AAV介导的基因转移到肝脏的非人类灵长类动物模型中转基因产物耐受性的调节

摘要

介绍

腺相关病毒（AAV）介导的肝导向基因转移已成功用于治疗人类疾病动物模型中的各种遗传疾病。^1–9然而，尽管在实验动物中有长期疗效数据，但在唯一一项AAV介导的肝定向基因转移的人类研究中，捐献的F.IX基因在血友病男性中的表达是短期的，¹⁰持续约4周，然后在随后的6周内逐渐下降。F.IX表达缺失伴随着短暂的无症状转氨酶升高，也在载体输注4周后开始。对随后注射AAV的受试者的研究表明，载体注射后，AAV衣壳特异性CD8的群体先扩张后收缩⁺T细胞。^10,11这导致了这样一种假设，即人类是AAV-2的唯一自然宿主，拥有衣壳特异性记忆CD8⁺T细胞，在儿童感染野生型病毒期间形成，当受试者通过载体输注再次接触AAV衣壳时，这些细胞会重新激活。内存衣壳特定的CD8⁺T细胞膨胀并最终溶解转导的肝细胞，¹¹导致肝脏酶的短暂增加和F.IX表达的丧失。¹⁰

虽然已经提出了几种可能的解决方案，包括设计衣壳蛋白以逃避免疫识别，或使用替代的AAV血清型以实现相同的目标，¹²人类MHC基因座的高度多态性，以及不同血清型衣壳之间相当程度的序列保守性，可能会严重阻碍这些方法。在基因转移时给予短暂免疫抑制（IS），并维持到衣壳抗原从靶细胞中清除，这可能是阻断免疫反应并在AAV介导的基因转移到肝脏后获得长期疗效的可行方法。成人血友病患者使用IS方案的一个重要要求是证明丙型肝炎病毒阳性（HCV）的安全性⁺)个人。在这方面，以霉酚酸酯（MMF）和西罗莫司为基础的方案已广泛应用于肾移植，^13,14其中大量移植受者是HCV⁺由于输血依赖性早于HCV血供的有效筛查。这些方案具有良好的长期安全性。最近，在这些方案中添加抗IL-2受体抗体（如达利珠单抗），进一步提高了器官移植的疗效。¹⁵

然而，IS的使用带来了额外的担忧，因为一些实验室已经表明，肝基因转移通过诱导抗原特异性CD4介导对转基因产品产生免疫耐受⁺CD25型⁺福克斯P3⁺调节性T细胞。^16–18由于耐受性是避免对转基因产品产生体液反应的关键，而且对其诱导的时机知之甚少，因此肝定向基因转移中使用的is方案必须设计为避免对调节性T细胞诱导的任何干扰。这与血友病特别相关，在血友病中，对转基因产品产生中和抗体（临床上称为抑制剂）的风险是一个严重的问题。¹⁹在这方面，含有西罗莫司的方案很有意思，因为该药物已被证明可以促进调节性T细胞的诱导。^20–22

在这项研究中，我们使用非人类灵长类动物（NHP）模型来评估IS方案在AAV介导的肝定向基因转移中的安全性。具体而言，我们试图确定IS药物的联合使用是否改变了AAV的转导效率或生物分布，或对转基因产物的免疫反应。结果表明，IS方案的选择会显著影响肝定向基因转移的结果。这些发现为AAV-F.IX结合瞬时免疫调节的拟议试验提供了关键的临床前安全性数据。此外，他们还将先前在小鼠模型中观察到的结果扩展到了一个长辈大动物模型^16–18CD4的可能作用⁺CD25细胞⁺AAV介导的基因传递到肝脏后诱导转基因耐受的调节性T细胞。

材料和方法

结果

由MMF、西罗莫司和抗IL-2受体单克隆抗体组成的方案可产生针对F.IX的抑制性抗体

为了检测短暂免疫刺激对AAV-2介导的肝脏转导的影响，选择6只雄性恒河猴进行低抗AAV-2中和抗体的检测，并注射8×10的剂量¹²在肝脏特异性启动子控制下表达hF.IX的AAV-2载体基因组（vg）/kg。¹⁰载体给药是通过直接注射到肝动脉进行的，并且没有任何问题。将动物随机分为2组：第1组（n=3）仅接受载体，第2组（n/3）接受人体器官移植常用的抗T细胞方案10周，^13,14由MMF、西罗莫司和达利珠单抗组成。口服MMF和西罗莫司；在方案诱导期的第-1天和第15天静脉注射抗IL-2受体抗体（达克利珠单抗）¹⁵（请参见表1用于免疫抑制剂药物的给药和时间表）。

