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临床投资杂志。2007年10月1日；117(10): 2920–2928.
2007年10月1日在线发布。 数字对象标识：10.1172/JCI31692
预防性维修识别码：项目经理1994614
PMID：17909628

CX3CR1依赖性视网膜下小胶质细胞积聚与年龄相关性黄斑变性的主要特征相关

克里斯托夫·康巴迪埃,1,2,三 查尔斯·费米,4,5,6 威廉·拉乌尔,4,5,6 妮可·凯勒,4,5,6 马修·罗德罗,1,2 阿德琳·佩扎德,1 索菲·拉瓦莱特,4,5,6 玛丽安·霍西尔,4,5,6 劳伦特·乔内,4,5,6 艾米莉·皮卡德,4,5,6 帕特里斯·德布雷,1,2,三 米尔娜·西林扬,7 菲利普·德特尔,1,2 塔尼娅·费罗基,1 所罗门-伊夫·科恩,8 多米尼克·乔瓦德,9 Jean-Claude珍妮,4,5,6 Sylvain Chemtob公司,7 弗朗辛·比哈尔·科恩,4,5,6,9和弗洛里安·森劳布4,5,6
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补充材料

摘要

视网膜小胶质细胞（MC）在年龄相关性黄斑变性（AMD）中的作用尚不清楚。在这里，我们证明了所有视网膜MC都表达CX3C趋化因子受体1（CX3CR1），CX3CR1 M280等位基因的纯合子（与细胞迁移受损相关）增加了AMD的风险。在AMD患者中，MC在视网膜变性和脉络膜新生血管（CNV）部位的视网膜下间隙积聚。在CX3CR1缺乏的小鼠中，随着年龄和白化背景以及激光照射后视网膜变性之前，MC在视网膜下积聚。在黑暗中饲养白化小鼠可以避免这两种情况。在衰老小鼠的眼底检查中，脂质膨胀的视网膜下MC的出现呈核糖核酸酶样，并且CX3CR1依赖性MC的积累与实验性CNV的恶化有关。这些结果表明，视网膜下MC的CX3CR1依赖性积累引起AMD的主要特征。这些发现揭示了我们认为是一种新的致病过程，对AMD新疗法的开发具有重要意义。

介绍

老年性黄斑变性（AMD）是工业化国家老年人视力下降的主要原因(1). 其最显著的病理特征是累及视网膜色素上皮（RPE）和布鲁赫膜（BM）的病变，感光细胞变性(2)，在最具侵袭性的病例中，还有脉络膜新生血管（CNV）。早期AMD的特征是位于BM上的黄白色圆点，称为丘疹，部分被RPE覆盖，在眼底镜下临床可见(三). 由脂质和糖蛋白组成(4)据信，鼓膜是由细胞外物质沉积或变性RPE细胞形成的(5). 围绕其发病机制以及AMD的病因仍存在争议。

流行病学研究有助于确定AMD发病的关键因素。年龄(1)和家族史(三)是主要的诱发因素。AMD相关多态性基因包括载脂蛋白E(6)，超氧化物歧化酶(7)，补体因子H(8,9)和CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）(10).

在转基因小鼠模型中观察到人类AMD的一些特征。值得注意的是，通过脉络膜循环的CC趋化因子配体2-（CCL2-）和CC趋化素受体2-依赖（CCR2-依赖）途径的巨噬细胞募集不足可能会阻止BM中累积碎片的清除；这被认为是德鲁森形成的机制(11). 此外，CCL2和CCR2依赖性巨噬细胞的招募先前已被证明参与CNV的发展(12). 研究趋化因子受体CCR2和CX3CR1（CX3C趋化因子配体1的受体；CX3CL1）的表达确定了小鼠血液单核细胞的两个功能亚群：炎性单核细胞（表达这两种受体）和非炎性单细胞（仅表达CX3CR1）(13). 小胶质细胞（MC）表达CX3CR1，并在控制大脑中的小胶质细胞神经毒性中发挥作用(14). 我们假设CX3CR1在AMD感光层的MC上表达(15)并通过控制视网膜MC再分配参与AMD的发展和进展。因此，我们分析了人类AMD中CX3CR1的多态性和表达，并研究了2个独立产生的CX3CR1敲除小鼠菌株在衰老和激光诱导的CNV中的眼睛。我们发现CX3CR1的失效导致视网膜下MC（SrMC）的积聚，这与AMD的主要特征，即鼓膜样病变、视网膜变性和加重的新生血管有关。

结果

CX3CR1多态性与AMD。

为了评估趋化因子受体CX3CR1在AMD中的作用，我们研究了先前报道的2种CX3CR1变体（T280M和V249I）在AMD老年患者样本中的分布（与年龄相关的黄斑变性遗传学研究；GAMD；表​表11和补充表1；本文的在线补充材料；doi:10.1172/JCI31692DS1）。AMD患者或参考研究受试者中CX3CR1多态性的频率没有偏离Hardy-Weinberg平衡（数据未显示）。表​表11显示了CX3CR1 T280M基因型在DETR研究（P.Deterre，未发表的观察结果）和之前发表的Etude Cas-Témoin de l’Infractus du Myocarde（ECTIM；参考文献。16)弗雷明翰心脏研究（FHS；参考文献。17)和《Infractus Cérébral》（GENIC；参考文献。18)用作参考的研究。M280等位基因的纯合子在AMD研究中的频率始终高于其他疾病。因此，将携带更频繁等位基因的基因型作为参考组，计算与罕见等位基因纯合度相关的比值。M280纯合子与AMD风险增加相关，比值比在1.97至2.695之间（95%置信区间分别为1.069–3.652和1.268–5.728）。这种关联独立于年龄，疾病严重程度与多态性无关。AMD患者和参考研究受试者中CX3CR1 V249I等位基因的基因型分布相似（补充表1）表明，这种多态性对AMD风险没有显著影响。

