以可预测的方式改变病毒基因型，从而导致基因表达发生变化的能力，对于基因功能和控制的研究来说是非常宝贵的。然而，许多病毒，特别是RNA病毒的遗传流动性，是由同源重组产生的，加上先天性聚合酶错误率，通常很有可能逆转自然和工程基因的改变。我们表明，可以利用控制负链RNA病毒基因表达的一般机制，以可预测的方式改变基因表达水平。在本报告中，我们描述了如何利用非片段、负链RNA病毒的基因组操作来转位复制所必需的基因，以不可逆的方式系统地改变病毒的表型。
非片段负链RNA病毒（顺序单核糖核酸）由许多人类、动物、植物和昆虫的重要病原体组成。按顺序排列的四个病毒家族是：鼠疫病毒科如狂犬病病毒、水泡性口炎病毒（VSV）、马铃薯黄矮病毒；这个副粘病毒科如麻疹、人和牛呼吸道合胞病毒；这个丝状病毒科埃博拉和马尔堡病毒，以及博尔纳病毒科这些病毒通过与单个转录启动子相关的高度保守的基因顺序控制基因表达的方式非常简单(1,2). 靠近3′启动子位点的基因转录水平较高，而那些位于较远位置的基因随着与启动子距离的增加转录水平较低(三——6). 编码按化学计量量需要的蛋白质的基因，例如基因组包被和复制所必需的核衣壳蛋白N，位于3′末端或附近，而编码催化量需要的蛋白的基因，如RNA依赖的RNA聚合酶L，则更多位于启动子远端。观察到核衣壳（N）蛋白、磷蛋白（P）和聚合酶（L）蛋白的相对摩尔比对最佳VSV病毒RNA复制至关重要，这表明了基因调控的重要性(7——9)和RNA复制在体外在培养细胞中与合成的N蛋白量成正比(10,11).
通过进行性转录衰减进行的基因调控可能解释了单核糖核酸它提出了一种通过重新排列基因来操纵病毒表型的新方法。因为这些病毒的系统发育和实验研究都表明同源RNA重组很少发生(2,12,13)病毒基因的蓄意重排在自然界应该是不可逆的，并且有可能严重扰乱病毒的特性。
最近从狂犬病和VSV的杆状病毒cDNA克隆中发现了感染性病毒(14——16)以及其他几个单核糖核酸(17)，而这种恢复使得引入有意的基因改变成为可能。我们检查了是否可以以系统和可预测的方式降低对复制至关重要的基因产物的表达和降低病毒复制水平。我们通过将VSV核衣壳蛋白的基因从野生型启动子的近端位置移动到病毒基因组的后续位置来验证这一假设。本文描述了基因易位如何逐步减少N基因的表达，从而降低细胞培养中病毒的生长潜力并降低其对小鼠的致死性。重要的是，这些变化的发生并没有影响病毒引起宿主保护性反应的能力，这表明这种方法可能提供一种合理的方法，以实现对这种病毒的测量和稳定程度的衰减。
材料和方法
病毒和细胞。
印第安纳州VSV血清型的圣胡安分离物为本研究中使用的所有cDNA克隆提供了原始模板，但G蛋白基因除外，该基因源自印第安纳州的奥赛分离物(15). 使用幼仓鼠肾脏（BHK-21）细胞从cDNA中回收病毒，进行单步生长实验，并对RNA和蛋白质进行放射性同位素标记。BSC-40细胞用于斑块分析。
感染性病毒的质粒构建和回收。
VSV的五个基因都包含前五个核苷酸的相同序列：3′-UUGUC-5′。我们使用这个通用序列构建单个基因的分子克隆，从中可以通过限制性内切酶消化释放精确包含每个基因的DNA片段，并且可以重新组装基因，而无需对基因组引入其他所述的改变（L.A.B.、C.Pringle、V.P.和G.W.W.，未发表的工作）。包含单个基因的DNA片段以任何所需的顺序重新组装，以创建一个DNA质粒家族，其核苷酸序列与野生型VSV的核苷酸序列精确对应，但其基因重新排列的事实除外。引入了一种有意突变：在野生型序列中，P基因为3′-CA-5′后的未转录的基因间二核苷酸，这是3′-GA-5′，以符合所有其他基因连接。这些cDNA质粒包含T7启动子，它们表达了正义抗原基因VSV RNA的精确拷贝（通过使用定位为产生精确3′末端的δ型肝炎病毒核酶），并通过将其转染到VTF7-3感染细胞中，用于恢复感染性病毒，如前所述(15,18,19). 回收的病毒在含有阿糖胞苷的BHK-21细胞上通过低倍传代进行扩增，以抑制VTF7-3的复制，并通过0.2μ过滤器过滤以去除VTF7-3，重复该过程直到斑块试验检测不到VTF7-3。通过使用逆转录和PCR扩增病毒基因组的重排部分，然后进行限制性内切酶分析，验证了回收病毒的基因顺序（图。).