在IS停药时（基因转移后第10周），第2组（3种药物的IS方案）的3只动物中有2只的hF.IX-循环水平分别为100和150 ng/mL(图1A） ；同一组的第三只动物（2002年，图1A） hF.IX水平从第4周开始下降，到第8周恢复到基线水平（未检测到的水平）。这只动物的肝酶没有任何升高（数据未显示），到第10周，它产生了一种滴度为4.8BU的F.IX抑制剂（这表明hF.IX水平的早期下降反映了我们的检测中未检测到的低滴度抑制剂）。基因转移后对动物进行了几周的随访，到第27周，所有采用3药物IS方案（n=3）的动物都产生了针对人类F.IX转基因产品的高滴度抑制性抗体(图1B类；表2). 所有只接受AAV-2载体的动物（第1组，n=3）hF.IX表达的平台水平在200至479 ng/mL之间（正常值的4%至～10%，在治疗范围内，表2)没有发现hF.IX抑制剂。所有动物都没有改变肝功能测试。在研究之前和整个研究期间（第2、3、8、11和13周）收集的PBMC通过IFN-γ和IL-10 ELISpot检测对AAV-2衣壳或人类F.IX的反应。在非免疫抑制动物的两种抗原中均未检测到T细胞反应（数据未显示），或在开发了针对F.IX转基因的中和抗体的动物中（3-drug IS方案）。第8周和尸检（40周）时的肝活检没有显示淋巴细胞浸润的证据（数据未显示）。这些发现证实，在3药物IS组中，循环中人类F.IX的丢失是由于转基因特异性抗体反应，而不是由于针对AAV-2衣壳或hF.IX转基因的细胞毒性T细胞反应。此外，凝血参数无异常（aPTT、PT，数据未显示）证实，所观察到的抑制性抗体是针对人类F.IX转基因产品的，并且与内源性恒河猴F.IX无交叉反应。

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图1

接受MMF、西罗莫司和达利珠单抗治疗的恒河猴和非免疫抑制的对照恒河猴在AAV2-hF.IX肝基因转移后hF.IX表达水平和抗-hF.IX抗体的形成.时间0表示基线样本；垂直虚线表示IS被撤回的时间。每条线代表一只动物。所有动物接受8×10¹²经肝动脉输注的AAV-2-hF.IX载体的vg/kg。实体符号表示动物接受由MMF、西罗莫司和达利珠单抗组成的IS疗程；开放符号，非IS控制动物。（A） 血浆人类F.IX水平。（B） 血浆抗人F.IX总IgG水平。

表2

第27周hF.IX转基因表达和抗hF.Ⅸ抗体形成的高原水平

动物编号。	IS方案	hF.IX，纳克/毫升	hF.IX，正常值的%	抗hF.IX IgG，ng/mL	贝塞斯达滴度，BU
1001	无	479	9.6	2000	0
1002	无	200	4	2500	0
1003	无	188	3.8	2300	0
2001	MMF、西罗莫司、达克利单抗	0	0	14172	1.1
2002	MMF、西罗莫司、达克利单抗	0	0	32224	215
2003	MMF、西罗莫司、达克利单抗	0	0	22027	45
3001	MMF、西罗莫司	365	7.3	428	0
3002	MMF、西罗莫司	242	4.8	2923	0
3003	MMF、西罗莫司	240	4.8	8588	0

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在另一项实验中，测试了一种不同的IS方案，该方案由MMF和西罗莫司组成，不含达卡珠单抗（2-药物IS方案，第3组，n=3）。西罗莫司的初始负荷剂量（每天4 mg/kg，从第一天开始，持续一周）作为诱导方案(表1). 剂量为8×10¹²vg/kg AAV-2-hF.IX，所有接受该IS方案的动物在第27周的循环hF.Ⅸ表达水平处于治疗范围内（240–365 ng/mL或正常值的4.8%-7.3%，表2)与非IS组1相比(P（P）= .952,图1A、，​A、 2A）。2A） ●●●●。2药IS方案的3只动物中有2只（第3组）产生了低滴度非中和抗体(图2B） 如前所述，恒河猴静脉注射人类F.IX蛋白²⁶如本研究中非IS组1所观察到的(表2).