表1

的分布CX3CR1系列GAMD和参考研究中的T280M

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CX3CR1在AMD中的表达。

为了了解CX3CR1改变可能导致AMD发展的机制，我们分析了健康献血者和AMD患者眼中CX3CR1的表达（图​（图1）。1). 在视网膜内侧的细胞中发现CX3CR1阳性（红色染色）。CX3CR1（绿色荧光）和血管内皮细胞标记物ulex（红色荧光）的双重标记显示了表达CX3CR1的细胞的分支形态及其与健康眼睛视网膜血管系统的密切程度（图​（图1A，1A、 插图）。健康供眼的感光细胞或RPE细胞中未检测到CX3CR1阳性。在年龄匹配的AMD患者的黄斑区，我们观察到局部RPE中断、聚集以及感光细胞变性（图​（图1B）。1B） ●●●●。在受影响的区域，CX3CR1阳性细胞在外视网膜和视网膜下间隙以及内视网膜血管周围的视网膜MC中被发现（图​（图1B）。1B） ●●●●。视网膜外侧的一些细胞非常大且肿胀（图​（图1B，1B、 插图）。

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AMD中CX3CR1的表达。

(一)CX3CR1（快速红色标记）在视网膜内侧表达（箭头所示）；在外核层（ONL）、光感受器OS或RPE中未发现CX3CR1阳性细胞。插图：双标记视网膜扁平支架的神经纤维层的共焦图像显示，健康眼睛中表达CX3CR1（绿色）的细胞的分支形态及其与视网膜血管系统（Ultex红色）的接近程度。(B类)在年龄匹配的AMD患者的黄斑病变区，在含有感光细胞的外核层及其下方发现了额外的CX3CR1阳性细胞（箭头）。插图：这些细胞较大且肿胀（绿色，CX3CR1；蓝色，DAPI）。(C类–E类)CX3CR1表达细胞(C类)也标记为MC标记物CD18阳性的分支细胞（红色，D类); 合并的图像如所示E类. (F类)Drusen含有无细胞CX3CR1沉积物（箭头所示）。(G公司)CX3CR1阳性细胞与CNV密切接触（箭头所示）。4只AMD患者和3只年龄匹配的对照眼的免疫组化结果具有代表性。INL，内核层；IPL，内丛状层。比例尺：50μm(一–G公司和一，插图）；20微米(B类，插图）。

所有CX3CR1阳性细胞（图​（图1C）1C） 与表达小胶质标记CD18的细胞精确重叠（图​（图1D），1D） 反之亦然（图​（图1E）。1E） ●●●●。此外，在核糖核酸酶中发现了CX3CR1沉积物，特别是在介于脉络膜血管之间的CD18阳性树突细胞中（图​（图1F）。1F） ●●●●。与CNV密切接触时也发现CX3CR1阳性细胞（图​（图1G）。1G） ●●●●。

M280多态性导致迁移缺陷。

我们之前表明，只有膜锚定形式的CX3CL1在功能上区分CX3CR1的2个等位基因亚型(19)：与只表达CX3CR1-VT变体的细胞相比，携带CX3CR1-IM等位基因的单核细胞粘附力更强。相反，它们对CX3CL1的趋化反应在这两个单核细胞群体中没有区别。为了深入了解表达不同CX3CR1变体的细胞对视网膜中存在的化学引诱剂的反应而迁移的能力，我们研究了单核细胞通过有和无CX3CL1涂层的多孔膜对CCL2的体外趋化性。来自CX3CR1-VT或CX3CR1-IM亚型纯合子个体的单核细胞同样迁移到CCL2（图​（图2A）。2A） ●●●●。无论是否存在滤过结合CX3CR1（图​（图2A），2A） ，趋化指数比（无CX3CL1指数/有CX3CL1的指数）为1.1±0.1。相反，当锚定CX3CL1存在时，与不存在时相比，纯合CX3CR1-IM变体个体的单核细胞以较少的数量迁移到下腔，以响应CCL2（图​（图2A）。2A） ●●●●。抑制率达到48%±11%（图​（图2B）。2B） ●●●●。这些数据与我们以前的工作一致(19)并表明，在结合CX3CL1的存在下，IM基因型个体单核细胞的趋化性受损。

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M280多态性导致CX3CR1功能障碍和迁移受损。

(一)代表性CCL2依赖性迁移，通过CX3CL1涂层过滤器从CX3CR1（VT和IM）的两种极端单倍型纯合个体中分离出单核细胞。流式细胞术用于计数迁移到下腔的CD14阳性细胞的数量。每个数据点是3次不同测定的平均值±SEM。(B类)CX3CR1-CCL2依赖性迁移受CX3CL1涂层过滤器影响的遗传变异。CX3CR1-IM变体纯合个体的单核细胞(n个=5）与纯合个体的单核细胞相比，CX3CL1-VT变体在CX3CL1涂层过滤器的存在下具有更少的CCL2依赖性趋化能力(n个= 8). 迁移能力表示为单核细胞通过带有或不带有CX3CL1涂层的过滤器迁移时，趋化指数（CI）与CCL2的比值（不带CX3CL1的趋化指数相对于带有CX3CL的趋化系数）***P（P）= 0.0006.