恢复的病毒基因组中的基因顺序。在细胞培养中经过五次传代后，从回收的病毒N1–N4中分离出基因组RNA，并通过逆转录和PCR以及PCR产物的限制性内切酶分析进行分析。PCR使用分别退火到N或L基因（箭头所示位置）和未消化产物（通道2、4、6和8）或带有限制性内切酶的消化后产物（通道1、3、5和7）的引物进行Bgl公司II（N1和N2）或生态RI（N3和N4）在溴化乙锭存在下在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。Lanes M=标记DNA片段，大小如图所示。
单周期病毒复制。
BHK-21细胞以三倍的倍数被感染。吸附1小时后，移除接种物，清洗培养物两次，添加新鲜培养基，并在31°C或37°C下培养。在36小时内以指定的间隔采集样本，并通过菌斑分析对病毒进行定量。
病毒RNA和蛋白质合成分析。
用5个噬斑形成单位（pfu）/细胞感染BHK-21细胞，并用代谢标记分析病毒RNA或蛋白质合成[三H] 尿苷（33μCi/ml）在放线菌素D（5μg/ml）存在下2小时，或[35S] 蛋氨酸（20μCi/ml）分别持续30分钟。标记期结束后，收集细胞，制备细胞质提取物，并按所述分析RNA或蛋白质(8,18,19). RNAs通过放射自显影的密度分析定量，蛋白质通过磷光成像定量，并计算摩尔比率。
小鼠的致死率。
在从Taconic农场获得的3至4周龄雄性瑞士-韦伯斯特小鼠中测量单个病毒的致死率。用氯胺酮/甲苯噻嗪轻轻麻醉5至7只动物，并接种稀释PBS或连续10倍稀释的单个病毒。脑内接种小鼠（IC），接种30μl；鼻内接种者（IN）接种15μl。每天观察动物，LD50使用Reed和Muench方法计算每种病毒(20).
保护老鼠。
对用稀释液接种IN的对照小鼠组或用非致命剂量的个别病毒接种IN的小鼠组进行监测，以中和尾流产生的血清抗体。接种后14天，用1.3×10攻击小鼠6如上所述，注射N1野生型病毒的pfu。对受挑战的动物进行了21天的监测。
结果
重组病毒的产生和恢复。
我们通过操作之前制作的感染性cDNA克隆，重新排列了VSV的基因(15)将N蛋白的基因从其正常启动子近端位置转移到基因顺序中的第二、第三或第四个位置（图。). 除故意改变一个核苷酸外，病毒核苷酸序列的所有其他方面均未改变。野生型病毒中P基因3′-CA-5′后的未转录的基因间二核苷酸被制成3′-GA-5′，以符合所有其他基因间连接。先前的研究表明，这种变化对转录几乎没有影响(21). 为了策略的有效性，还从与对照组相同的成分中重建了野生型基因序列，并且在所有后续实验中，该病毒被用作野生型病毒对照。通过将cDNA转染到表达T7聚合酶的重组痘苗病毒感染的细胞中，病毒得以恢复（VTF7-3；参考文献。22)并从带有T7启动子的质粒中表达VSV N、P和L蛋白(15). 根据N基因的位置指定回收的病毒：野生型为N1，N基因易位到第二、第三或第四位置的病毒为N2、N3或N4（图。). 回收病毒的典型斑块如图所示（图。)N4病毒的大小从野生型（3mm）减小到<0.5mm。
野生型（N1）VSV和重排病毒N2、N3和N4的基因顺序和斑块表型。
通过使用逆转录和PCR扩增病毒基因组重排部分，然后对PCR产物进行限制性内切酶分析，在五次传代后验证每个回收病毒的基因顺序。使用位于N和L基因中的引物进行PCR，随着N基因向下移动到基因组的连续位置，消化前的产物大小与预测的大小完全相同（N1-N4病毒分别为3998、3175、2335和661 nt）（图。，车道2、4、6和8）。用限制性内切酶消化后Bgl公司II或生态RI分别在M或L基因中唯一裂解，观察到的消化产物大小与预测的完全一致（图。，车道1、3、5和7）。这些数据表明，回收的病毒的基因顺序与最初构建的一样，并且在细胞培养中传代五次后仍然如此。然后检查变异病毒的基因表达水平、细胞培养中的生长潜力和小鼠的毒力。