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图2

接受MMF和西罗莫司的恒河猴AAV2-hF.IX肝基因转移后hF.IX表达水平和抗hF.IX-抗体形成.时间0表示基线样本；虚线垂直线显示了IS被撤回的时间。每条线代表一种动物。所有动物接受8×10¹²经肝动脉输注的AAV-2-hF.IX载体的vg/kg。（A） 血浆人类F.IX水平。（B） 血浆抗人F.IX总IgG水平。

对不接受IS或不接受达利珠单抗治疗的动物（0/6只动物中存在抑制剂）与接受达利珠单抗治疗（3/3只动物中有抑制剂）的动物的结果进行统计分析，结果没有显示出差异(P（P）= .182). 然而，如果将这些数据与我们早先发表的关于6名未接受IS或2药非达利珠单抗治疗方案的NHP缺乏抑制剂的研究相结合，²³结果具有统计学意义（在未接受IS或2药方案的0/12中存在抑制剂，在接受3药、达利珠单抗方案的3/3动物中存在抑制剂，P（P）= .025).

3药物方案增加了B细胞对AAV衣壳的反应

在研究期间每周采集血清样本，并检测抗AAV-2 IgG的产生。所有动物在载体输注后产生AAV-2衣壳抗体，血浆中抗-AAV-2 IgG水平在第7周左右达到峰值(图3). 值得注意的是，接受由MMF和西罗莫司组成的IS疗程（第3组，2药物方案）的动物表现出所有实验组中最低的抗AAV-2抗体滴度(图3)，表明2药物组合部分阻断了B细胞对衣壳蛋白的反应。在研究组之间测量抗体滴度的显著差异，接受基于MMF、西罗莫司和达利珠单抗的3药物IS方案的动物（第2组）产生的抗体滴度高于未接受IS方案（第1组）或2药物方案（第3组）的动物(P（P）组2 vs组1，组2 vs.组3<.05；P（P）>组1 vs组3为0.05）。虽然抗T细胞方案不能完全阻断B细胞对现成抗原（即AAV-2衣壳）的反应并不令人惊讶，但达克利珠单抗的增强效果有些出乎意料，因为is药物的联合使用至少会降低体液反应的幅度。

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图3

载体递送后形成抗AAV-2抗体.时间0表示给药时间；垂直虚线表示IS被撤回的时间。所有动物接受8×10¹²vg/kg通过肝动脉输注的AAV-2-hF.IX载体。每行代表一组3只动物的平均值（+SD）。

在所有3个组中，到第13周，抗AAV-2抗体滴度下降到类似水平，更重要的是，在中断IS方案后，没有观察到滴度的第二个峰值，这表明在该模型中，持续10周的IS可能足以阻止对衣壳蛋白的免疫反应。

添加达利珠单抗与CD4显著降低相关⁺CD25型⁺福克斯P3⁺细胞

对人类F.IX转基因产物和AAV-2衣壳的抗体反应分析表明，使用达克利单抗可增强B细胞对抗原的反应。先前的研究表明，CD4的调节性T细胞（Tregs）⁺CD25型⁺福克斯P3⁺确实参与了肝基因转移后对转基因产品的耐受诱导。^16,17然而，这些细胞也是达克利珠单抗的靶细胞，达克利珠单抗是一种针对IL-2受体CD25的抗体。为了测试我们研究中使用的IS方案对Tregs的影响，在基线和第2、3、11和13周收集PBMC；细胞表面染色检测CD4和CD25，细胞内染色检测FoxP3。在第-1天和第15天服用达利珠单抗（第2组，表1)导致CD4数量急剧下降⁺CD25型⁺福克斯P3⁺单元格(图4B） 达到几乎无法检测到的水平。到第11周，Treg人群恢复到与基线水平相似的水平，正如之前在接受类似IS方案的人类中观察到的那样。²⁷CD4的数量⁺CD25型⁺福克斯P3⁺在整个研究过程中，未接受IS（第1组）或MMF和西罗莫司（第3组）的动物的T细胞保持不变(图4A、 C）。

