CArG元件控制平滑肌亚型的特异性表达平滑肌肌球蛋白体内

转基因小鼠的产生和分析。

如前所述，使用标准方法培育转基因小鼠(12)在弗吉尼亚大学转基因核心设施内。用转基因小鼠建立育种创始系。如前所述，对转基因小鼠进行分析和组织学分析(12). 为了确定转基因插入位点对转基因表达的可能位置影响，分析了每个转基因构建物的多个独立创始株系。弗吉尼亚大学动物使用和护理委员会审查并批准了这些研究中使用的所有动物程序。

核提取物的制备和电泳迁移率变化分析。

前面描述了从培养的SMC中制备核提取物(19). 从大鼠组织中提取的核提取物是按照前面所述的方法制备的(22)进行了以下修改。简而言之，组织取自雄性Sprague-Dawley大鼠。从主动脉、胃和膀胱中取出非平滑肌细胞层，并立即将组织冷冻在液氮中。用改良的缓冲液A（10 mM HEPES，pH 7.9，13 mM KCl，0.1 mM EDTA，0.5 mM DTT，0.05%NP-40）和完整的无EDTA蛋白酶抑制剂（罗氏分子生物化学）对冷冻组织进行粉状和清洗。将样品重新悬浮在10 ml缓冲液A中，并在冰上培养5分钟。对样品进行离心，并将其重新悬浮在10个填充细胞体积的缓冲液a中。将NP-40添加至最终浓度0.3%。然后使用Dounce均质机将样品均质。显微镜观察证实细胞膜破裂。将离心样品重新悬浮在改良的缓冲液C中（20 mM HEPES，pH 7.9，420 mM NaCl，0.2 mM EDTA，25%甘油，0.5 mM DTT，0.01%NP-40，完全不含EDTA），并在冰上轻轻搅拌培养30分钟。通过离心法去除细胞碎片。将样品更换为缓冲液，并使用Ultrafreel 4浓缩器（美国马萨诸塞州贝德福德市Millipore Corp.）进行浓缩。使用体外转录/翻译系统（美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司）生产重组SRF。

电泳迁移率转移分析（EMSA）探针的感觉链序列如下：CArG1，5′-gacttcctttatggcctga-3′；CArG2，5′-ctggccttttttgttt-3′；和内含子CArG，5′-catgcccttatggtagtg-3′。EMSA如前所述执行(21). 简而言之，20000 cpm³²P标记探针与核提取物在20μl结合缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH7.5，50 mM NaCl，0.5 mM DTT，10%甘油，0.05%NP-40）和0.25μg poly（dI-dC）·（dI-d C）中孵育。反应在冰上孵育20分钟。对于超位移分析，在20分钟的培养期后添加1μl抗SRF抗体，并将反应再培养10分钟。反应在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行。

CArG元件的突变证明了体内SMC亚型中CArG元素的不同需求。

为了检查体内CArG元素的功能作用，–4200/+11600拉克Z轴SM-MHC公司利用CArG突变体构建物产生转基因小鼠。表中总结了观察到的表达模式​表1。1CArG1突变导致拉克分析了所有三个独立转基因创始株系的所有SM组织中的Z表达。相比之下，所有三个野生型转基因创始品系SM-MHC公司–4200/+11600拉克Z结构显示几乎所有SMC组织中都有报告基因表达（图​（图2）。2). 这些数据清楚地表明，CArG1是表达SM-MHC公司所有SM组织中的体内基因。

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图2

野生型和突变型SM-MHC报告基因表达的宏观检测拉克Z转基因小鼠。转基因小鼠（4-6周龄）用2%甲醛/0.2%戊二醛溶液灌流固定。图片显示拉克Z报告基因在野生型-4200/+11600的各种组织中的表达拉克Z小鼠(一,e（电子）,我,米,q个)，CArG1-突变小鼠(b条,（f）,j个,n个,第页)，CArG2-突变小鼠(c（c）,克,k个,o个,秒)和内含子CArG-突变小鼠(d日,小时,我,对,t吨). (一–d日)心脏和主动脉的前视图。(e（电子）–小时)肺。(我–我)食道、胃和十二指肠。(米–对)小肠的一部分。(q个–t吨)膀胱。组织被苯甲酸苄酯/苯甲醇清除一–小时.

