RNA。2007年10月;13(10): 1668–1674.
新鲜冷冻和福尔马林固定石蜡包埋样品提取RNA的microRNA表达系统分析
,1,三 ,1,三 ,1 ,1 ,1 ,2和1
亚光溪
1美国阿拉巴马州莫比尔市米切尔癌症研究所癌症基因组实验室,邮编36688
去中岛
1美国阿拉巴马州莫比尔市米切尔癌症研究所癌症基因组实验室,邮编36688
伊莱恩·加文
1美国阿拉巴马州莫比尔市米切尔癌症研究所癌症基因组实验室,邮编36688
克里斯·莫里斯
1美国阿拉巴马州莫比尔市米切尔癌症研究所癌症基因组实验室,邮编36688
工藤贤治
1美国阿拉巴马州莫比尔市米切尔癌症研究所癌症基因组实验室,邮编36688
鞠景芳博士
1美国阿拉巴马州莫比尔市米切尔癌症研究所癌症基因组实验室,邮编36688
1美国阿拉巴马州莫比尔市米切尔癌症研究所癌症基因组实验室,邮编36688
2日本东京女子医科大学消化研究所外科
三这些作者对这项工作做出了同样的贡献。
将请求重印至:Ju Jingfang,Mitchell癌症研究所癌症基因组学实验室,MSB2316,307 N.University Boulevard,Mobile,AL 36688,美国;电子邮件:在ujj的位置; 传真:(251)460-6994。 2007年5月17日收到;2007年7月9日接受。
摘要
microRNAs(miRNAs)是一种非编码小RNA,主要通过与靶mRNAs的3′UTR相互作用在翻译水平上调节基因表达。存档的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本是发现生物标记物的极好资源。目前缺乏对miRNAs稳定性的系统分析以及利用FFPE样本进行表达分析的优化条件。在本研究中,使用高通量锁定核酸基miRNA阵列分析FFPE样品中miRNA的表达。还使用miRNA实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析研究了福尔马林固定对miRNA稳定性的影响。利用10年前的样本对结直肠癌FFPE存档标本的miRNAs稳定性进行了表征。我们的结果表明,1μg新鲜冰冻标本和1–5μg FFPE标本的miRNA表达谱具有良好的相关性(相关系数R(右)
2= 0.86–0.89). 基于实时qRT-PCR分析,不同福尔马林固定时间不会改变miRNAs的稳定性。40例结直肠癌FFPE标本中代表性miRNA表达无显著差异。本研究为利用FFPE样本进行癌症和其他类型疾病的miRNA研究奠定了基础。
关键词:微RNA、FFPE、表达、微阵列
结果
福尔马林固定对miRNA表达的影响
众所周知,手术后,临床样本在不同医院的福尔马林中固定不同的时间。保存的组织标本对于传统的组织病理学分析来说是完美的。为了研究福尔马林固定对miRNA稳定性的潜在影响,将新鲜小鼠肝组织从1天到5天进行福尔马林缓冲固定。表示小鼠肝脏样品处理和miRNA分析的示意流程图。具有代表性的RNA图像如所示(通道1,RNA阶梯;通道2,新鲜冷冻样品;通道3,FFPE样品)。不同时间分离的RNA具有相似的凝胶图像外观。一般来说,一个组织切片(2×4 cm)的总RNA产量2,10μm厚)至少为10μg,这足以用于实时qRT-PCR和基于LNA的miRNA阵列分析。我们的结果表明,基于实时qRT-PCR分析,miRNA的表达相对稳定,不受福尔马林固定的影响().
来自小鼠肝组织的样品处理和miRNA表达分析的示意图。
福尔马林固定对miRNA表达的影响。(A类)代表性RNA琼脂糖凝胶图像(lane1,RNA梯形图;车道2、新鲜冷冻样品;车道三,FFPE样品)。(B类)的表达式健康安全管理局-miR-16型和运行6b采用实时QRT-PCR分析福尔马林固定小鼠肝脏样本。
新鲜冷冻和FFPE样品中miRNA表达的相关性
为了确定FFPE样品和新鲜冷冻样品的miRNA表达谱的相关性程度,将FFPE样品的miRNA表达谱与新鲜冷冻样品进行了比较。为了确定FFPE样品中总RNA的最佳浓度,以便使用基于LNA的阵列进行miRNA表达分析,使用1–5μg FFPE样品总RNA进行比较。总的来说,我们的结果表明,与新鲜冷冻样品相比,FFPE样品的miRNA表达谱具有良好的相关性(),相关系数范围为R(右)
2=0.86至0.89。通过分析不同数量的FFPE样品中的miRNA表达谱,进一步加强了这一结果R(右)
2= 0.90–0.96 ().
