2型糖尿病是一个日益严重的全球性健康问题，其特征是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍(1). 噻唑烷二酮类（TZDs）是一类用于治疗2型糖尿病的胰岛素敏感性药物(2)其中包括目前临床使用的罗格列酮和吡格列酮。TZD的作用机制通常归因于其直接激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ，这是一种对脂肪细胞分化和葡萄糖稳态至关重要的配体结合核受体(三). 然而，越来越多的证据表明，TZD也可能通过过氧化物酶体增殖物激活受体-γ-非依赖性途径发挥作用，尤其是通过调节线粒体活性(4–6). 科尔卡等。(7)最近在线粒体膜中发现了一种与光敏标记的吡格列酮交联的蛋白质(7). 交联可以与未标记的吡格列酮竞争，表明TZD结合的特异性。该蛋白因其线粒体位置和序列基序Asn-Glu-Glu-Thr（“NEET”）的存在而命名为mitoNEET。MitoNEET有一个推测的N末端跨膜螺旋，可能起到膜锚定的作用，还有几个不变的半胱氨酸和组氨酸残基，这表明MitoNEET含有CDGSH型锌指(). 然而，它的序列与任何已知功能的蛋白质或结构域都不同源。阐明丝裂原网的功能和结构对于揭示其生物活性、了解TZDs的药理学以及帮助设计更有效的抗糖尿病药物至关重要。在这里，我们通过结构表征表明，丝裂原网是一种以前未被识别的铁硫蛋白，表明它在电子传递中起作用。我们还定义了包含相同簇结合基序的七组蛋白质。
丝裂原网同源物的多序列比对。对齐的序列来自智人（1，NP_060934；2，NP_001008389），小家鼠（1，NP_598768；2，未显示），达尼奥雷里奥（1，NP_956899；2，NP_9506677），黑腹果蝇（NP_651684），秀丽隐杆线虫（NP_0010022387），以及拟南芥（NP_568764）。第一个序列是本研究中使用的mitoNEET。晶体结构中观察到的二级结构元素和预测的跨膜螺旋（TM）显示在顶部。所示为表面积埋深至少30Å的残留物2（●）和10Å2（○）由于二聚作用。星号表示铁配位配体。100%和70%保存的残留物分别用深绿色和浅绿色遮蔽。
结果
结构测定。
当表达于大肠杆菌; 然而，缺失假定的N末端跨膜螺旋的片段（残基32–108）显示出高溶解度。可溶性片段用于以下所有结构和生物化学研究，下文简称为丝裂原网。片段的表达严重依赖于最小M9培养基中铁离子的存在。此外，蛋白质溶液和晶体呈红色[支持信息（SI）图5A类]. 因此，我们怀疑mitoNEET是一种铁结合蛋白，并且我们将1.54Å时收集的x射线衍射数据处理为具有来自铁的异常信号。事实上，发现了显著的异常散射中心。使用单波长反常色散技术确定结构。电子密度图显示散射中心周围的菱形密度，这是[2Fe-2S]团簇的特征(SI图5B类). 该结构已改进为1.8英寸分辨率，并具有R（右）自由的19.3%的系数和R（右）16.4%的系数(SI表1). 整体坐标误差估计为≈0.11Å，这是基于R（右）自由的值。
总体结构。
晶体结构表明，丝裂原网是一个同二聚体，每个亚单位都与[2Fe-2S]簇结合(A类). 二聚体结构采用球状褶皱，类似37Å高的花瓶。结构的下半部或“主体”的直径≈35–38Å，上半部或”颈部”的直径约为≈20。[2Fe-2S]簇结合在身体的一个环形区域内，靠近颈部-身体边界。
人丝裂原网可溶性结构域的晶体结构。(A类)结构带状表示的十字眼立体视图。这两个单体亚基分别为绿色和紫色。[2Fe-2S]簇和配体残基表示为球和棒。铁和硫原子分别被染成橙色和黄色。二级结构元素和N和C末端被标记，素数表示紫色亚基。(B类)交织二聚体的拓扑图。半胱氨酸和组氨酸配体显示为橙色和蓝色斑点，[2Fe-2S]簇显示为红色菱形(C类)与紫色亚基的二聚化界面显示为表面表示，绿色亚基显示为带状。最保守的残基在紫色亚基中被染成黄色。图中还显示了膜的相对方向。(D类)分子表面最保守的残基显示为黄色斑块。
这两种单体结构几乎相同，可以在64个Cα对上叠加0.091Å的均方根偏差。每个单体包括三条β链（β1、β2和β3）、一条α螺旋（α1）和四个环（L1、L2、L3和L4），它们按L1-β1-L2-β2-L3-α1-L4-β3的顺序排列(B类). 连接股线β1和β2的L2环有一个短的310-螺旋线。身体部分会被两个N端跨膜螺旋连接到膜上，这两个螺旋在可溶碎片的结构中缺失(C类).
