早期糖尿病血管疾病中一种羟基自由基样物质氧化食蟹猴动脉壁蛋白

动物。

维克森林大学动物护理和使用委员会批准了所有动物研究。16只成年雄性食蟹猴(束状猕猴)在这项为期6个月的研究之前和整个研究期间，研究人员连续2个月食用西式饮食（0.28毫克胆固醇/kcal，45%的热量来自脂肪）。将16只猴子随机分为两组，其中一组通过静脉注射30 mg/kg链脲佐菌素（STZ）诱发糖尿病(28). 以前曾报道过这些动物的血脂和脂蛋白测定以及动脉粥样硬化测定，包括总损伤胆固醇(28). 对照组中有一只动物死于与研究无关的原因。

组织收集。

研究结束时，用盐酸氯胺酮（15 mg/kg肌肉注射）麻醉动物，用戊巴比妥钠（80 mg/kg静脉注射）深度麻醉动物，然后用抗氧化剂溶液（含50μM EDTA的乳酸林格溶液[一种金属螯合剂]）经左心室灌注、2.4μM丁基羟基甲苯[BHT，一种脂溶性抗氧化剂]和0.1%乙醇[vol/vol]），以防止体外氧化。通过下腔静脉尾侧的一个切口取出血液，对动物进行灌注，直到灌注液无色。从15只动物（7只对照组和8只经STZ治疗的猴子）收集胸主动脉，并立即冷冻在N液体中₂在抗氧化剂溶液中。组织在-70°C下冷冻直至分析。

蛋白质分离。

为了获得体内样品，主动脉组织在4°C的抗氧化剂缓冲液（100μM二乙烯三胺五乙酸[DTPA]、50μM BHT、1%[vol/vol]乙醇和10 mM 3-氨基-1,2,4-三唑，50 mM磷酸钠缓冲液[pH7.4]）中均质，短暂冷冻，然后解冻。如前所述，所有后续程序均在4°C下进行(31). 添加同位素标记的内标物，样品在110°C氩气下水解24小时(31). 体外研究所需的蛋白质在4°C下从主动脉组织中分离出来，主动脉组织是在-70°C下采集并储存在抗氧化剂溶液中的。主动脉组织（～50 mg）在5 ml缓冲液A（0.1 mM DTPA[pH7.4]）中均质，冻融一次，并在10000下离心克持续10分钟。将含有可溶性组织蛋白的上清液与经过Chelex树脂（BioRad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA）柱的水进行透析，以去除游离金属离子。将制剂储存在-70°C下。

羟基自由基、酪氨酸自由基和ONOO对体外蛋白质的氧化作用^–.

所有反应（每毫升含1 mg主动脉蛋白）均在37°C的缓冲液B（50 mM磷酸钠[pH7.4]）中进行，缓冲液B通过Chelex柱去除金属离子。用5mM或15mM补充缓冲液D类-葡萄糖。孵育2小时（羟基自由基）、30分钟（酪氨酸自由基）或5分钟（ONOO^–)，通过加入0.2mM DTPA（pH 7.4）、300nM过氧化氢酶和0.1mM BHT终止反应。使用含有0.2mM CuSO的缓冲液B产生羟基自由基₄和5 mM H₂O（运行）₂为了抑制残留的过氧化氢酶活性，我们在反应混合物中加入3-氨基-1,2,4-三唑（0.1mM）。通过添加0.1 mM H生成酪氨酸自由基₂O（运行）₂缓冲液B补充20 nM髓过氧化物酶，0.2 mM我-酪氨酸和0.1 mM DTPA。由亚硝酸2-乙氧基乙酯和H合成过亚硝酸根₂O（运行）₂(32)并储存在-80°C。使用前立即解冻过氧亚硝酸盐，并用分光光度法测定其浓度（ε₃₀₂=1670米^–1厘米^–1; 裁判。33). 如有指示，缓冲液B补充25 mM NaHCO_三添加ONOO之前^–对于GC/MS分析，蛋白质用冰镇三氯乙酸沉淀（最终浓度10%）并用上述酸水解。