锶MC在CX3CR1中积累–/–随着年龄的增长，小鼠出现视网膜变性。

因为CX3CR1在人类MC上表达（图​（图1）1)因为CX3CR1多态性损害细胞迁移与AMD风险相关（表​（表11和参考。10)，我们使用缺乏CX3CR1基因的小鼠探讨了CX3CR1在视网膜稳态中的作用(20). 我们首先通过使用CX3CR1鉴定了CX3CR1的表达位点绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白（CX3CR1缺乏，GFP由CX3CR1启动子驱动）和CX3CR1+/GFP公司不同年龄的老鼠。在18个月大的CX3CR1中+/GFP公司和CX3CR1绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白小鼠，GFP阳性细胞邻接视网膜内皮细胞（红色荧光，BSA-1；图​图3，三、A和B）。视网膜扁平支架外丛状层的共焦图像显示CX3CR1中密度相似的分支MC的密集网络+/GFP公司和CX3CR1绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白动物（266±19和305±27 MCs/mm2;n个=每组4人；图​图3，三，C和D），表明所有MC均表达CX3CR1，视网膜MC的归巢独立于CX3CR1。报告基因在单个MC中的表达在CX3CR1中相似+/GFP公司和CX3CR1绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白老鼠。神经元、星形胶质细胞、Müller细胞和RPE中没有CX3CR1表达，这表明MC是视网膜中唯一的CX3CR1阳性细胞。

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锶MC在CX3CR1中积累–/–C57BL/6小鼠随着年龄增长而导致视网膜退化。

(一)18个月大的CX3CR1中的部分+/GFP公司小鼠显示GFP阳性细胞与单叶灰树–阳性（红色）视网膜内皮细胞。(B类)18个月大的CX3CR1中的部分绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白小鼠的视网膜内侧有相同的GFP阳性细胞分布，但视网膜下有更多的GFP阴性细胞与RPE细胞层并列（箭头所示）。(C类和D类)外丛状层的共聚焦图像显示，分支MCs的整个网络呈GFP阳性，在CX3CR1中密度相似+/GFP公司(C类)和CX3CR1绿色荧光粉/绿色荧光粉小鼠(D类). (E类和F类)老年小鼠的RPE平板显示，在CX3CR1中SrMC有较强的蓄积+/GFP公司(E类)和CX3CR1绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白小鼠(F类). (G公司)RPE平板上视网膜下GFP阳性细胞的定量显示，在CX3CR1中SrMC逐渐累积绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白小鼠，数量明显多于CX3CR1+/绿色荧光粉所有时间点的老鼠。(H（H）和我)甲苯胺蓝染色的环氧树脂视网膜半薄切片显示18个月龄CX3CR1的感光细胞变性–/–(我)小鼠与CX3CR1的比较+/+(H（H）)老鼠。(J型)光感受器细胞层厚度的测量显示CX3CR1中的光感受者细胞层显著变薄–/–小鼠与CX3CR1的比较+/+老鼠。每组对不同小鼠的4-8只眼睛进行实验*P（P）< 0.05. Ch，脉络膜。ROS，棒OS。比例尺：50μm。

在18个月大的CX3CR1的RPE平板上+/GFP公司鼠标（图​（图3E），三E） 如前所述，偶尔可见GFP阳性的SrMC(21)，而在CX3CR1中绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白小鼠，SrMC与RPE并列（图​（图3B，三B、 箭头）明显累积（图​（图3F）三F） 作为年龄的函数（图​（图3G）。三G） ●●●●。在CX3CR1中–/–没有GFP转基因的小鼠，CD11b-阳性的SrMC以类似CX3CR1的方式聚集绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白动物（数据未显示）。18个月龄CX3CR1的组织切片+/+（图​（图3H）三H） 和CX3CR1–/–（图​（图3I）三一） 在基因敲除小鼠中，小鼠的外视网膜出现实质性变性。在CX3CR1中，感光细胞层的测量显示明显变薄（40%）–/–鼠标（图​（图3J）。三J） ●●●●。

白化CX3CR1中SrMC积聚与视网膜变性相关–/–老鼠。

光线被认为是AMD发病的一个促成因素(22). 在野生型白化动物的常规光照条件下，SrMC随着环境光强度的变化而积累；这种增生被光限制所抑制(21). 因此，我们发现1个月大的CX3CR1+/+在正常光照条件下饲养的白化小鼠（12小时光照/12小时暗周期）在RPE（指骨样蛋白红色荧光）附近显示出一些CD11b-阳性SrMC（绿色荧光）；图​图4A），4A） ，但这些在年龄匹配的CX3CR1中明显更丰富–/–鼠标（图​（图4B）。4B） ●●●●。野生型和敲除型小鼠的SrMC数量随着年龄的增加而增加，但后者的积累更为显著（图​（图4C）。4C） ●●●●。此外，CX3CR1–/–在整个实验过程中，BALB/c小鼠在完全黑暗的环境中2个月时积累的SrMC明显少于CX3CR1小鼠–/–在环境光照下饲养的小鼠（图​（图4C）。4C） ●●●●。

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SrMC积聚诱导白化CX3CR1视网膜变性–/–老鼠。

(一和B类)白化CX3CR1的RPE平板+/+BALB/c公司(一)和CX3CR1–/–BALB/c小鼠(B类)在CX3CR1缺乏的动物中，显示更多CD11b-阳性（绿色）SrMC与RPE（磷脂，红色）邻接。(C类)RPE平板上视网膜下CD11b阳性细胞的定量显示CX3CR1中MC的密度显著升高–/–1个月龄和2个月龄的小鼠在环境光照条件下饲养。CX3CR1系列–/–在完全黑暗中饲养的BALB/c小鼠的SrMC明显少于环境光照饲养的小鼠–饲养的CX3CR1–/–BALB/c小鼠。(D类–F类)甲苯胺蓝染色的环氧树脂视网膜半薄切片显示白化CX3CR1的所有感光细胞完全变性–/–BALB/c小鼠(E类)与CX3CR1相比，4个月龄时+/+BALB/c小鼠(D类). CX3CR1阻止了这种退化–/–BALB/c小鼠在黑暗中饲养(F类). (G公司)白化CX3CR1感光细胞层厚度的测量显示出明显的进行性变性–/–BALB/c小鼠，通过升高CX3CR1而完全逆转–/–BALB/c老鼠在黑暗中。实验在每组不同小鼠的8-10只眼睛上进行*P（P）< 0.05. 比例尺：50μm。