丝裂原网的结构不同于迄今为止已鉴定的其他铁硫蛋白。此外，没有结构同源物(Z轴>在DALI搜索中使用单体或二聚体结构时，可在当前蛋白质数据库中找到(8)这表明该构造代表了一个以前未被识别的褶皱。
二聚体形成。
单体亚基沿其全长相互结合，形成具有广泛界面的交织结构。颈部包括由两个三链分子间β-片形成的β-三明治(A类). 每个β片由来自一个亚基的链β1和来自另一个亚单位的链β2′和β3′组成（质数表示另一个子单位），它们按β1-β3′-β2′的顺序排列。因此，两个β1链在两个β-片之间交换。股线β1和β3′彼此平行，股线β2′和β3’反向平行。β-三明治包含一个疏水核心，该疏水核心包含来自两个亚基的保守残基Phe-60、Met-62、Leu-65、Ala-69、Tyr-71、Leu-101和Ile-103。在身体部位，来自一个亚单位的环L1和L3与来自另一个亚单元的环L4′和L3′相关。该缔合由大量分子间氢键和两个对称疏水核稳定，其中一个包含残基Ile-45、Ile-56、Trp-75、Phe-80和Val-98′。总的来说，广泛的二聚体界面涉及53%的结构残基，并埋藏了1988年溶剂可及的表面积2每个单体，约占单体总表面积的36%(). 二聚体界面的保守性表明所有丝裂原网同源物折叠成类似的二聚体结构(C类).
分子表面有保守残基的斑块(D类). 一个由Leu-102、Lys-55′和Val-57′残基组成的补丁位于亚单位连接处铁硫簇的开口附近。另一个由Glu-63和Asp-64组成的补丁位于尖端。这些暴露的、保守的区域可能是功能上重要的位点。
[2Fe-2S]绑定模块的结构。
在有丝分裂原网结构中，每个[2Fe-2S]簇都结合在环L3和螺旋α1的N末端的17个连续残基（残基71-87）的延伸内。多肽链转了一圈，将簇夹在17-aa拉伸的两端之间，形成一个紧密的节状结构。[2Fe-2S]团簇由位于同一平面上的两个铁原子（Fe1，Fe2）和两个桥接硫原子（S1，S2）组成，大部分被掩埋，其中Fe2朝向溶剂。环路L4部分屏蔽了仪表组的开口。
[2Fe-2S]团簇由三个半胱氨酸和一个组氨酸与Cys-72和Cys-74结合的埋藏Fe1原子配位，与Cys-83和His-87结合的暴露Fe2原子配位(A类). 铁硫簇通常由四个半胱氨酸结合，尽管非半胱氨酸残基，如组氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或主链酰胺偶尔用作配体(9). 在里斯克型簇中，Fe1由两个半胱氨酸配位，Fe2由两个组氨酸配位(10). 