基因重排对mRNA和蛋白质表达的影响。
为了确定N基因的易位如何影响病毒基因的表达，用代谢标记法检测感染BHK-21细胞中病毒RNA和蛋白质的合成[三H] 尿苷或[35S] 蛋氨酸。基因重排导致11.1-kb基因组RNA或五种编码mRNA的大小没有变化，也没有观察到异常的病毒RNA（图。). 然而，随着其基因相继从N2、N3和N4病毒的启动子移开，N mRNA的数量从野生型水平大幅下降（野生型分别为36、6和3%；图。). 与这种减少一致的是，在病毒N4中观察到G mRNA的量增加，其中G基因移到离启动子更近的一个位置，因为N基因取代它成为基因序列中倒数第二个（图。). N2、N3和N4的基因组RNA复制量相对于野生型下降（分别为49%、26%和4%），伴随着N基因的表达降低，正如在N蛋白合成限制复制的情况下预测的那样。随着N基因逐渐向远端启动子移动，总转录水平也降低，可能是由于复制减少的一种次要影响。
N基因易位病毒的RNA合成。与野生型（N1）VSV相比，BHK-21细胞中由病毒N2、N3和N4引导的RNA合成模式显示出来。VSV特异性RNA被标记为[三H] 感染后3至5小时，尿苷在放线菌素D的存在下，通过凝胶电泳进行分析。基因组RNA和五种VSV mRNA的位置显示在图的左侧。P和M mRNA合并。通过放射自显影的密度分析定量RNA。
所有五种VSV蛋白都在感染重排病毒的细胞中表达，并且它们都与野生型病毒的蛋白相结合（数据未显示）。然而，随着其基因远离3′位，N蛋白合成下降。图中所示的数据。显示了野生型病毒N1中蛋白质的摩尔量是如何随着它们与3′末端的距离而减少的。当N基因易位时，图。结果表明，随着N基因在基因序列中从第一个移动到第二、第三或第四个，N蛋白相对于P蛋白的摩尔比逐渐降低。这些结果证实了先前对VSV基因表达和转录序列性质的分析的预测(三,5,6). 此外，这些数据直接证明了基因的位置决定了其表达水平。
重排病毒合成的蛋白质的摩尔比率。用代谢标记法分析病毒N1（WT）、N2、N3和N4在BHK-21细胞中合成病毒特异性蛋白的情况[35S] 蛋氨酸。蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离并用磷光成像仪定量，计算单个蛋白质相对于最接近启动子基因的摩尔比：野生型为N，重排病毒为P。
对分离的成熟N1-N4病毒中的蛋白质水平的检查表明，成熟病毒颗粒中蛋白质的相对摩尔比基本上与野生型病毒的蛋白质相对摩尔比相同（数据未显示）。然而，如下图所示，N2-N4感染产生的总体病毒较少，这与基因组RNA复制水平降低有关。
基因重排对病毒复制的影响。
对细胞培养中产生的子代病毒的分析表明，随着N基因转移到其正常启动子近端下游，病毒复制逐渐减少。单步生长曲线表明，与野生型病毒相比，在37°C时，N2的病毒产量减少了约15倍，N3减少了50倍，N4的复制能力减少了20000倍（图。). 病毒在31°C下的生长比较显示出类似的渐进性下降，但效果不太明显，总的来说，这种温度对生长更宽容（图。,插入). N4病毒在31°C下的复制比37°C好300倍，N2和N3病毒在31℃下的复制好≈10倍。野生型N1病毒的产量在两种温度下仅相差两倍。这些数据表明，尽管N2、N3和N4的基因为野生型，但基因重排和随后蛋白质摩尔比率的改变使病毒复制过程的某些步骤具有部分温度敏感性。如前所述，病毒的斑块大小也不同（图。)这一区别在两种温度下都是恒定的。
N基因易位病毒的复制。通过在感染3 pfu多重性的BHK-21细胞中单步生长，对重排病毒与N1（WT）的复制潜力进行比较分析。在指定的时间间隔采集的病毒的滴定度进行了两次分析，并对结果进行了平均。所示数据用于37°C下的复制。在31°C下也对复制进行了分析，在37°C或31°C下进行的单步生长在感染后36小时计算的每个细胞的病毒产量如插入.