CArG2突变导致SM组织中报告活性的差异性降低。拉克胃肠道（GI）中的Z表达降低，但在成年小鼠中很容易检测到（图​（图2，2，i和m vs.k和o）。膀胱中的表达与野生型小鼠中观察到的表达相似（图​（图2，2，q对s）。在大血管中未观察到表达，包括主动脉、肺动脉、冠状动脉、颈动脉、腹腔动脉和股动脉以及腔静脉（图​（图2，2a和e与c和g）。然而，在较小的动脉中观察到非常弱的报告基因表达，包括肠系膜小动脉（数据未显示）。CArG2突变也几乎消除了气管和支气管中的表达（图​（图2，2，e与g）。

内含子CArG突变导致血管平滑肌细胞特异性表型。报告者在胃肠道、泌尿道和气道中的表达与野生型转基因小鼠在四个独立内含子CArG突变系的成人和胚胎中的表达相同（图​（图2，2，e，i，m，q vs.h，l，p，t）。静脉中的表达也相当于野生型小鼠。然而，包括主动脉、颈总动脉和锁骨下动脉主干在内的大动脉中的表达在所有血管中均完全沉默（图​（图2，2a和e与d和h）。有趣的是，来自胸主动脉的小分支动脉，包括肋间动脉，显示出与野生型小鼠相同的转基因表达（图​（图3，三、c和d）。在颈动脉近端未观察到表达（图​（图3e），三e） 而在远端颈总动脉中，少数细胞呈阳性染色，颈内动脉和外动脉呈强染色。在包括基底动脉、Willis环动脉和脑动脉在内的头部动脉中也观察到内含子CArG突变体的强烈表达（数据未显示）。在腹主动脉中未检测到报告者的表达，而腹主动脉的分支动脉，包括腹腔动脉、肾动脉和肾上腺动脉，均呈强阳性染色（图​（图3，三，a与b）。事实上，导管动脉和分支动脉之间的表达从不可检测到的突变为高水平的突变非常显著（参见插图，图​图3，三、b和f）。腹部血管的组织切片清楚地显示了内含子CArG突变转基因小鼠主动脉中报告基因表达的选择性消失（图​（图3，三，g–j）。在髂总动脉中几乎检测不到表达，而在其分支中表达强烈，包括股动脉（图​（图3三f） ●●●●。

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图3

内含子CArG突变小鼠中报告基因的大动脉特异性沉默。在野生型中，腹部器官在血管和尿道中有报告表达(一)和内含子CArG突变体(b条)转基因小鼠。为了更好地说明转基因在大动脉中的表达，移除了几个较小的动脉和结缔组织，并清除了组织。肠系膜上动脉染色阳性，从内含子CArG突变小鼠组织中取出。一部分组织在插图中膨胀b条箭头表示主动脉的位置，由于缺乏染色而不可见。注意，无论是野生型还是内含子型CArG突变体，肾脏内的血管都没有染色。(c（c）和d日)野生型胸主动脉和分支动脉(c（c）)和内含子CArG突变体(d日)转基因小鼠。(e（电子）)内含子CArG突变转基因小鼠颈胸段大动脉视图。(（f）)内含子CArG突变体腹部的大动脉及其分支。动脉的一部分在插图中扩张(（f）). (克–j个)野生型腹主动脉和下腔静脉的组织学检查(克,我)和内含子CArG突变体(小时,j个). 装箱区域(克,小时)放大倍数更高(我,j个). 主动脉；DA，动脉导管；下腔静脉；SCA，锁骨下动脉。

转基因在冠状动脉中的表达在内含子CArG突变株系中有所不同，可能是由于转基因插入位点的位置效应。在两行中，冠状动脉中检测到一些表达，而在其他行中观察到很少或没有表达。然而，即使在前两个品系中，转基因的整体表达也明显弱于野生型转基因品系。阳性染色局限于内含子CArG突变体的主干和几个主要分支，而在野生型小鼠的较小分支中可检测到表达。然而，由于β-半乳糖苷酶染色的定性性质和各品系间表达水平的差异性，我们无法得出冠状动脉内含子CArG的必要性程度。

同样，含有突变内含子CArG转基因的小鼠在肺动脉和肺静脉中的表达也不同。在冠状动脉中显示转基因表达的两个品系在肺血管中检测到转基因表达，而其他品系则没有表达。即使在两个表达系中，转基因表达也很弱，这使得与图中所示的野生型小鼠的肺部相比，肺部的染色看起来很稀疏​图2。2然而，显微镜下，肺血管中的一些SMC染色呈阳性（数据未显示）。野生型转基因在不同转基因系的肺血管中的表达也有所不同，与其他血管床相比，其表达水平，尤其是在肺静脉中的表达水平通常较弱。鉴于转基因表达在肺循环中的变异性和脆弱性，对于内含子CArG在肺血管中的作用还没有明确的结论，尽管结果显示在两个创始品系中没有表达，表明它可能具有某些功能。报告者在内含子CArG突变转基因小鼠中的表达表明，内含子CAr G在大动脉中的转基因表达是不可或缺的，而在较小的动脉、静脉和内脏SMC中则是不可或缺的。绝对需要内含子CArG的大动脉在很大程度上符合弹性动脉的分类。