新鲜冷冻和FFPE样品中全球miRNAs表达的相关性分析。(A–C)FFPE样品与1μg新鲜冷冻样品的不同输入RNA量(1、3和5μg)的比较。
(A–C)FFPE样本不同总RNA输入量(1、3和5μg)之间的全局miRNAs表达相关性分析。
新鲜冷冻和FFPE样品mRNA转录表达的相关性
为了确定FFPE样品与新鲜冷冻样品的mRNA表达谱的相关性程度,我们还研究了FFPE样品和新鲜冷冻样品之间的mRNA表示谱。中的结果FFPE样品的mRNA谱与新鲜冷冻样品的mRNA谱相关性较差,相关系数为R(右)
2= 0.28 (; 所有基因)和R(右)
2= 0.56 (; 重叠基因)。
新鲜冷冻和FFPE样品信使RNA表达的相关性分析。(A类)全球mRNA表达比较。(B类)重叠mRNA表达比较。
FFPE临床样品中miRNA的稳定性
为了进一步研究FFPE样品中miRNAs随时间的稳定性,从10岁以下的结肠癌FFPE样品分离出RNA样品。由于缺乏用于全球相关性研究的成对新鲜冷冻临床标本,因此使用实时miRNA qRT-PCR分析来量化miRNA的表达水平。基于实时qRT-PCR分析,miRNA的表达相当稳定(). 我们还对该样本进行了miRNA阵列分析显示了1996年结直肠癌FFPE样本中miRNA表达的代表性图像,具有良好的信号质量。
5S的实时定量PCR表达分析(A类)和miR-181b(B类)来自存档的结肠癌临床标本。该线表示不同年份FFPE样本中miRNA表达水平中位数的趋势。P(P)-该值通过Wilcoxon的符号秩和检验进行计算。
10岁FFPE结肠癌样本的代表性miRNA阵列图像。
讨论
miRNAs有望成为癌症诊断和预后的潜在生物标志物以及新的靶点。为了实现这一潜力,利用存档的FFPE样本进行miRNA表达分析是关键组成部分之一。福尔马林固定和石蜡包埋对临床样本中miRNA稳定性和表达水平的影响尚未进行系统研究。在本研究中,使用新鲜冷冻和相应的FFPE样品,使用一种当前可用的基于LNA的miRNA阵列,比较miRNA的表达谱。基于LNA的miRNA阵列的优点是其对miRNA的高度特异性和敏感性,并且不需要任何样品富集或分馏(Castoldi等人,2006年). 这是通过使用混合DNA/LNA修饰捕获探针实现的(尼尔森等人,2003年). 提高的热双相稳定性可以通过修改LNA含量和寡核苷酸长度来实现捕获探针的标准化熔化温度。
首次使用实时qRT-PCR分析评估福尔马林固定对miRNA表达的影响。根据我们的结果,福尔马林固定5d后miRNAs的表达没有显著影响(). 这表明了与mRNA相比,使用miRNA进行生物标记物发现的明显优势。虽然miRNA稳定性更好的确切原因尚不清楚,但我们推测,miRNA的小尺寸以及二级结构可能有助于稳定性。
我们使用基于LNA的miRNA阵列分析进一步证明了FFPE样品和相应的新鲜冷冻样品之间的全球miRNA表达谱高度相关(,). 我们的数据进一步证实了Nelson等人(2004)其中FFPE样品可用于miRNA谱分析。这些结果为使用miRNAs作为生物标记物和在靶点发现研究中使用FFPE样品提供了坚实的基础。
同时,我们还使用Codelink寡核苷酸阵列比较了mRNA转录物的表达谱,其中我们使用了新鲜冷冻和FFPE样品。与miRNA结果的良好相关性相比,我们发现这两种样本之间的相关性仅为R(右)
2在最佳情况下=0.56,表明由于降解,大部分mRNA转录物无法产生良好信号(). 综上所述,这些结果表明,当使用FFPE样本时,miRNAs可能是比mRNA更好的表达谱分析选择。
此外,利用实时qRT-PCR分析对存档结直肠癌标本中miRNA的稳定性进行了表征。我们的结果表明,miRNA的表达在10年内相当稳定(). 由于缺乏成对的临床存档新鲜冰冻标本,我们无法直接比较新鲜冰冻和相应的FFPE临床标本之间的miRNAs表达谱。尽管如此,我们仍然可以根据这一点和配对小鼠肝脏样本的数据来解决这个关键问题。随着时间的推移,miRNA是相当稳定的,这一点仍然令人信服。通过使用基于LNA的miRNA阵列分析10年龄FFPE结肠癌样本的miRNA表达,进一步支持了这一观点,并且在这些样本中检测到了高质量的信号().