4个月大的CX3CR1的组织切片+/+（图​（图4D）4D） 和CX3CR1–/–（图​（图4E）4E） 后者小鼠外视网膜明显变性；在深色饲养的敲除小鼠中没有观察到这种变性（图​（图4F）。4F） ●●●●。对敲除小鼠的感光细胞层厚度进行量化显示，2个月时感光细胞厚度轻微（20%）但显著变薄，4个月时完全退化，这两种情况都可以通过限制光线来阻止（图​（图4G）。4G） ●●●●。

在CX3CR1敲除小鼠中观察到的Drusen是脂质膨胀的SrMC。

视网膜下沉积是AMD的特征。衰老CX3CR1的眼底检查+/+（图​（图5A）5A） 和CX3CR1–/–（图​（图5B）5B） 小鼠表明，所有CX3CR1–/–小鼠视网膜深层有许多类似于核糖的黄色结节状沉积物，这些沉积物在年龄匹配的CX3CR1中不存在+/+或2个月大的CX3CR1–/–小鼠（数据未显示）。在第二株CX3CR1基因敲除小鼠CX3CR1中观察到类似的特征绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白(23). 为了更详细地描述CX3CR1在眼底镜下产生这种类似于核果的外观的解剖结构–/–在小鼠中，我们在移除神经视网膜后将眼睛平放，从而暴露RPE单层。CX3CR1的RPE单层+/+在切向白光下观察到的动物看起来规则而光滑（图​（图5C）。5C） ●●●●。相反，在基因敲除小鼠中，单分子膜的检查显示它与多个升高的白点邻接（图​（图5D）。5D） ●●●●。更高的放大倍数显示了这种白色物质的细胞内位置：与RPE细胞单层相邻的肿胀细胞。这些细胞内黄白色沉积物仅存在于GFP阳性细胞中（图​（图5，5，E–G）。这些GFP阳性分支细胞的进一步共焦显微镜（图​（图5H）5H） 使用特定MC标记5D4(22)（图​（图5I）5一） 和CD11b或F4/80（数据未显示），以将这些细胞识别为激活的SrMC。并非所有的SrMC都肿胀，但只有肿胀的细胞在RPE平板支架上看起来像核糖一样。

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CX3CR1基因敲除动物中观察到的Drusen是肿胀的SrMC。

(一–D类)1岁CX3CR1的RPE平板在切线光下的眼底照片和显微照片的比较+/+(一和C类)和CX3CR1–/–小鼠(B类和D类)发现CX3CR1中有多个鼓膜–/–老鼠。(E类–G公司)CX3CR1中核糖核酸酶（箭头）的放大倍数更高的图像绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白切线光下的鼠标(E类)与GFP阳性（绿色；红色，磷灰石；蓝色，DAPI）视网膜下分支细胞叠加(F类)在RPE平板支架上。切线光源和DAPI的合并如所示G公司. (H（H）和我)GFP阳性视网膜下分支细胞(H（H）)在CX3CR1上绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白MC标记物5D4（红色，我). (J型和K（K）)12个月大的CX3CR1组蛋白包埋的组织切片+/+(J型)和CX3CR1–/–(K（K）)在CX3CR1中，眼显示视网膜下细胞与视网膜色素上皮细胞邻接–/–(K（K），箭头），但不适用于CX3CR1+/+老鼠。(L（左）)CX3CR1中RPE/OS界面的电子显微镜–/–小鼠发现视网膜下细胞（星号）与多个吞噬体并列于RPE细胞层。(M（M）)这些视网膜下细胞的高倍放大显示出多处脂质沉积和吞噬体内典型的杆状OSs残留（箭头所示）。(N个)CX3CR1的RPE平板共焦显微照片中，视网膜下CD11b阳性（绿色）树突状细胞含有视紫红质阳性内含物（红色）–/–老鼠。结果代表了至少3个独立实验。比例尺：500μm(一–D类)，50微米(E类–G公司)，20微米(H（H）–K（K）和N个)，1微米(L（左）和M（M）).

在CX3CR1中证实了5D4-、CD11b-和F4/80阳性SrMC中存在黄白色沉积物–/–眼睛（数据未显示）。12个月龄CX3CR1的组织切片+/+（图​（图3J）三J） 和CX3CR1–/–（图​（图5K）5K） 在CX3CR1中，小鼠的视网膜下细胞粘附在RPE的色素单层上–/–但不是CX3CR1+/+老鼠。衰老CX3CR1的超微结构分析–/–眼睛的透射电子显微镜证实在外节（OS）和RPE细胞之间存在视网膜下细胞（图​（图5L），5五十） 含有胞内脂质沉积和OS残留（图​（图5M），5M） 通常在RPE细胞中观察到(24). CX3CR1的CD11b阳性SrMC中的视紫红质免疫反应–/–RPE平板支架（图​（图5N）5N） 与SrMC摄入OS一致。