在mitoNEET中，Fe2由一个半胱氨酸和一个组氨酸不对称配位，据我们所知，这代表了以前未被识别的[2Fe-2S]簇的自然发生的配位模式，尽管Rieske型蛋白质已被成功设计成包含三个半胱酶和一个组氨酸配体(11). 组氨酸连接被认为可以产生Rieske型团簇独特的氧化还原和光谱特性，并耦合质子和电子传输(12–14). 丝裂原内的单一组氨酸连接如何影响铁-硫簇的性质，从而影响蛋白质的功能，还有待观察。
十字眼立体视图中[2Fe-2S]绑定模块的结构。(A类)模块的杆和球表示。主干键为绿色，核心残基侧链为粉红色，非核心残基的侧链为灰色。氮原子为蓝色，氧原子为红色，硫原子为黄色，铁原子为橙色。破折号代表氢键。(B类)非核心残留物与结构环境的相互作用。这两个单体亚基分别为绿色和紫色。
值得注意的是，mitoNEET中的所有四个[2Fe-2S]配体都包含在一个只有17个残基的小模块单元中。在其他[2Fe-2S]结合蛋白中，铁配体通常分布在一级序列的离散区域(12,15,16). 植物型和脊椎动物型[2Fe-2S]铁氧还蛋白具有一致的C-X簇结合序列4/5-C-X公司2-C…C，它有三个序列相近的半胱氨酸配体和一个序列分离的第四个配体（3+1模式）。Rieske蛋白中的簇结合序列显示2+2模式（C-X-H…C-X2-H） 含有两对分离的半胱氨酸和组氨酸残基。这些[2Fe-2S]结合区通常是较大结构的一部分，与丝裂原网的紧密簇结合模块不同。
Cys-3-His-1-配位[2Fe-2S]簇采用标准菱形几何结构，Fe1和Fe2相距2.75Å，Fe-S键的长度在2.20–2.23 \8491]范围内，与其他Cys-4-或Cys-2-His-2配位簇一样(SI表2). Fe1由硫原子S1、S2、Cys72Sγ和Cys74Sγ以接近理想的四面体排列配位，键角为101–116°。Cys72Sγ-Fe1-Cys74Sγ定义的平面几乎垂直于[2Fe-2S]团簇的平面。相反，由于半胱氨酸和组氨酸的不对称连接，Fe2的配位球表现出扭曲的四面体对称性。关于Cys72Sγ-Fe1-Cys74Sγ平面，His78Nδ-Fe2-Cys83Sγ平面围绕Fe1-Fe2矢量旋转约13°。在Cys-4-和Cys-2-His-2-配位[2Fe-2S]团簇中，四个配位原子（Sγ或Nδ）和两个铁原子几乎位于同一平面上。
连接铁的三个半胱氨酸Sγ原子和两个桥联无机硫原子中的每一个与主链酰胺基团形成一个或两个氢键(A类). 在其他铁硫蛋白质中，半胱氨酸i的Sγ原子通常与残基i+2的酰胺基团形成氢键(16). 这种氢结合模式也存在于丝裂原网的Cys-72、Cys-74和Cys-83中(A类).