这个SM-MHC公司该基因是晚期SM分化的标记，我们之前显示野生型-4200/+11600的表达拉克直到胚胎期（ED）17.5-19.5，Z转基因在许多SMC组织中相对较弱(12). 因此，为了便于分析发育过程中CArG突变的影响，我们将分析限制在ED 19.5。结果表明，每个CArG突变转基因小鼠的转基因表达模式与成年小鼠的表达模式基本一致（图​（图4）。4). 在CArG1转基因小鼠的胚胎中未观察到表达。在CArG2-突变转基因小鼠中，仅在胃肠道中观察到报告基因表达。在内含子CArG突变转基因小鼠中，胃肠道和气道中的表达与野生型转基因系中的表达相同。虽然很容易检测到报告基因在较小动脉中的表达，但在内含子CArG突变转基因小鼠胚胎的大动脉中未检测到表达。

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图4

胚胎中的转基因表达。胚胎于第19.5天收获，沿着中线进行剥皮和矢状切片，以允许染料渗透。对胚胎进行染色和清除。在阴性和CArG2突变转基因小鼠的肠道上观察到的染色是由于内源性β-半乳糖苷酶活性，并且局限于上皮层内。食管；H、 心脏；St，胃；支气管。

总之，转基因小鼠的数据表明，在转基因小鼠体内SMC亚型中，每个CArG元素的需要量不同。CArG1对所有SMC的转录至关重要，CArG2在大血管中不可或缺，但在胃肠道和尿道中的作用相对较小，而内含子CArG仅在大弹性动脉中绝对需要。

完整组织中的SMC表达SRF和其他与CArG元件结合的蛋白。

作为确定通过多个CArG元件控制SMC亚型特异性转录调控机制的初始步骤，我们使用EMSA检测了每个CArG元素的蛋白结合特性。由于没有SMC培养细胞系能够模拟SMC亚型在以下方面的忠实分化表型SM-MHC公司转录控制，我们从完整的大鼠组织中制备核提取物。如图所示​图5，5，每个CArG探针与组织核提取物形成几个DNA蛋白复合物。组织核提取物形成的主要移位带（复合物A和B）的迁移率与培养的SMC核提取物相同。复合物A在组织和培养细胞中的流动性与重组SRF形成的流动性相同。使用抗SRF抗体的超移位分析表明，复合物A和B都含有SRF（图​（图6）。6). EMSA实验中还形成了几个非SRF移位带，这些移位带是由冷的自竞争物特别竞争的，但不是由无关序列竞争的（数据未显示）（复合物C–G）。每个探针与SM组织核提取物形成了大致相似的位移带模式。然而，肝脏或培养的SMC提取物形成的移位带与SM组织提取物形成的有些不同。例如，CArG1、CArG2和内含子CArG探针与肝脏和培养的SMC提取物形成复合物E，而此复合物不是与SM组织提取物形成的。相反，复合物F形成内含子CArG探针，而肝脏样本中没有SM组织样本。虽然需要进一步分析以确定这些非SRF DNA结合蛋白在细胞转录调控中的重要性，但数据表明，能够与CArG探针结合的非SRF DNA结合蛋白可能在SM和非SM组织中差异表达。

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图6

内含子CArG结合蛋白的超位移分析。在冰上孵育20分钟后，将1微升抗SRF-Ab加入内含子CArG探针和核提取物的结合反应中，并将反应在冰上进一步孵育10分钟。添加Ab导致含SRF的配合物（A，B）发生超位移。与其他CArG探针形成的配合物A和B也发生了超移位（数据未显示）。SS表示超移络合物。

在生理条件下，SRF将SM-MHC基因的CArG元件结合在完整的染色质内。

尽管有大量证据表明，在体外试验中，SRF可以与CArG元件结合，并且在培养SMC的报告试验中，通过CArG元素，SRF参与转录调控(10,19)在染色质完整的情况下，缺乏SRF参与内源性SMC标记基因转录的直接证据。许多研究表明，转录因子与顺式外显子报告基因与染色体基因间的关系(23). 研究还表明，蛋白质与顺式染色质中的元素与EMSA中用寡核苷酸探针观察到的元素有很大不同(24). 以前，我们使用体内甲基化足迹法显示内源性SM-MHC公司染色质中的基因在体内被完整的主动脉占据(12). 体内足迹实验同样显示了内含子CArG也被完整主动脉占据的证据（Manabe和Owens，未发表的观察结果）。然而，这些实验不允许鉴定CArG结合蛋白。