总之,在本研究中,我们利用基于LNA的miRNA阵列分析系统地研究了FFPE样品的miRNA表达谱。我们的结论是,FFPE样品中miRNA的表达与新鲜冷冻样品有良好的相关性,福尔马林固定不会显著改变miRNA的稳定性。利用存档的FFPE样本分析miRNAs是可行的,它可能为癌症研究和其他疾病的生物标记物和新靶点发现带来巨大希望。
材料和方法
样品制备
一只成年小鼠被宫颈分离处死。快速取出整个肝脏,并用冰镇1×PBS冲洗三次(). 六分之一的肝组织在液氮中快速冷冻。将其余部分分成五块,然后在10%缓冲福尔马林(Fisher Scientific)中固定1天至5天。对一部分三维福尔马林固定的肝组织进行脱水和石蜡包埋的常规临床样品制备方案。40例结直肠癌FFPE标本取自日本东京女子医科大学胃肠研究所外科。所有患者在研究开始前都签署了详细的同意书。使用日本东京女子医科大学病理学系的标准方法,在10μm厚FFPE组织的标准载玻片上预先制备实验样品。
RNA分离
对于snap冷冻和福尔马林固定样品,使用组织匀浆器(OMNI International)破坏TRIzol试剂(Invitrogen)中的细胞。从500μL等分样品中分离出总RNA。对于FFPE样品,将块切割成10μm厚的块,并将一个组织切片放置在1.5 mL无核微离心管中。添加1毫升二甲苯(EMD)用于脱蜡,并在室温下涡流5分钟。样品在60°C下放置3分钟,然后在室温下以14000 rpm离心7分钟。取下上清液,加入1mL 100%乙醇并旋涡7分钟。此乙醇清洗步骤重复两次。将样品风干,向试管中添加360μL含有30 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、1%SDS(均来自Sigma)的消化缓冲液和无核酸水。将样品均匀化,并添加40μL蛋白酶K(Qiagen,Inc.)溶液。样品在56°C下培养,直到组织完全消化(≤3 h)。随后,添加2体积的TRIzol LS试剂(Invitrogen),并在室温下旋转5分钟。
将100微升1-溴-3-氯丙烷(BCP)溶液(分子研究中心公司)添加到样品中。涡流2分钟后,样品在室温下培养3分钟。在14000 rpm下离心7 min后,将含有RNA的上水相转移到新试管中。添加等量(100μl)的100%异丙醇(Sigma),并在−80°C下沉淀60 min。在4°C下以14000 rpm离心7 min之后,去除上清液,并添加1mL 75%乙醇进行洗涤。我们反复离心并去除上清液。将RNA颗粒风干并在30μL无核酸水中洗脱。
福尔马林固定样品的miRNA逆转录和基于TaqMan的qRT-PCR分析
特定逆转录的引物集包括hsa-miR-16和内生控制运行6B并且按照制造商的协议使用了高容量cDNA存档试剂盒。除另有说明外,所有试剂和仪器均来自Applied Biosystems Inc。简单地说,将含有10×RT缓冲液、5×RT引物、MultiScribe逆转录酶、RNase抑制剂和无核水的反应主混合物与20 ng总RNA样品混合。混合物在16°C下培养30分钟,在42°C下培育30分钟,然后在85°C下孵化5分钟。使用Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行qRT-PCR。含有TaqMan 2×Universal PCR master mix(No Amperase UNG)、10×TaqMan分析和20μL体积RT产物的PCR主混合物的处理如下:95°C处理10分钟,然后在95°C下40次循环15秒,60°C处理60秒(n个= 3). 在每个循环的终点收集信号。新鲜样品也同时进行了处理。
利用LNA miRNA阵列分析miRNAs的表达
使用miRCURY LNA microRNA阵列标记试剂盒(Exiqon Inc.)标记来自snap冷冻样品的1微克总RNA和来自FFPE样品的1μg、3μg和5μg总RNA。除非特别提及,否则用于此部分的所有试剂均来自Exiqon。简言之,将10μL 2.5×标记缓冲液、2μL Hy5荧光标记、5μL标记酶和1μL负载对照与不同量的总RNA样品在0°C的25μL体积中在黑暗中孵育60分钟,然后在65°C下孵育15分钟,以停止标记反应。将标记的样品与等体积的2×杂交缓冲液在95°C下混合3-5分钟,并在几秒钟内冷却。样品装载在miRCURY LNA microRNA阵列(Exiqon Inc.)上,该阵列上预先覆盖有50μL体积的塑料室(Grace Bio-Labs)。密封装填口后,将载玻片放在预湿杂交玻片室中,并在60°C下培养16小时。取下塑料室后,分三步清洗载玻片。第一步是立即将载玻片浸泡在预热的2×盐缓冲液(含0.2%清洁剂溶液)中2分钟。第二步是用1×盐缓冲溶液冲洗载玻片10秒,然后在新鲜的1×盐缓冲器中冲洗2分钟。第三步是使用0.2×盐缓冲液清洗载玻片2分钟。清洗后,通过1000 rpm离心5分钟使载玻片快速干燥。扫描由Axon GenePix Professional 4200A微阵列扫描仪(Molecular Devices Corp.)执行。图像由ImaGene 7.0(BioDiscovery Inc.)进行网格化和分析。通过将每个基因的测量值除以单个阵列中所有测量值的第50百分位,进行逐芯片归一化。导出所有标准化数据以进行进一步分析。根据上述程序,还对一份1996年临床FFPE样本进行了LNA miRNA阵列处理。