CCCH-型[2Fe-2S]装订主题。
17个残基[2Fe-2S]结合基序可以在包括细菌、古菌和真核生物在内的多种生物的数百种蛋白质中找到()，共有序列为（hb）-C-X1-C-X公司2-（S/T）-X三-P-（hb）-C-D-X2-H、 其中hb代表疏水残基Leu、Ile、Met、Val、Phe、Tyr和Trp以及X中的一种n个表示任意类型的n个剩余的延伸。该图案之前被注释为CDGSH型锌指[SMART数据库登录号。表面处理00704(17)]. 根据丝裂原网结构，我们建议将一致序列重命名为CCCH-型[2Fe-2S]结合基序，以反映[2Fe-2S]簇的独特连接模式。
七组CCCH基序蛋白。17-残基[2Fe-2S]结合模体序列与普遍保守的核心残基以红色阴影对齐，而仅在单个组内保守的非核心残基则以蓝色阴影显示。每组的结构域排列以CCCH基序表示为洋红色方框。第7组具有可变域排列。每个序列都由其起源物种的名称表示。显示了起始残基和结束残基的数量，以及串联CCCH重复之间的省略残基数量。序列按排列顺序的登录号如下：NP_060934号,NP_001022387号,NP_651684号,NP_956677号、和NP_568764号第1组；NP_473158,XP_669761电话,XP_730809电话,AAF99457型、和XP_764182电话第2组；NP_393562号,ZP_01600028号,YP_658160、和NP_110689号第3组；NP_828371号,YP_956561,YP_586540型,YP_005939型、和兹p_00619216第4组；ZP_01083369号,ZP_01074254号,ZP_00837134号,ZP_01015104号、和ZP_01446837号第5组；EAW60525,NP_497419,ZP_01694071,ZP_01167744号、和NP_6101234号第6组；和YP_565248型,YP_516858型,NP_275341号,NP_105478号、和ZP_01452291号第7组。
该基序由九个保守的核心残基组成，它们之间的间距不变。人类mitoNEET的核心残基包括四个配体残基Cys-72、Cys-74、Cys-83和His-87，以及五个非配体残基Tyr-71、Ser-77、Pro-81、Phe-82和Asp-84。虽然配体残基在[2Fe-2S]簇合配位中的作用是显而易见的，但丝裂原网的结构表明，非配体残基极大地稳定了簇合结状结构(A类). 残基Ser-77和Asp-84是保守的，因为它们的侧链与主链原子起桥接作用。Ser77Oγ与Lys79N和Phe82O形成分叉氢键，Asp-84通过两个羧基氧原子与Lys78N和Ala86N同时相互作用。在一些CCCH基序序列中观察到的Ser-77的苏氨酸取代可能保留了羟基形成的氢键。残基Tyr-71、Pro-81和Phe-82形成一个小的疏水核心，它与β三明治的疏水核心相互作用。Pro-81也有助于形成转弯结构。这些结构上重要的核心残基的保存强烈表明，所有CCCH型序列都折叠成模块化[2Fe-2S]结合结构。
在丝裂原网结构中，大多数非核心残基向外投射到溶剂中或与周围结构接触。非核心残基Arg-73、Trp-75、Arg-76和Phe-80与回路L1、L4′和L3′接触(B类). Trp-75和Phe-80与Ile-45、Ile-56和Val-98′形成疏水核。Trp-75（Nε）的吲哚环也与Arg-73′O形成氢键。值得注意的是，残基Arg-73′（即来自其他亚单位，如B类)完全埋藏在二聚体界面，其胍基与Pro-100′O、Ile56O和埋藏水形成三个氢键，也与Cys72O和Pro81O相互作用。Arg-76与羰基氧原子相互作用(B类). 由于它们参与结构内的相互作用，这四个非核心残基在mitoNEET同源物中高度保守，而其他非核心残余物则暴露于溶剂中，保守度较低().
