溶酶体信号(邓肯等。, 2006). 协同机制可能参与增强体内低亲和力UIM-Ub相互作用。这些可能包括适配器分子的多重聚合、适配器中Ub-结合域的增殖、特定分拣平台上适配器/货物的浓度以及UIM亲和力的调节(纸杯等。, 1997;陈等。, 1998;莱博格等。, 2002;萨克斯等。, 2002;巴赫等。, 2003;杉山等。, 2005;Hurley和Emr，2006年).
就Ub作为溶酶体分选信号的识别而言，Hrs和STAM之间稳定的复合物形成（也称为ESCRT0）可以促进多个Ub部分的结合。Hrs和STAM的酵母同源物–Vps27和Hse1–分别包含两个串联和一个单一UIM(Hurley和Emr，2006年;Williams和Urbe，2007年). 根据Monte Carlo模拟，Vps27/Hse1复合物与多个Ub相关，位于离膜不同的距离，并且可以经历较大的构象变化以适应多个Ub部分(布拉格等。, 2007). 考虑到STAM的VHS域也可以识别Ub(瑞穗（Mizuno）等。, 2003)，Hrs/STAM的异二聚化将暴露四个Ub结合位点。此外，重组Hrs的六聚化表明了寡聚化趋势(普兰等。, 2006)以及从HeLa细胞裂解物中分离500-600-kDa复合物中的内源性Hrs（未发表的观察结果），可能会进一步增加ESCRT0中功能性Ub结合位点的数量。最后，在Hrs-FYVE结构域中，通过氯氰菊酯募集和PtdIn3P结合，在内胚体双层涂层处，泛素化物和Hrs/STAM复合物的浓度都可以增加泛素化产物与ESCRT0的结合(萨克斯等。, 2002). 值得注意的是，eps15/15R/epsin适配器的同源或异源齐聚也可能有助于提高其对聚-Ub链的亲和力(纸杯等。, 1997;陈等。, 1998;马球等。, 2002;米勒等。, 2004;杉山等。, 2005;Hawryluk公司等。, 2006).
我们表明，尽管在UbR48K过度表达的情况下，CD4Tl-Ub的溶酶体靶向动力学较慢2-3倍，但体外重组Hrs对K48连接的多-Ub链的识别能力较差(d和b、 和补充图S4）。这些观察结果与UbR48K和UbR63K过表达在CD4Tl-Ub内化中可忽略的作用不一致(e） ，但符合epsin UIM适度的Ub链选择性(Wang和Struhl，2005年;Hawryluk公司等。, 2006). 与重组Hrs相比，依赖于Ub的内体分选机的Ub链特异性相对有限，这可以通过多种因素的组合来解释。Hrs的底物专一性可通过与STAM、氯氰菊酯重链和PtdIns3P结合而改变(Williams和Urbe，2007年). 此外，翻译后修饰，如Hrs/STAM的单泛素化和磷酸化，可能在体内ESCRT0结合特异性中发挥作用(排等。, 2005;霍勒等。, 2006). 最后，由于K48多-Ub链共轭和通过蛋白酶体的蛋白水解，STAM的可用性降低可能会影响泛素化货物的溶酶体分选动力学(Williams和Urbe，2007年).
货物分子的多泛素和多泛素化程度对溶酶体分选保真度的调节
我们设想了多分子和多分子Ub相对于单分子Ub作为溶酶体分选信号的两个优点。首先，泛素修饰的冗余性质可能允许底物和E2/E3酶配对以及Ub链配置的灵活性。尽管一些质膜蛋白发生K63-连接的Ub链连接，但在活化的EGFR中检测到K63-和K48-连接的Ub链(黄等。, 2006). 基于含有K48-lined Ub链的货物的溶酶体转移动力学明显较慢，优先使用K48-linked而非K63-linked Ub链结合将延迟激活受体的脱敏。其次，连接Ub链或多分子Ub可以通过内体上Ub连接酶和氘化酶的相反活性调节信号识别，从而微调分选效率(Amerik和Hochstrasser，2004年)与具有单一Ub-排序基序的双峰调控相反。这种调节在概念上类似于连接酶和去泛素酶在影响蛋白酶体破坏多泛素化多肽中所起的作用(科罗萨斯等。, 2006).
DUB和E3-Ub连接酶与ESCRT0成分的关联在酵母和哺乳动物细胞中都有记录(Clague和Urbe，2006年). 在酵母中，Vps27/Hse1复合物与DUB Ubp7和Rsp5连接酶结合，以控制进入液泡的分选效率(任等。, 2007). 在哺乳动物细胞中，STAM的SH3结构域招募UBPY（泛素异肽酶Y；加藤等。, 2000)AMSH（与STAM的SH3结构域相关的分子；麦卡洛等。, 2006). UBPY的异肽酶活性同时裂解K63和K48连接的Ub链，而AMSH对K63连接的Ub链表现出优先活性。因此，AMSH起到了关闭开关的作用，而UBPY取决于初级Ub链的配置和分选复合体中E3连接酶的活性，可能会加速或延迟溶酶体货物的输送。
虽然我们的FRIA实验使我们能够跟踪内化泛素化货物分子的内体分类，并强调了溶酶体靶向的必要和充分的Ub构型，但货物特异性泛素化的细胞位置和分子决定因素仍有待确定。然而，FRIA技术补充了现有方法，以相对较高的时间和空间分辨率跟踪内吞质膜蛋白的目的地，并将有助于阐明内吞体识别分选信号的分子基础。