在CX3CR1基因敲除小鼠中，SrMC积聚与CNV和视网膜变性相关。

激光凝固小鼠脉络膜诱发由血源性巨噬细胞和活化的MC组成的局部炎症反应(25). 在检测衰老和环境光暴露的CX3CR1缺乏小鼠中SrMC的积累后，我们研究了CX3CR1缺陷对激光损伤的影响。激光损伤后14天，CX3CR1+/GFP公司小鼠在脉络膜瘢痕附近显示出一些GFP阳性的SrMC（图​（图6A），6A） ，但CX3CR1中积累了更多这样的细胞绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白鼠标（图​（图6B）6B） 在这个阶段。激光冲击后细胞计数（图​（图6C）6C） 显示CX3CR1的瞬时增加+/GFP公司小鼠，第7天达到峰值；同样，CX3CR1的增加绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白小鼠体重明显升高，并继续上升。CX3CR1第7天的免疫组织化学+/+小鼠（图​（图6，6，D–F）显示促血管生成因子VEGF（图​（图6D）6D） 由表达F4/80（图​（图6，6、E和F）。

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SrMC在激光损伤后积聚，加剧新生血管，并导致邻近视网膜变性。

(一和B类)3个月大时，CX3CR1+/GFP公司小鼠在CNV附近显示一些GFP阳性（绿色）SrMC（红色、，单叶灰树)激光损伤后14天(一)和CX3CR1绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白小鼠表现出强烈的SrMC蓄积(B类). (C类)CX3CR1系列+/GFP公司小鼠在激光照射后表现出SrMC的短暂增加，在第7天达到峰值；然而，CX3CR1中的SrMC绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白当时，小鼠数量显著增加，并继续累积。(D类–F类)第7天免疫组织化学显示F4/80阳性激活的CX3CR1中VEGF表达（绿色）+/+视网膜下间隙的MCs（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。(G公司和H（H）)荧光素-右旋糖酐（绿色）灌注RPE/脉络膜扁平支架的显微照片，内皮细胞标记物双重标记单叶灰树（红色）激光冲击CX3CR1后14天+/+(G公司)和CX3CR1–/–(H（H）)小鼠表现出典型的CNV。(我)定量显示敲除菌株中的新生血管加剧。(J型)CX3CR1的眼睛+/+激光治疗21天后，12个月大的小鼠在撞击附近出现200μm的正常感光细胞层。(K（K）)在此阶段CX3CR1–/–小鼠表现出SrMC和变薄且不规则的感光细胞层。(L（左）)CX3CR1患者的激光依赖性视网膜变性（按方法中所述计算）明显更为明显–/–小鼠仅在100和200μm。实验在每组不同小鼠的8-10只眼睛上进行*P（P）< 0.05. 比例尺：50μm(一,B类,G公司,H（H）,J型、和K（K）)，10微米(D类–F类).

激光损伤后14天，CX3CR1中的CNV显著减少+/+鼠标（图​（图6G）6G） 比他们的CX3CR1–/–副本（图​（图6H）。6H） ●●●●。内皮细胞覆盖表面的定量显示CX3CR1中新生血管的数量是其两倍–/–和CX3CR1绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白敲除菌株（图​（图6I）6一） 而不是他们的控制。

最后，由于AMD患者视网膜下新生血管继发视网膜变性恶化，我们测试了视网膜下新生动脉附近MC募集增加是否与视网膜变性加重相关。在12个月大的动物中，CX3CR1的外核层厚度减少了30%–/–与CX3CR1相比+/+对小鼠进行激光治疗后21天的感光细胞层分析。在CX3CR1中+/+小鼠，靠近激光诱导视网膜破坏的感光细胞层厚度（200μm）与非嵌顿视网膜的感光层厚度没有显著差异（图​（图6J）。6J） ●●●●。相反，在这些条件下，CX3CR1中的感光层已基本变薄–/–鼠标（图​（图6K）。6K） ●●●●。这种差异可能是年龄和激光诱导的退化综合作用的结果。为了评估激光诱导的改变，比较了在距离激光冲击不同距离（100–1000μm）处受伤和未受伤视网膜的相对视网膜厚度。激光依赖性视网膜变性在CX3CR1中明显更为明显–/–小鼠比CX3CR1中的小鼠+/+小鼠距离为100和200μm，而不是300和400μm（图​（图6L）。6五十） ●●●●。

讨论

在这里，我们显示视网膜MC全部且始终表达CX3CR1，这些细胞在AMD视网膜下积聚，CX3CR1的T280M多态性与细胞迁移受损和AMD相关。随着年龄增长、激光损伤后或白化背景，CX3CR1缺乏小鼠的视网膜下积聚MC。这种积累导致光感受器退化，并加剧新生血管。此外，MC与高脂OS的长期接触与MC内的细胞内脂质积聚有关。令人惊讶的是，这些视网膜下小胶质泡沫细胞原来是小鼠体内类似于核糖的沉积物的来源。我们的结果表明，MC在视网膜下间隙的积聚可能是AMD发病的驱动力，而不是继发性发病。

我们对AMD患者的研究表明，M280等位基因纯合子在AMD患者组中的频率始终高于其他人群的研究，并证实了先前的报告(10)CX3CR1 M280等位基因与AMD风险之间的显性关联。对照研究中的受试者没有进行AMD检查，一些人肯定已经或将要患AMD。然而，这种偏见的影响应该是低估了CX3CR1多态性对AMD风险的影响。这些数据表明，趋化因子受体CX3CR1可能在AMD发病机制中发挥重要作用。

为了了解CX3CR1多态性如何导致AMD发病，必须确定视网膜中表达CX3CR1的细胞类型。我们在人类中的免疫组织化学分析显示，CX3CR1在所有视网膜MCs上都有表达，这些MCs通过其形态学和CD18表达来鉴定。此外，使用CX3CR1的实验+/GFP公司小鼠和小鼠MC标记物CD11b、F4/80和5D4证实，只有MC表达CX3CR1。在两个不同物种中使用这两种技术，我们发现在神经元、星形胶质细胞或胶质细胞中没有CX3CR1的表达：正如之前的报告所显示的中枢神经系统(14)，MC是视网膜中唯一表达CX3CR1的细胞。与之前的报告相反(10)，当我们使用快速红色系统显示的CX3CR1特异性抗体来规避自身荧光干扰，并用报告基因进行实验时，我们未能在RPE细胞中发现明显的CX3CRI表达。在AMD中，CX3CR1阳性MC在黄斑病变区视网膜下积聚。我们的数据与先前在AMD中描述的活化MC对视网膜下间隙的浸润一致(15)并表明以产生特定细胞因子和趋化因子为特征的特定炎症环境可能决定特定的病理状态。