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图4

AAV-2-hF.IX肝基因转移前后PBMC上调节性T细胞的染色每行代表一只动物。y轴显示CD4的百分比⁺CD25型⁺福克斯P3⁺T细胞。CD4上的细胞被选通⁺CD25型^你好并对FoxP3进行分析。（A） 只接受AAV载体而不接受IS的动物。（B）同时接受载体和由MMF、西罗莫司和达利珠单抗组成的IS方案的动物。（C） 动物接受载体、MMF和西罗莫司。

讨论

我们之前对严重血友病B患者的研究¹⁰确定以2×10的剂量输注AAV-F.IX载体¹²vg/kg导致治疗水平的F.IX表达（10%-12%）。然而，表达只持续了几周，并被CD8终止⁺T细胞对AAV衣壳的反应。¹¹这里描述的实验的目的是确定短疗程IS是否用于阻断CD8⁺在大动物模型中，T细胞对衣壳蛋白的反应会改变AAV载体转导的任何特征或对F.IX的免疫反应。

我们选择NHP进行这些研究，原因如下：（1）使用is药物的经验丰富^28–30和AAV载体输注^31–33在NHP中，这两种药物的基线毒性在这些动物中都有明确的描述；（2） 由于灵长类动物之间的蛋白质结构域序列高度保守，人类使用的达利珠单抗（人源化抗IL-2受体抗体）等IS药物在NHP中很活跃，但在其他哺乳动物中不活跃；（3）在恒河猴中使用人类F.IX转基因，模拟了人类血友病基因转移的免疫挑战，因为非人灵长类动物和血友病人类都不一定对载体表达的人类F.Ⅸ转基因具有耐受性。恒河猴F.IX序列与人类序列461个残基中的11个不同²⁶; 对于某些F.IX基因发生单点突变的血友病受试者，野生型人类F.IX的基因转移比这里提出的恒河猴模型的免疫挑战要轻；对于那些具有早期终止密码子的人来说，由于遗传物质的损失更大，基因转移将是一个更严峻的挑战。³⁴

设计阻断CD8方案的合理起点⁺T细胞对AAV衣壳的反应是使用器官移植中使用的方案。器官移植的目标是阻断T细胞对捐赠器官上数千种真核抗原的反应，而AAV介导的基因转移的目标是阻止T细胞对载体衣壳的反应，衣壳是一种仅短暂存在且不表达的单一抗原。血友病的另一个复杂因素是，所确定的方案必须阻止T细胞对衣壳蛋白的反应，而不破坏对F.IX的耐受性。我们和其他人的早期工作已经证实，AAV介导的转基因肝脏表达促进了对转基因产品的耐受。在小鼠中，这种效应由CD4亚群介导⁺CD25型⁺T细胞。¹⁷

因为包括MMF、西罗莫司和白细胞介素2受体α（IL-2Rα）拮抗剂在内的肾移植方案的安全性在HCV中得到了很好的证实⁺患者，^13,14对于我们感兴趣的患者群体（即患有严重血友病的成年人）来说，这是一个合理的选择，其中许多人是HCV⁺.³⁵我们的目标是确定该方案在AAV介导的肝基因转移中是否安全，但我们认识到，加入抗CD25抗体（达克利单抗）可能会改变调节性T细胞的诱导。然而，因为对转基因产品的耐受性被认为是由多种机制引起的，包括Fas-FasL介导的细胞死亡^16,17和T细胞无能，¹⁷由于调节性T细胞诱导的时机在耐受性发展中的作用尚不明确（尤其是在大动物模型中），我们假设该方案不会完全消除AAV介导的人类F.IX基因转移到恒河猴肝脏中常规观察到的人类F.IX耐受诱导。^31–33NHP的这项研究表明，尽管该方案并未导致AAV-2载体的转导效率或生物分布发生任何显著变化，但对转基因产物的免疫反应发生了不可接受的改变。具体来说，正如我们在这里所显示的，CD4的显著减少⁺CD25型⁺福克斯P3⁺服用达利珠单抗的细胞群与F.IX抑制性抗体的形成有关。此外，即使在IS持续一段时间后，这些抗体也没有消失。这确立了两个重要结论：第一，抗CD25抗体不能作为IS方案的一部分用于对转基因产品不完全耐受的受试者的肝基因转移；第二，如果确实涉及抗原特异性调节性T细胞，则必须在载体给药时或给药前后进行诱导，以提高对转基因产品的耐受性。正如我们随后所表明的那样，从该方案中省略达卡珠单抗可以使该细胞群持续存在，并且似乎避免了调节性T细胞的诱导，正如抗F.IX抑制性抗体的缺乏所证明的那样。