直接说明SRF是否约束内生SM-MHC公司CArG元素，我们采用了ChIP分析。用甲醛直接固定完整培养的大鼠主动脉SMC、L6大鼠成肌细胞、L6肌管和Rat1成纤维细胞。用抗SRF抗体免疫沉淀交叉连接的染色质。然后纯化沉淀的染色质DNA并进行PCR分析以富集目标序列。基因启动子胰岛素,β-珠蛋白、和骨骼α-肌动蛋白基因（图​（图7，7，A–C行），在SMC中是静默的，以及SM-MHC公司5′-侧翼序列（图​（图7，7，D行），缺乏CArG元素，用于控制反应。这些序列的扩增显示了ChIP和PCR扩增的背景水平（图​（图7，7，第A–D行）。然而，抗SRF抗体特异性地富集了5′-侧翼CArG区（CArG1和CArG2）和SM-MHC公司基因（图​（图7，7与阴性对照基因启动子的背景扩增相比（图​（图7，7，第A-D行；车道3）。重要的是，相同SM-MHC公司在不表达SM-MHC公司基因（图​（图7，7，第E行和第F行；车道6、9和12）。由于骨骼α-肌动蛋白已证明在骨骼肌细胞中含有活性的CArG元件，该启动子被用作L6细胞的阳性对照。正如预期的那样骨骼肌动蛋白启动子在来自L6成肌细胞和肌管的SRF免疫沉淀样品中富集（图​（图7，7，C行，6和9道），但在SMC或Rat1细胞中没有，进一步证明了SRF抗体在这些实验中的特异性。值得注意的是，这些ChIP实验中使用的PCR检测方法不是定量的。因此，不可能确定SRF与SM-MHC公司CArG元素。尽管如此，ChIP实验表明SM-MHC公司在完整培养的SMC中，CArG区域与染色质中的SRF结合。此外，观察到SRF结合了内源性CArG区域SM-MHC公司完整SMC染色质中的基因，而不是L6骨骼肌细胞或Rat1成纤维细胞中的基因提供了证据，证明体内存在机制来控制SRF与SM-MHC公司细胞特异性CArG。

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图7

SRF与内源性CArG区域结合的ChIP分析。用PCR检测免疫沉淀染色质片段中的内源性CArG区域。通道1、4、7和10显示无抗体对照沉淀样品的PCR扩增。通道2、5、8和11显示免疫沉淀总输入DNA的1:100稀释样品的扩增。通道3、6、9和12显示免疫沉淀染色质片段与抗SRF抗体的靶序列扩增。

SMC特异性转录控制需要多个转录调控模块。

越来越多的证据表明，基因表达的时空调控需要一个由多个调控模块组成的复杂调控系统，每个调控模块都包含多个顺式元素(25). 例如，海胆Endo 16号机组基因在2-kb区域内的七个模块中包含至少33个转录因子结合位点，这些模块在不同发育阶段的功能不同(26). CArG突变体构建的转基因小鼠的结果表明，至少需要两个区域（即5′-侧翼CArG和内含子CArG区域）才能在体内转录CArG基因SM-MHC公司基因。我们正在进一步绘制SM-MHC公司基因位点。初步数据表明，5′-侧翼和第一内含子包含多个阳性和阴性转录调控区，不同的SMC亚型需要不同的模块子集（Manabe和Owens，未发表的观察结果）。为什么可能SM-MHC公司体内转录需要如此复杂的转录调控方案？

很明显，不同血管床中的血管平滑肌细胞在体内的局部环境差异很大。血管床在血压、流量和色调方面的生理作用差异需要非常不同的血管壁结构(27). 因此，SMC无疑会受到不同血管床之间的血管活性/神经元刺激和环境信号的影响。如果考虑到血管和内脏SMCs之间的差异，这种差异就更加显著，而且已经很好地确定SMCs来自不同的胚胎学起源(28). 最后，还必须考虑到SMCs的功能在发育过程中和成年动物中可能会有很大差异，因为它们在基质沉积、血管形态发生以及血管修复中起着关键作用(28). 由于这些差异，体内SMC需要对非常不同的输入（环境提示）作出反应，这些输入激活各种细胞内信号通路并协调表达必要的基因。因此，可以想象，即使控制相同的基因，例如SM-MHC公司不同环境中的SMC亚群可能需要使用不同的调控途径。换句话说SM-MHC公司基因调控程序的发展使得它使用各种调控途径来控制异种胞外环境和胞内环境中的转录。事实上SM-MHC公司该基因支持一种假设，即SMC亚型中激活了不同的转录调控程序。