利用mRNA微阵列进行mRNA转录表达分析
CodeLink Mouse Whole Genome Bioarray(GE Healthcare/Amersham Biosciences)包含约36000个基因探针,用于从snap冷冻和FFPE样品中生成mRNA的基因表达谱。RNA样本用DNA酶处理以避免潜在的DNA污染。将15微升DNase处理混合物(2μL RQ1 RNase-Free DNase,11μL RQ1 DNase 10×反应缓冲液,以及2μL RNasin Plus RNase抑制剂;Promega)与每个样品在37°C的100μL体积中培养30分钟。然后添加115μL超纯苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,Invitrogen Inc.)。涡流2分钟后,以14000 rpm离心样品7分钟。小心取出上层水相,并与2体积的100%乙醇和1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.5)混合(Ambion Inc.)。样品在室温下保存15–30分钟,然后在14000 rpm下离心7分钟。去除上清液后,添加1 mL 75%乙醇进行清洗。我们重复离心,然后风干颗粒。样品溶解在无核水中。使用NanoDrop ND-100分光光度计(NanoDrot Technologies)测定所有样品的浓度。
使用来自新鲜冷冻和FFPE样品的2μg总RNA生成双标记cDNA。除非另有说明,否则所有试剂和方案均由GE Healthcare/Amersham Biosciences提供。纯化后,使用双链cDNA作为模板,使用T7 RNA聚合酶和生物素11-UTP(Perkin-Elmer)通过体外转录反应生成cRNA。将生物素标记的cRNA(10μg)片段化并与小鼠全基因组生物阵列杂交。对阵列进行清洗,并用Cy5-streptavadin染色。清洗后,用Axon GenePix Professional 4200A微阵列扫描仪在GenePix Pro 5.1软件(Molecular Devices Corp.)下对干燥的载玻片进行扫描。这些图像由Codelink 4.1软件(GE Healthcare/Amersham Biosciences)网格化,并导出到GeneSpring software 7.2(Agilent)。通过将每个基因的测量值除以单个阵列中所有测量值的第50百分位,实现了每芯片标准化。导出标准化数据以进行后续分析。
临床FFPE样品的miRNA逆转录和SYBR Green-based qRT-PCR分析
米尔用于miRNA特异性逆转录的Vana qRT-PCR引物集(Ambion Inc.),包括hsa-miR-181b根据制造商的方案使用内源性对照5S rRNA。简单地说,反应主混合物包含米尔Vana 5×RT缓冲器,1×米尔将Vana RT引物、ArrayScript酶混合物和无核酸水与20 ng总RNA样品混合。将这些混合物在37°C下孵育30分钟,然后在95°C下孵育10分钟。使用Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行qRT-PCR米尔Vana qRT-PCR miRNA检测试剂盒(Ambion Inc.)。PCR主混合物包含米尔Vana 5×PCR缓冲液(含SYBR Green I),50×ROX,SuperTaq聚合酶,米尔Vana PCR引物和RT产物的处理如下:95°C处理3分钟,然后在95°C下40次循环15秒,60°C处理35秒(n个= 3). 在每个循环的终点收集信号。
统计分析
使用JMP 6.0软件(SAS Institute Inc.)进行统计分析。对snap冷冻和FFPE样品的所有归一化数据进行分析,以确定表达的相关系数。采用Wilcoxon符号秩和检验分析不同年份临床存档样本中miRNA表达的差异。P(P)-<0.05的值被解释为具有统计学意义。
致谢
我们感谢Exiqon Inc.的Mikkel Noerholm博士对我们手稿的批判性评论。该研究部分得到了NIH1R21CA114043(J.J.)的支持。
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