N基因易位对小鼠致死性的影响。
小鼠在接种野生型VSV后易患致命性脑炎。1938年，萨宾和奥利茨基(23)描述了小鼠对脑炎的神经病理学和相对易感性与年龄和接种途径的关系，自此，幼年小鼠成为比较VSV及其突变体相对致死性的敏感模型(24,25). 通过IC和in接种，我们比较了N2、N3和N4病毒对幼年小鼠的致死率与N1野生型病毒的致死率。LD所需的病毒量50表中显示了每条路线通过IC接种，LD50每种病毒的剂量为1-5 pfu，尽管N4病毒的平均死亡时间大约是其两倍。这些数据表明，当直接注射到大脑，从而绕过大多数宿主防御系统时，变异病毒最终可能导致致命的脑炎。
表1
劳埃德50 值* 在pfu/小鼠中，死亡天数
|
|---|
| 集成电路 | 英寸 |
|---|
| N1型N个PMGL（重量） | 1 (3–6) | 11 (5–10) |
| 氮气压力N个MGL公司 | 5 (3–7) | 250† (9–12) |
| N3下午N个德国劳埃德船级社 | 5 (3–8) | 5,400† (7–9) |
| N4项目管理小组N个L（左） | 1 (4–11) | 30,000 (10–12) |
与这些结果相反，不同病毒在其LD中存在显著差异50给药IN时的值（表). 而LD50IN给药对野生型病毒的剂量为≈10pfu，N2、N3和N4病毒的剂量逐渐增加。N2需要20倍以上的病毒，N3需要500倍以上的细菌，N4需要3000倍于野生型的病毒，即LD需要30000 pfu50感染N2、N3和N4病毒后，与野生型相比，发病时间（皱皮、嗜睡和后肢麻痹）和死亡程度逐渐增加（图。)死亡率是剂量的函数（表). 这些数据表明，当通过外周途径给药时，在细胞培养中观察到的病毒复制的逐渐减少与小鼠死亡率的降低相关。
小鼠的相对致死率。IN接种小鼠后野生型和重排病毒的发病机制。对接种每种病毒300 pfu的小鼠组进行发病和死亡时间监测。
重组病毒抵御野生型挑战的能力。
当接种IC时，所有病毒都是致命的，这一观察表明，即使是最弱的病毒也能在小鼠体内复制。这一点，再加上IN给药后观察到的衰减，增加了衰减病毒可能仍然能够引发保护性免疫反应的可能性。为了测试这种可能性，用10倍野生型N1或变异病毒N2、N3或N4的连续稀释液接种IN免疫小鼠。14天后，用1.3×10 IN接种存活动物6野生型病毒pfu。与之前的研究一致，存活的动物百分比是免疫剂量的函数(24). 对于N2、N3和N4病毒，300 pfu/只小鼠是最低剂量，存活率为100%；30例pfu存活率为80-90%；3-6个pfu的存活率为45-85%；剂量低于3-6 pfu/只小鼠的结果与年龄匹配的未免疫对照组没有显著差异（图。，中的虚线A类). 对于野生型病毒，致死剂量和保护剂量相近，但总的来说，80-85%的动物在服用3-6 pfu病毒后存活下来，得到了保护。
抗体产生和抵抗致命攻击能力的比较。对病毒N1-N4刺激中和抗体或诱导保护抵抗致命野生型攻击的能力与病毒剂量的关系进行了比较。各组小鼠通过IN滴注含有3-6 pfu或10倍、100倍或1000倍以上的系列稀释病毒进行接种，并分析：(A类)IN接种预防1.6×10挑战的能力6野生型病毒的pfu（一种LD705-6周龄小鼠剂量；中的虚线A类显示未接种疫苗的对照组的致死率）。对受到挑战的动物进行21天的疾病或死亡症状观察。对两个独立实验的数据进行平均。(B类)激发前接种后14天血清中是否存在抗VSV中和抗体。中和抗体滴度表示为最高稀释度的倒数，可使病毒斑块减少50%。