氨基酸衍生化和质谱分析。

通过固相萃取从酸水解液中分离氨基酸，并将其转化为n个-如上所述的丙基七氟丁酰基衍生物(31). 通过同位素稀释负离子化学电离GC/MS对衍生物进行定量(16). 对于苯丙氨酸，我们在米/z383（百万^––HF）和同位素标记的内标离子米/z389; 对于酪氨酸米/z417[米^––CF公司_三（CF₂)₂CHO]和同位素标记的内部离子米/z423; 对于3-硝基酪氨酸米/z464（百万^––HF）和同位素标记的内标离子米/z470; 对于正交的-酪氨酸，离子米/z595离子（M^––HF）和同位素标记的内标离子米/z601; 对于元-酪氨酸，离子米/z417（米^––HF）和同位素标记的内标离子米/z423; 对于二酪氨酸米/z1208离子（M^––HF）和同位素标记的内标离子米/z1220.所有氨基酸的检测限（信号/噪声>10）小于1 pmol。

主动脉蛋白中的原酪氨酸在体外被氧化。

当我们将来自主动脉组织的蛋白质暴露于羟基自由基时，主要产物是正交的-酪氨酸（图​（图1a）。1a） ●●●●。过亚硝酸根（而非酪氨酸自由基）也产生了大量这种异常氨基酸。葡萄糖浓度（15 mM）与在糖尿病患者和猴子中观察到的浓度相似，不会影响产品产量（图​（图1a）。1a） ●●●●。添加NaHCO也没有_三至ONOO^–系统（图​（图1a）。1a） 。这些观察结果表明正交的-酪氨酸是羟基自由基介导的氧化反应的主要产物，当ONOO^–是氧化剂。

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图1

产品产量正交的-酪氨酸(一),元-酪氨酸(b条),o、 o’-二酪氨酸(c（c）)和3-硝基酪氨酸(d日)在体外不同系统氧化的主动脉组织中。主动脉组织取自非糖尿病动物。从该组织中分离的可溶性蛋白质（1 mg/ml）在37°C的缓冲液B中被羟基自由基、酪氨酸自由基或ONOO氧化^–如方法中所述。如有指示，缓冲液B补充25 mM NaHCO_三ONOO之前^–添加（过氧亚硝酸盐+HCO_三^–).D类-反应混合物中含有指示浓度的葡萄糖。添加后¹³C标记的内标物，蛋白质被脱脂、水解并进行固相萃取。通过同位素稀释负离子电子捕获GC/MS和选择离子监测对分离的氨基酸进行衍生和分析。值为三次测定的平均值±SEM，并归一化为前体氨基酸水平。^A类P（P）方差分析显示<0.01。

主动脉蛋白中的代谢酪氨酸在体外被氧化。

羟基自由基还产生了元-酪氨酸（图​（图1b），1b） ，尽管ONOO^–产生了大量的这种氨基酸。相反，酪氨酸自由基未能升高元-酪氨酸水平。5 mM和15 mM葡萄糖均不影响产品产量，NaHCO_三添加到ONOO时没有效果^–氧化系统。中的高程正交的-酪氨酸水平总是伴随着元-酪氨酸。这些观察结果表明正交的-酪氨酸和元-酪氨酸是羟自由基氧化蛋白质的主要产物。元-ONOO时也会产生酪氨酸^–是氧化剂。在生理范围内葡萄糖浓度的变化不会显著影响正交的-酪氨酸和元-暴露于羟基自由基或ONOO的组织蛋白中的酪氨酸^–.

o、 主动脉蛋白中的o’-二酪氨酸在体外被氧化。

将主动脉蛋白暴露于氧化系统中，氧化系统产生羟基自由基或酪氨酸自由基升高o、 o’-二酪氨酸水平，这两个系统产生了类似的绝对产量（图​（图1c）。1c） ●●●●。过氧亚硝酸盐（含或不含NaHCO_三)还提高了o、 o’-二酪氨酸，但产率小于羟基自由基或酪氨酸自由基。同样，葡萄糖（5 mM或15 mM）没有影响。