中枢神经系统和视网膜细胞大量表达CX3CL1(26,27). 另一方面，氧化应激下的RPE细胞表达其他单核细胞趋化因子，如CCL2(28)可能负责视网膜下间隙MC的招募。为了评估M280多态性对富含CX3CL1环境中细胞迁移的影响，我们测试了M280 CX3CR1单核细胞通过CX3CL1涂层多孔膜迁移以响应CCL2。先前的研究表明M280多态性会导致趋化性丧失(17)或增加对其配体的粘附(19). 这里，结合CX3CL1的存在显著抑制了表达CX3CR1 M280变体的单核细胞的CCL2依赖性趋化性（图​（图2）。2). 如果视网膜MC在体内发生类似的改变，M280多态性可能会导致MC过度粘附于膜锚定的CX3CL1，并减少对其他炎症化学吸引剂的迁移。多年来，在M280多态性的受试者中，MC从视网膜下间隙的清除（对可溶性CX3CL1或其他化学引诱剂的反应）将受到抑制，SrMC可能会积聚。

为了在动物模型中模拟CX3CR1功能障碍，我们使用了2种独立产生的CX3CR1敲除小鼠菌株。我们的数据表明，在激光损伤、衰老和白化动物这三种实验条件下，CX3CR1缺陷小鼠体内的SrMC积累强烈且持久。相反，受激光损伤的对照组小鼠仅短暂积聚F4/80-和GFP-阳性分枝细胞，而衰老和白化对照组小鼠缓慢或稳定积聚SrMC。我们和其他人之前已经证明，CX3CR1缺陷会减少动脉粥样硬化病变中巨噬细胞的聚集(20,29)可能是通过限制血液中单核细胞的补充。鉴于CX3CR1在单核细胞募集中的作用，在CX3CR1缺乏小鼠中观察到的MC数量过多不太可能是单核细胞过度涌入的结果。

与动脉粥样硬化病变中的单核细胞不同，MC可以原位增殖(30). 其积聚可能是过度增殖或抑制其从视网膜下间隙清除的结果。然而，CX3CL1已被证明促进小胶质细胞增殖(31)，并且在CX3CR1缺乏症中不太可能发生过度增殖。另一方面，CX3CR1的废除可能会影响SrMC通过凋亡或迁移（退出）清除。我们实验室目前正在调查这个问题。

有趣的是，CCL2和CCR2信号似乎与视网膜MC分布无关。尽管CCL2–/–（和CCR2–/–)此前有研究表明，小鼠出现了继发于巨噬细胞补充不足的AMD症状(11)，它们没有显著的SrMC积累（1.7±0.2 SrMCs/mm2)在本研究中，12个月大时。巨噬细胞依赖性碎片清除(11)可能只在疾病的晚期发挥作用。

在CX3CR1缺乏的小鼠中，MCs在视网膜下间隙的持续存在与SrMCs过度吞噬OS有关，后者随后积聚细胞内脂质。这些视网膜下小胶质泡沫细胞是小鼠体内类似于核糖的沉积物的来源。同样，在人类中，我们在AMD患者的眼睛中发现CX3CR1阳性的肿胀SrMC（图​（图1B），1B） ，和其他人之前已经表明，被激活的MC清除光感受器碎片会导致SrMC肿胀(15). 很容易推测，SrMC在一定程度上促成了AMD中的鼓泡形成，并且鼓泡的圆形轮廓和陡峭的斜坡是其特征(5)可能部分源于随后被RPE细胞覆盖的变性肿胀MC。支持这一理论的事实是，鼓膜含有许多退化的细胞器，其起源可能是视网膜MC(32). 此外，在德鲁森发现了CX3CR1矿床（图​（图1F）。1F） ●●●●。以前曾报道过类似的杜鲁森沉积物含有载脂蛋白E、补体因子、MHC和淀粉样低聚物等(5,33–36). 激活后，MC可以表达ApoE(37)，补充因子(38)、MHC(39)β淀粉样前体蛋白(40)以及CX3CR1。MC可通过呼吸爆发成为氧化应激的主要来源(41)这可能导致与酒石症相关的氧化蛋白和脂质的改变。因此，在玻璃疣中发现的炎症蛋白可能至少部分来自视网膜MC。

视网膜下间隙长时间存在MC的另一个后果可能是感光细胞死亡。在CX3CR1中–/–在衰老小鼠、白化小鼠和视网膜下新生血管附近观察到视网膜变性。CX3CR1的视网膜变性–/–小鼠总是在SrMC积累之前，可以通过限制MC在视网膜下间隙的积累来避免，如CX3CR1所示–/–在黑暗中饲养的白化小鼠（图​（图4）。4). 早在6个月大的着色小鼠和1个月的白化CX3CR1缺乏小鼠中，在任何显著的视网膜变性之前，就观察到SrMC的积累（数据未显示）。在BALB/c小鼠中，没有已知的自然发生的突变导致视网膜变性，并且从2个月开始的变性过程与任何已知的感光细胞或RPE基因缺陷引起的视网膜变性不匹配。我们进一步注意到，无论是感光细胞还是RPE细胞都不含表达CX3CR1。激活的MC参与体内神经节细胞死亡(42)在体外可诱导感光细胞死亡(43). MC（CX3CR1）长期存在引起的神经细胞毒性绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白)在大脑中，以前被描述为神经退行性疾病的一种机制(14)，类似的机制可能会导致CX3CR1中观察到的退化–/–衰老CX3CR1中的BALB/c小鼠–/–C57BL/6小鼠，在激光损伤后视网膜下新生血管附近。概括地说，在没有任何原发性光感受器或RPE疾病的情况下，CX3CR1缺陷小鼠中的SrMC积累与光感受器变性有关。据我们所知，以前还没有描述过视网膜退化的这种机制。