第14天激发前的血清抗体测量表明，尽管小鼠的毒力减弱，但用N2、N3、，和N4高于在接种3-6 pfu野生型病毒后存活的动物中观察到的水平，并且通常以剂量依赖的方式增加（图。B类). 野生型病毒的致死性阻止了较高剂量下抗体滴度的直接比较，然而，动物体内的中和抗体滴度均接种了病毒N1-N4，然后用1×106野生型病毒的pfu为1:625～1:3125。这些数据表明，尽管N重排病毒在动物体内的复制和致死性减弱，但它们引发的保护性反应与野生型病毒相比没有减弱。
讨论
将特定变化引入负链RNA病毒基因组的能力使我们能够将N蛋白的基因转移到基因组上的连续位置，并直接证明基因相对于启动子的位置决定了表达水平。先前的研究表明，N蛋白合成水平控制RNA复制水平(10,11). 与这项工作一致，我们发现，随着感染病毒N2、N3和N4的细胞中N mRNA合成和蛋白质合成水平降低，基因组RNA复制水平也降低。相应地，病毒N4在细胞培养中产生的感染性病毒以四个数量级的增量减少（图。). 最后，与野生型病毒相比，接种IN后，伴随着复制潜力降低，N2、N3和N4病毒对小鼠的致死率降低了大约一个、两个或三个数量级。
这些数据表明，将复制所必需的单个基因转移到病毒基因组下方的连续位置，会逐步降低细胞培养中的生长潜力和病毒对小鼠的致死率。然而，病毒在小鼠中引发保护性免疫反应的能力并没有随着毒力的降低而改变。我们的结论是，由于这些病毒都含有野生型的基因补体，并且所有病毒都有能力复制，尽管复制水平降低，但复制水平足以诱导保护性宿主反应。对于野生型病毒，保护剂量和致死剂量相似，而N3和N4病毒的保护剂量和致命剂量相差两到三个数量级。综上所述，这些数据表明，有一种方法可以以可预测的增量方式衰减非片段负链RNA病毒，使人们能够确定最佳的衰减水平，以避免疾病的产生，而不会丧失诱导足够免疫反应的复制潜力。这项工作是用包含五个基因的VSV进行的。其他成员单核糖核酸包含6个、7个或10个基因。这样的研究将使人们能够测试支持有效复制所需的精确数量和精确摩尔比的基因产物，并将检查限制一个或多个复制所必需的基因的表达是否对复制潜力和毒力有类似的影响，如果可能有额外的基因产物涉及复制。
因为单核糖核酸尚未观察到进行同源重组(12)据预测，基因重排是不可逆的，由于几个原因，它可能为开发针对非片段负链RNA病毒的稳定减毒活疫苗提供一种合理的替代方法。减毒活病毒已被证明能有效预防许多疾病，例如天花、黄热病、麻疹、腮腺炎和脊髓灰质炎。然而，衰减策略在很大程度上是经验的。RNA病毒基因组因其高突变率而引人注目，这归因于它们缺乏校对和纠错机制。大多数RNA病毒以复杂的准种群存在（参考文献中综述）。26和27)这对它们的生物学有重大影响。最明显的是，病毒种群构成了一个巨大的变种库，在面对环境变化时具有潜在有用的表型。病毒聚合酶的错误率、病毒群大小、传播历史和适应环境变化之间存在复杂关系的研究进展表明，经验衰减方法在本质上可能不如先前认为的可靠(26,28). 复制所必需的基因重排利用控制基因表达的基本原理，即基因位置，来影响复制所必需基因的表达变化，从而利用缺乏自然手段来逆转重排，即缺乏同源重组。这种衰减方式避免了病毒因有限数量的单碱基突变而衰减，通过聚合酶错误和随后的选择而恢复毒性的固有潜力。
这些实验是用VSV进行的，VSV被认为是原型负链RNA病毒，以测试该方法的可行性。然而，美国西南部发生了一场不仅影响牛，也影响马的印第安纳VSV毒株疫情，造成经济困难，需要隔离，并强调需要疫苗。目前正在组织研究，以测试这种方法在自然宿主中适当遏制下的适用性和稳定性。基于基因组组织和基因表达控制机制的密切相似性单核糖核酸基因重排提供了一种改变病毒基因表达水平的策略，以研究基因产物在复制过程中的作用，并如本文所述，系统地、逐步地减弱病毒复制和致死性。这种衰减方法可能被证明适用于该序列的其他一些成员，并可能为开发针对许多有问题的病毒病原体的疫苗提供一种通用方法。