内含子CArG的弹性动脉特异性活性和SMCs的异质性。

内含子CArG突变体最显著的特征是，转基因在主动脉等弹性动脉中完全沉默，而在直接从主动脉分支的中小型动脉中很容易检测到表达。对于内含子CArG的差异要求，至少有两种可能的解释，它们不一定相互排斥。首先，我们需要考虑SMC胚胎起源在大动脉和小动脉之间的异质性。据推测，SMC至少有三种胚胎起源：局部间充质细胞、神经嵴细胞和心外膜前细胞(28). 在主动脉中，主动脉球和升主动脉主要由神经嵴衍生的SMC组成，降主动脉主要由间质衍生的SMCs组成(29). 然而，在内含子CArG突变转基因小鼠中，无论细胞的位置如何，主动脉中的SMC均呈阴性染色，并且没有已知的谱系差异符合内含子CAr G依赖性的分布。因此，胚胎起源的差异不可能仅仅决定内含子CArG对转录控制的需求。

第二，如上所述，SMC在体内的表型和功能的异质性可能需要多个转录程序来控制同一基因。弹性动脉和肌肉动脉中SMC生理功能的差异也需要SMC表达不同的基因集来履行其功能作用。因此可以想象，内含子CArG整合在一个调节程序中，该程序处理弹性动脉特有的环境线索，并控制对此类血管功能至关重要的基因表达。许多基因，包括离子通道、收缩蛋白、生长因子/受体和转录因子，在血管床中表现出差异表达。例如，转录因子，瑞士法郎1(Hrt2/Hey2/HERP1/拥堵)，主要在主动脉中表达(30). 比较这些基因的转录调控机制，并确定差异表达转录因子在SMC亚型选择性基因调控程序控制中的功能，将是令人感兴趣的。

体内SM-MHC转录的SRF依赖性控制。

目前的研究提供了证据表明SRF与内源性CArG元件结合SM-MHC公司完整染色质背景下的基因，与典型DNA结合研究中使用的寡核苷酸片段相反。Landerholm等人最近发现，在体外禽原心外膜细胞分化系统中，两种显性阴性SRF抑制SMC分化并降低SMC标记基因的表达，包括SMα-肌动蛋白和SM22α(6). 这些数据表明，SRF在内源性SMC分化标记基因的控制中具有重要作用。因此，一个关键问题是：显然不是SMC特异性的SRF如何调节SMC特异的基因表达？各种假设并非相互排斥。首先，尽管SRF明显不是细胞特异性的，但不同细胞类型之间的SRF表达水平存在很大差异，这可能至少在一定程度上促进细胞特异性SRF-CArG依赖性基因表达(31). 其次，SRF的结合亲和力可能通过与其他蛋白质（如MHox）的相互作用以细胞类型依赖的方式进行调节(32)或通过磷酸化(33). 第三，SRF可能形成SMC特异性多蛋白复合物。虽然我们在EMSA实验中没有观察到SMC特异的高阶复合物，但较长的探针可能会在EMSA中形成这种多蛋白复合物。最后，染色质重塑可能在转录调控模块活性的调节中发挥重要作用。转录因子与顺式元素受染色质结构的影响很大。研究还表明，各种转录因子结合组蛋白乙酰化酶和脱乙酰化酶，从而改变染色质结构(34). ChIP分析结果（图​（图7）7)证明了SM-MHC公司CArG区域仅在SMC中被SRF结合，尽管L6心肌细胞的核提取物完全能够结合EMSA中的CArG元素（Manabe和Owens，未发表的观察结果）。相反，SRF仅在L6心肌细胞中结合骨骼肌α-肌动蛋白启动子，而在SMC或成纤维细胞中不结合。这些数据可能极其重要，因为它们表明内源性SM-MHC公司该基因仅在SMC染色质中有效。也就是说SM-MHC公司在非SM细胞系中，基因可能处于“闭合状态”。

本研究得到了NIH的资助（RO1 HL-57353，PO1 HL-19242，RO1 HL-38854给G.K.Owens，U54 HD-28934给弗吉尼亚大学组织学研究中心）以及美国心脏协会弗吉尼亚附属机构的奖学金（VA-F98255V给I.Manabe）。我们非常感谢Diane Raines、Margaret Ober和Angela Miller提供的专业技术援助。