体外氧化主动脉蛋白中的3-硝基酪氨酸。

主动脉蛋白暴露于1 mM ONOO^–在体外，3-硝基酪氨酸水平大大提高（～60倍）。然而，当ONOO时，蛋白质硝化作用最小^–在蛋白质添加前2分钟添加（数据未显示）。这表明硝化中间体要么是ONOO^–相反，当我们使用产生酪氨酸自由基或羟基自由基的系统时，3-硝基酪氨酸水平没有上升（图​（图1d）。1d） ●●●●。同样，5 mM或15 mM葡萄糖未能影响产品产量；碳酸氢钠_三也未能影响ONOO^–系统。这些结果表明，当ONOO时，3-硝基酪氨酸是主要产物^–体外氧化主动脉蛋白。

食蟹猴的糖尿病、血脂和动脉粥样硬化。

所有8只注射STZ的食蟹猴都出现了高血糖，糖化血红蛋白显著增加160%（基线，4.6%；STZ后3周，7.4%）。这一高水平在研究期间持续存在（STZ后6个月，8.3%）。相反，在整个研究过程中，7只对照动物的糖化血红蛋白水平保持不变（基线4.5%；6个月时为3.7%）。

如前所述(28)高血糖6个月后，糖尿病猴的血浆胆固醇有高于对照组动物的趋势（糖尿病11.1±1.0mmol/l，对照组8.9±1.2mmol/l），但这种差异没有达到统计学意义。血浆甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平没有变化。然而，糖尿病动物的股主动脉和腹主动脉的动脉粥样硬化程度显著增加(28). 这些动物的胸主动脉胆固醇水平显著升高（糖尿病组12.7±2.4 mg/g；对照组6.8±2.6 mg/g；P（P）< 0.05).

质谱法检测食蟹猴主动脉中的正酪氨酸、间酪氨酸、3-硝基酪氨酸和o，o'-二酪氨酸。

为了确定非糖尿病猴的动脉壁是否含有氧化氨基酸，我们对对照动物胸主动脉的新鲜分离组织进行了分析。用酸水解组织后，我们用n个-丙醇和七氟丁酸酐。然后用GC/MS在负离子电子捕获模式下分析衍生物。表现出与正品相同的主要离子和保留时间的化合物正交的-酪氨酸，元-酪氨酸，3-硝基酪氨酸,和o、 o’-检测到二酪氨酸。选定的离子监测表明，来自氨基酸的离子与来自正品的离子共同洗脱¹³C标记的内部标准，如图所示​图22对于正交的-酪氨酸，元-酪氨酸，以及o、 o’-二酪氨酸。

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图2

检测n个-丙基七氟丁酰基衍生物正交的-酪氨酸(一),元-酪氨酸(b条)、和o、 o'-二酪氨酸(c（c）)通过选择性离子监测负离子电子捕获GC/MS在猴胸主动脉组织中进行。组织样品脱脂，用酸水解，并在C-18柱上进行固相萃取。分离的氧化氨基酸经衍生化并通过GC/MS进行分析。注意，主要离子的共同洗脱预计用于(一)正交的-酪氨酸(米/z595）与正交的-[¹³C类₆]酪氨酸(米/z601), (b条)元-酪氨酸(米/z417）与元-[¹³C类₆]酪氨酸(米/z423），以及(c（c）)o、 o’-二酪氨酸(米/z1208）与o、 o’-[¹³C类₁₂]二酪氨酸(米/z1220).