此外，我们发现激光损伤部位附近激活的SrMC表达VEGF。在CX3CR1缺乏小鼠中，SrMC的积累增加和随后VEGF的分泌可能是过度新生血管形成的原因。这与我们之前的研究一致，该研究表明MC可以在视网膜中产生促血管生成特性(44). 此外，在人CNV中发现CX3CR1阳性MC，这表明SrMC可能是AMD CNV的病因或加重因素。

总之，我们的结果表明，MC在视网膜下间隙的积聚可能是AMD发病的驱动力，而不仅仅是原发性RPE或光感受器疾病的结果。我们的研究挑战了长期以来关于视网膜色素上皮和脉络膜细胞外碎片逐渐积累导致血栓形成的范式。我们认为，由CX3CR1相关的迁移性缺陷引起的SrMC积聚在AMD的主要特征——水肿形成、CNV和视网膜变性中起着关键作用。

方法

研究参与者和AMD评估。

GAMD研究包括2006年中期“血管造影与激光中心”招募的285名参与者（29%为男性）。所有参与者均由2名独立眼科医生诊断出AMD。DETR研究包括2003年至2005年间在Pitié-Salpétrière医院血库招募的520名献血者（56%为男性）（P.Deterre，未发表的观察结果）。根据《赫尔辛基宣言》，患者和志愿者为GAMD和DETR研究提供了书面知情同意书，这些研究得到了Pitié-Salpétrière和Hotel-Dieu（法国巴黎）伦理委员会（编号0611303）的批准。按照制造商的标准方案，使用DNeasy试剂盒（Qiagen）从EDTA抗凝静脉血中提取基因组DNA。以前发表的研究被用作参考：ECTIM研究(16)，FHS的后代队列(17)和GENIC研究(18). ECTIM研究是一项病例对照研究，旨在确定与心肌梗死相关的遗传变异。该研究针对4个CHD登记机构（WHO/MONICA）覆盖的人群：3个在法国里尔、斯特拉斯堡和图卢兹地区，1个在北爱尔兰贝尔法斯特地区。GENIC是一项针对脑血管中风的病例对照研究，与法国专业临床科室网络合作进行。FHS的后代队列始于1971年，招募了5124名儿童和最初参与者的女婿。他们每4年进行一次全面体检（定义为一个周期）。FHS后代队列包含1888名可获得DNA的无关参与者。其中，1861人同意进行基因分型，并参与了本研究。

多态性筛查。

如其他地方所述，使用Perkin­Elmer（Applied Biosystems）的基于Minor Groove Binder PCR-的扩增技术鉴定CX3CR1多态性(45).

人眼切片。

来自魁北克眼库的4名AMD患者（3名干型和1名湿型）和3名年龄匹配的对照捐赠者的眼睛。将黄斑切开，用4%多聚甲醛（PFA）固定在PBS中，冷冻，切片（10μm）。患者和志愿者根据魁北克的道德规范给予知情同意。

趋化迁移分析。

用Ficoll分离液（Eurobio）一步离心法从健康志愿者的肝素化静脉血中分离出PBMC，用PBS洗涤两次，然后在5×106无血清DMEM（Invitrogen）中含有5 mg/ml牛血清白蛋白的细胞/ml。通过transwell过滤器（康宁公司）在24孔趋化室中测定趋化性。在室温下用抗组氨酸抗体（5μg/ml）处理过滤器（孔径为8-μm）2小时，用PBS清洗，并在4°C下用CX3CL1-H istidine（0.1μg/ml）或PBS涂敷过夜。用PBS冲洗过滤器后，将100μl细胞悬浮液装入过滤器。CCL2（100 nM）或PBS放置在下室中。然后将平板在37°C、100%湿度和5%CO下孵育3小时2然后，通过基于CD14表达（BD Biosciences）的流式细胞术（FACSCalibur；BD）对通过过滤器底部表面迁移的单核细胞进行计数。测定了三份样品中单核细胞的平均数量，并计算了通过带有或不带有CX3CL1涂层的过滤器迁移的单核细胞趋化指数（或下室中带有和不带有CCL2的细胞的比率）。

动物。

CX3CR1系列–/–和CX3CR1绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白C57BL/6背景的小鼠菌株及其对照品的产生如前所述(20,23). CX3CR1系列–/–将C57BL/6小鼠回交6代至BALB/c背景（Janvier），获得CX3CR1–/–BALB/c菌株，在特定的无病原体条件下保存，食物和水可随意提供，并在12小时光照/12小时黑暗（100–500勒克斯）循环或完全黑暗（CX3CR1–/–BALB/c）。动物实验得到了当地机构动物护理和使用委员会的批准：Pitié-Salpétrière的探索Fonctionelle中心。

眼底摄影和激光凝固。

通过肌肉注射氯胺酮（50 mg/kg）和木聚嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。用1%托吡卡胺或1%阿托品使瞳孔完全扩张。放置在小鼠角膜上的盖玻片被用作接触镜。眼底照片是用安装在眼科手术显微镜（蔡司）上的数码相机拍摄的。使用氩激光（532 nm）在离乳头1-2个椎间盘直径的位置进行激光凝固，氩激光安装在裂隙灯上（400 mW、50 ms和50μm）。