最近的调查结果²⁷在接受肾移植的人类中，单剂量达利珠单抗给药8周后，CD4人群⁺CD25型⁺Tregs存在，在体外抑制淋巴细胞对同种抗原增殖的能力方面与is前Tregs没有区别。如图所示，非人类灵长类动物服用达珠单抗后Treg耗竭和恢复的动力学与人类相似。然而，在这里我们已经显示了CD4人群的恢复⁺CD25型⁺福克斯P3⁺非人类灵长类动物基因转移模型中的T细胞与转基因产品耐受性的恢复无关，因为人类F.IX转基因产品的抑制性抗体会随着时间的推移而持续存在。这些结果表明，在转基因表达开始的早期，需要这种对达克利珠单抗敏感的T细胞群体来建立对新合成蛋白的耐受性。

这些研究无法回答的关键问题是，仅由MMF和西罗莫司组成的方案是否足以抑制人类记忆CD8⁺T细胞对AAV衣壳的反应，因为迄今为止还不可能产生记忆CD8的动物模型⁺人类T细胞对衣壳的反应。^11,36如果方案不足以抑制存储器CD8⁺T细胞对衣壳蛋白的反应，如前所述，即使在患有严重血友病B的男性患者中这些IS药物与AAV-F.IX联合用药，也会在载体输注数周后出现转氨酶升高和F.IX表达缺失。¹⁰

Jiang等人的早期研究²³证明由MMF和他克莫司（FK-506）组成的方案不会改变AAV-8-F.IX在NHP中的转导效率或生物分布。然而，由于AAV ITR与FK-506结合蛋白相关的报道³⁷由于担心这种相互作用的影响可能难以预测，我们希望避免使用他克莫司。

由于衣壳抗原只是短暂存在，人们可以预测只需要短暂的is过程。在这方面，令人感兴趣的是，在载体输注后10周退出is并没有伴随抗AAV抗体滴度的任何升高。这补充了Jiang等人报告的结果，即当IS在6周停止时，抗体滴度升高。²³

我们发现，用达利珠单抗阻断IL-2受体可提高抗AAV-2抗体滴度，并形成针对人类F.IX转基因的中和抗体。同样，在小鼠中的研究结果表明，体内CD25的耗竭⁺细胞增强对完全弗氏佐剂中注射的外源蛋白抗原的体液反应，³⁸以及对CD4中高度表达的CTLA-4受体的干扰⁺CD25型⁺福克斯P3⁺T细胞，导致T细胞介导的结肠炎模型中效应T细胞反应增强。³⁹

另一个关注点涉及AAV-2-F.IX载体表达的因子IX水平。非免疫抑制动物（第1组，剂量为8×10）的平均高原hF.IX水平为289 ng/mL¹²vg/kg）与我们之前使用AAV-8-hF.IX载体（剂量为5×10¹²vg/kg）。²³这表明AAV-8在小鼠体内的显著剂量优势在高等物种中可能没有观察到。

总之，针对AAV介导的基因转移到严重血友病B患者肝脏的临床研究结果，在该研究中，CD8终止了捐赠基因的表达⁺T细胞对AAV衣壳的反应导致转导细胞的破坏，我们设计并测试了一种用于阻断CD8的辅助方案⁺T细胞对衣壳的反应。在一个非人类灵长类动物模型中，我们已经表明，由MMF和西罗莫司组成的常用器官移植方案不会改变AAV转导效率，也不会促进转基因产物F.IX抗体的形成。然而，在该方案中添加抗IL-2受体达利珠单抗，持续导致在NHP中形成抗F.IX抗体，可能是由于干扰CD4的诱导⁺CD25型⁺福克斯P3⁺载体输注后早期的调节性T细胞。我们得出的结论是，抗IL-2受体抗体不能作为IS方案的一部分，用于对转基因产品不完全耐受的受试者的肝脏基因转移，并且调节性T细胞的诱导时间对于在AAV介导的、肝脏导向的基因转移中建立转基因耐受性至关重要。

致谢

脚注

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