含有CCCH基序的蛋白质。
根据CCCH基序的数量和排列及其总体序列同源性，含有CCCH基序的蛋白质可分为七组(). 属于同一组的蛋白质在更大范围内共享序列同源性，并可能具有相关功能。除CCCH基序外，不同组的蛋白质没有显示出显著的序列同源性。
第1组包括后生动物和高等植物中存在的丝裂原网的近同源物(). 它们通常在脊椎动物中以两个拷贝的形式存在，在其他生物中以单个拷贝的形式出现。较长版本（蛋白质2)在两种脊椎动物中，推测的跨膜螺旋的上游约有30个残基延伸。有趣的是，发现较长的人类版本的蛋白质定位在内质网中(18). 其他生物体中的单个拷贝可能是长拷贝，例如在苍蝇中，也可能是短拷贝，如在蠕虫中。所有丝裂原网同源物都共享高度保守的可溶性结构域，但高等植物拟南芥和水稻中的同源物似乎缺乏跨膜螺旋。
一个单一的CCCH基序可以从几个蛋白质序列中识别出来顶复亚门包括马拉里亚-加塞疟原虫（第2组）、古菌（第3组）和细菌（第4组）。这个顶复亚门序列在非核心残基甚至基序外的区域与mitoNEET密切相关，但细菌和古细菌序列除了CCCH基序的核心残基外，与mitoNET没有显著同源性。
CCCH基序以两个拷贝的形式存在于大量序列中，这些序列可分为5、6和7组。在仅包含细菌序列的第5组中，串联重复序列的间隔约为20 aa个残基，后面是谷氨酸合成酶FMN结合域（GltS-FMN）。GltS-FMN结构域催化2-酮戊二酸转化为我-谷氨酸，需要来自非共价结合铁氧还蛋白或NAD（P）H的电子捐赠(19). 电子通过FMN辅因子和GltS-FMN域中的[3Fe-4S]簇转移到反应中间体。第5组蛋白质中GltS-FMN结构域之前的串联[2Fe-2S]簇可能参与相同的电子转移过程。有趣的是，真核生物和细菌生物具有短蛋白质（第6组），其仅包含与第5组中的蛋白质高度相似的串联重复序列，但不包含GltS-FMN结构域。
一些古生物和细菌序列（第7组）包含两个CCCH重复序列，它们以可变排列共轭于功能未知的PUF1271结构域。DUF1271结构域可以由两个CCCH重复序列侧翼或位于一个或两个重复序列的上游。DUF1271也以独立的单结构域蛋白质或与其他结构域相连的形式存在。还有一些含有CCCH的孤儿蛋白，由于示例太少，无法轻易分类。
总的来说，这些来自不同群体的CCCH基序序列共享核心残基，这些残基对形成模块化[2Fe-2S]结合结构很重要。群中的成员通常具有非核心残基的保守子集()，这可能反映了不同结构环境施加的包装约束。
讨论
在这项研究中，我们测定了丝裂原网可溶性结构域的晶体结构，并表明丝裂原网络是一种铁硫蛋白，而不是之前预测的锌指蛋白。[2Fe-2S]结合模块具有三个半胱氨酸和一个组氨酸的独特配位模式，以及仅包含17个连续残基的高度紧凑结构。铁-硫簇合物主要为[2Fe-2S]、[4Fe-4S]和[3Fe-4S]3种类型，是普遍存在的蛋白质辅因子，主要在电子转移以及其他多种过程中发挥作用，如底物结合、基因调节和氧/氮感应事件(9,20–22). 铁-硫团簇通过交替一个铁的氧化态和还原态一次转移一个电子。丝裂原网的紫外可见吸收光谱在氧化态和还原态发生可逆变化(SI图6)这与丝裂原网作为电子载体的作用是一致的。丝裂原网二聚体包含两个[2Fe-2S]团簇，间距约为12Å，原则上可以允许电子在团簇之间跳跃。两个团簇同时参与双电子转移过程也是可能的。
如绿色荧光蛋白融合的mitoNEET和MitoTracker的共定位所示，人类mitoNEET定位在线粒体中(SI图7). 线粒体中含有大量的铁硫蛋白，它们作为呼吸链的一部分或在各种氧化还原过程中传递电子。丝裂原网的特殊功能尚待研究。然而，我们的结果表明，丝裂原网可能参与了一种未知的电子传递途径。当前脂肪细胞分化为脂肪细胞时，丝裂原内皮素的表达水平显著增加(7). siRNA处理导致线粒体NEET缺失显著提高星形胶质细胞的乳酸生成(5). 这些研究表明，丝裂原网具有代谢作用。未来的挑战将是揭示涉及丝裂原内皮素的代谢途径，并揭示吡格列酮如何调节该途径。在建模效果中，我们观察到吡格列酮可以停靠在铁硫簇附近的线粒体表面的深沟中(SI图8); 这种相互作用可能会干扰丝裂原网与内源性底物的结合。然而，确切的结合模式和这种底物的存在还有待研究。
我们的结构还允许定义在七种不同的蛋白质组中发现的CCCH型[2Fe-2S]结合基序。识别这些蛋白质中可能存在的[2Fe-2S]簇将极大地促进其功能表征。
材料和方法
蛋白质表达和纯化。
人类mitoNEET基因（基因符号：ZCD1型)是从人类肝脏cDNA文库中PCR扩增的。将含有32–108残基的片段克隆到pET-28b载体（加州圣地亚哥诺瓦根）。该蛋白包含一个N末端、可切割凝血酶的六个His-tag，来自载体。蛋白质表达大肠杆菌如参考文献所述，BL21（DE3）细胞在37°C下自诱导。23.