主动脉样本含有不同数量的各种氧化氨基酸（图​（图3，三，a–d）。正交的-酪氨酸含量最高（0.2–0.3 mmol/mol苯丙氨酸），o、 o’-二酪氨酸最少（<0.1 mmol/mol酪氨酸），3-硝基酪氨酸和元-酪氨酸存在于中间水平（0.1-0.2mmol/mol前体氨基酸）。这些结果表明，非糖尿病猴主动脉组织蛋白的酸水解物含有可检测到的氧化氨基酸水平。

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图3

同位素稀释GC/MS定量(一)正交的-酪氨酸(b条)元-酪氨酸(c（c）)o、 o’-二酪氨酸，和(d日)从正常和糖尿病食蟹猴分离的主动脉蛋白中的3-硝基酪氨酸。添加后¹³在6个月的研究结束时，从7只对照动物和8只糖尿病动物身上采集的C标记内标物主动脉组织被脱脂、水解并进行固相萃取。分离的氨基酸经衍生化后，采用同位素稀释负离子电子捕获GC/MS和选择性离子监测进行分析。对每只动物主动脉三个不同区域的组织样品进行分析。将值归一化为前体氨基酸。^A类P（P）<0.01和^B类P（P）<0.005（按学生）t吨测试。

糖尿病食蟹猴主动脉蛋白中的正酪氨酸、间酪氨酸和o，o’-二酪氨酸水平。

为了确定糖尿病高血糖是否会氧化损伤动脉壁，我们分析了七只对照猴和八只糖尿病食蟹猴的样本，从每只动物的胸主动脉的三个不同区域取样（对照组21次测定，糖尿病组24次测定）。糖尿病动物的主动脉蛋白含有40%以上正交的-酪氨酸含量高于对照组动物（糖尿病组为0.36±0.01 mmol/mol；对照组为0.26±0.01 mm ol/mol苯丙氨酸；P（P）<0.01）（图​（图3a）。三a） ●●●●。当我们分析同一样本中的蛋白结合物时元-酪氨酸（图​（图3b），三b） ，我们检测到糖尿病样品中的含量比对照组高60%（糖尿病，0.18±0.01 mmol/mol；对照组，0.11±0.01 mmol/mol苯丙氨酸；P（P）< 0.01). 这些结果表明，蛋白质结合水平正交的-酪氨酸和元-在糖尿病动物的动脉壁中，酪氨酸也升高到类似程度。

接下来我们分析了相同的组织o、 o’-二酪氨酸（图​（图3c）。三c） ●●●●。糖尿病样品中的浓度是对照样品的四倍（糖尿病，25±3μmol/mol；对照，6±1μmol/mol酪氨酸；P（P）<0.005）。这表明o、 o'-糖尿病猴主动脉蛋白中的二酪氨酸水平也升高。

在糖尿病主动脉组织中，o、 o'-与相比，二酪氨酸表现出最大的相对增加（300%），但最小的绝对增加（0.02 mmol/mol）正交的-酪氨酸和元-酪氨酸。这反映了组织中氧化氨基酸基线水平的显著差异。相反，正交的-酪氨酸的绝对增加量最大（0.10mmol/mol），但相对增加量最小（40%）。组织水平的绝对增加元-酪氨酸（0.07 mmol/mol）略小于正交的-酪氨酸，但相对增加幅度较大（60%）。

糖尿病食蟹猴主动脉蛋白中的3-硝基酪氨酸水平。

最后，我们分析了3-硝基酪氨酸的分离主动脉蛋白（图​（图3d）。三d） ●●●●。糖尿病动物和对照组之间没有显著差异（糖尿病，0.08±0.02 mmol/mol；对照组，0.10±0.02 mm ol/mol酪氨酸）。总的来说，这些结果表明正交的-酪氨酸，元-酪氨酸，以及o、 o’-糖尿病猴主动脉蛋白中的二酪氨酸选择性升高，而3-硝基酪氨酸水平保持不变。

我们感谢N.Holmberg的技术援助和G.Yeh的有益讨论。质谱实验在华盛顿大学医学院质谱资源中心进行。本研究得到了NIH的资助（DK-02456、AG-15013、DR-56341、AG-13629、DK-56341，RR-00954、HL-63448和RR-07009）。S.Pennathur是美国糖尿病协会以导师为基础的博士后奖学金的获得者。K.N.Litwak是国家研究资源中心博士后奖学金的获得者。