免疫组织化学。

根据先前描述的标准免疫组织化学程序对冷冻切片进行染色(44). 所用的主要抗体为兔多克隆抗人CX3CR1（Chemicon）、小鼠抗人CD18（BD Biosciences-Pharmingen）、大鼠单克隆抗CD11b（Serotec）、鼠抗F4/80（BD Biosciences-Pharminggen）、小鼠抗大鼠硫酸角质蛋白多糖（5D4，Seikagaku）、小鼠抗体GFP（Torrey Pines Biolabs）、VEGF（Chemicond）、，和山羊抗鼠CX3CL1（研发）。使用的凝集素为TRITC结合凝集素欧洲乌拉或单叶灰树（Sigma-Aldrich）和罗丹明-黄原素（Invitrogen）。使用相应的Alexa或碱性磷酸酶偶联的二级抗体（Invitrogen）来揭示一级抗体，并用DAPI或血红素对切片进行复染。碱性磷酸酶显示为固红（Sigma-Aldrich）。用荧光显微镜（BX51；Olympus）或共焦显微镜（LSM 510激光扫描显微镜；Zeiss）观察切片和平板。所有免疫染色至少重复3次，省略一级抗体的染色作为阴性对照。

脉络膜扁平支架和SrMC/CNV量化。

眼球摘除，室温下用4%PFA固定15分钟，在角膜缘切片；角膜和晶状体被丢弃（对于CNV，向小鼠灌注荧光素右旋糖酐106摘除前）。小心地将视网膜从视网膜色素上皮/脉络膜/巩膜上剥离。将视网膜和脉络膜在-20°C的甲醇中再固定15分钟，并与指定的初级和次级抗体及凝集素孵育。对脉络膜和视网膜进行放射状切割、平板安装，并用荧光显微镜观察（BX51；奥林巴斯）。对于RPE平装照片，通过将KL2500LCD肖特灯的导光玻璃纤维直接放置在物镜旁边的盖玻片上，施加切向白光。SrMC在GFP或F4/80染色的整个RPE/脉络膜平板上计数，直至睫状体和视网膜OS侧。测量RPE表面并计算SrMC密度。使用Image J分析软件在照片上测量CNV。通过激光冲击中心的组织树脂包埋切片（见下文）评估视网膜变性。

组织学和电子显微镜。

对于组织学，将眼睛固定在0.5%戊二醛、4%PFA PBS中2小时，脱水，并固定在组织树脂中。切片（5μm）切割并用曙红染色。对于电子显微镜和半薄切片，将眼睛固定在2.5%戊二醛的二羧酸缓冲液（0.1M，pH 7.4）中。1小时后，将眼球解剖，固定3小时，后固定在1%四氧化锇缓冲液中，并在分级乙醇溶液中脱水。样品包含在环氧树脂中并定向。用超薄切片机Reichert Ultracut E（Leica）切片半薄切片（1μm），甲苯胺蓝染色，并用光学显微镜检测感光层厚度。对受伤和未受伤视网膜的感光细胞层进行多次测量，以计算距离激光撞击位置100–1000μm处的相对视网膜厚度。超薄切片（80 nm）与醋酸铀酰和柠檬酸铅进行染色对比，并在80 kV的JEOL 100 CX II电子显微镜（JEOL）上进行观察。环氧树脂包埋半薄切片和组织树脂包埋切片的外核层厚度的绝对值不可比，因为前者收缩更强。

统计。

通过基因计数计算等位基因频率。哈代-温伯格平衡用χ检验21自由度测试。我们使用了χ2测试比较参与者的基因型分布和等位基因频率。使用未配对2样本进行统计比较t吨均值试验和Mann-Whitney U试验。使用Prism软件（4.0c版；GraphPad软件）进行所有分析和图形表示，并将数值报告为平均值±SEM。AP（P）小于0.05的值被认为是显著的。

补充材料

补充数据：
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致谢

作者谨感谢阿诺德·坎吉亚洛西（Arnaud Cangialosi）、克里斯托夫·克莱因（Christophe Klein）和圣佩尼·吉拉德（Stéphanie Girard）提供的技术援助以及米里亚姆·戈特（位于皮蒂-萨尔佩特里雷的探索基金会中心动物设施）。我们感谢D.Littman和S.Jung分享CX3CR1Kin GFP小鼠和R.S.Molday的抗红细胞蛋白酶抗体。这项工作得到了INSERM的资助，ANR的资助“心血管病、肥胖和糖尿病”（AO5088DS），ANR资助“blanc”（AO5120DD），欧洲资助“Innochem”518167，PNR愿景（AO6004SP），以及法国国家研究院基金会（FONDATION NRJ Institute de France）的支持。C.Combadière获得了巴黎Hopitaux Publiques援助组织的“接口”合同，M.Rodéro得到了法国Canceropole岛学生的支持。

脚注

使用的非标准缩写：AMD，年龄相关性黄斑变性；BM，布鲁赫膜；CCL2，CC趋化因子配体2；CCR2、CC趋化因子受体2；脉络膜新生血管；CX3CL1、CX3C趋化因子配体1；CX3CR1、CX3C趋化因子受体1；MC，小胶质细胞；OS，外段；视网膜色素上皮；SrMC，视网膜下MC。

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

本文引文： 临床杂志。投资。 117:2920–2928 (2007). doi:10.1172/JCI31692

克里斯托夫·康巴迪埃（Christophe Combadieère）、查尔斯·费米（Charles Feumi）和威廉·拉乌尔（William Raoul）对这项工作做出了同样的贡献。

参见第页开头的相关评论2758.

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会