细胞颗粒在缓冲液A（20 mM Tris·HCl，pH 7.9/5 mM咪唑/500 mM NaCl）中通过超声溶解。将澄清的上清液加载到用缓冲液a预平衡的Ni-NTA柱上。然后用5柱体积的缓冲液a和5柱体积含有30 mM咪唑的缓冲液B清洗柱，然后用凝血酶裂解缓冲液（50 mM Tris·HCl，pH 7.5/150 mM NaCl/2.5 mM CaCl）重新平衡2). 室温下，His-tag在柱上凝血酶裂解16 h后释放出丝裂原内ET可溶性结构域，并用含有30 mM咪唑的缓冲液A洗脱。通过凝胶过滤色谱（Sephadex G-50）在20 mM Tris·HCl（pH 8.0）中进一步纯化蛋白质，并浓缩至20 mg/ml。
结晶和结构测定。
晶体是在20°C下通过吊滴蒸汽扩散法生长的。在两种结晶条件下获得的两个同构晶体用于结构测定。通过混合2μl蛋白质溶液（20 mg/ml，在20 mM Tris·HCl缓冲液中，pH 8.0）和2μl含有100 mM Tris·HCl（pH 7.4）、18%PEG 3350和200 mM碘化钾的微孔溶液来生长晶体1。晶体2在100 mM Tris·HCl（pH 7.2）、30%PEG 2000和100 mM NaCl中生长。为了进行低温保护，将甘油以5%的增量添加到结晶液滴中，直至15%（vol/vol），并且在每个步骤中使液滴平衡5分钟。然后将晶体在液氮中快速冷冻直至使用。使用日本东京的Rigaku机器在1.5418Å的波长下采集晶体1的衍射数据，分辨率为2.2 \8491；在日本SPring-8光束线BL41XU，在1.0 \8491]的波长下，采集晶体2的衍射数据。
使用Denzo和Scalepack对衍射数据进行处理和缩放(24). 两种晶体同构，属于原始正交空间群P（P）212121(一= 65.971 Å,b条= 43.838 Å,c=59.139Å）。不对称单元包含一个二聚体分子。根据2.2Å的数据，利用铁的固有异常信号，采用单波长异常色散法确定了结构。使用Shelxd程序确定了四个重原子位置(25)并用于计算在CNS1.1中通过密度修改进一步改善的初始相(26). 得到的电子密度图质量很好。模型是在库特建造的(27). 使用20个TLS组的CNS1.1或REFMAC进行精炼(28). 根据1.8Å数据改进的最终模型包括一个亚基的残基43–106、另一个亚单位的残基38–106、两个[2Fe-2S]簇和100个水分子。后一亚基的结构化N末端尾部（残基38-42）参与晶体堆积相互作用。在拉马钱德兰阴谋中(29)，87.8%的非甘氨酸和非脯氨酸残基位于最有利的区域，12.2%的这些残基位于其他允许的区域。
