美国国家科学院院刊。2007年9月11日；104(37): 14849–14854.
肾脏中细小白蛋白的表达对NaCl处理和利尿剂反应至关重要
,* ,† ,‡ ,‡ ,* ,* ,§ ,¶ ,‖ ,‖和*,**
击败施瓦勒
‡瑞士弗里堡CH-1700弗里堡大学解剖科；
约翰内斯·洛芬
‡瑞士弗里堡CH-1700弗里堡大学解剖科；
雷诺德·博文斯
§比利时布鲁塞尔自由大学医学院细胞和分子生理实验室，B-1070；和
Jean-Pierre Devogelaer公司
¶比利时布鲁塞尔B-1200天主教鲁汶大学医学院风湿病学；
Joost G.Hoenderop（乔斯特·G.霍恩多普）
‖荷兰奈梅亨Radboud大学生理学系，邮编6500 HC
雷内·宾德尔斯
‖荷兰奈梅亨Radboud大学生理学系，邮编6500 HC
肾脏科，
†生理学，以及
¶比利时布鲁塞尔B-1200天主教鲁汶大学医学院风湿病学；
‡瑞士弗里堡CH-1700弗里堡大学解剖科；
§比利时布鲁塞尔自由大学医学院细胞和分子生理实验室，B-1070；和
‖荷兰奈梅亨Radboud大学生理学系，邮编6500 HC
由北卡罗来纳州达勒姆杜克大学Peter C.Agre编辑，于2007年7月26日批准
作者贡献：P.G.和O.D.设计的研究；H.B.、P.G.、B.S.、J.L.、H.D.、E.R.-M.、R.B.、J.G.H.、R.J.B.和O.D.进行研究；P.G.、B.S.、J.L.、E.R.-M.、R.B.、J.-P.D.、J.G.H.和R.J.B.贡献了新的试剂/分析工具；H.B.、P.G.、B.S.、J.L.、H.D.、E.R.-M.、R.B.、J.-P.D.、J.G.H.、R.J.B.和O.D.分析数据；H.B.、P.G.、B.S.、J.L.、H.D.、R.B.、J.-P.D.、J.G.H.、R.J.B.和O.D.撰写了论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
远端曲小管（DCT）在肾脏对NaCl的再吸收中起着重要作用，这一过程可被噻嗪类利尿剂抑制。帕伐布明（PV），一种钙2+-在肌纤维和神经元中起作用的结合蛋白在DCT中选择性表达，其作用尚不清楚。因此，我们研究了PV基因敲除小鼠的肾脏表型(Pvalb公司−/−)与野生型相比(Pvalb公司+/+)室友。PV与噻嗪敏感钠共定位+-氯离子−DCT早期的共同运输者（NCC）。这个Pvalb公司−/−小鼠在基线时表现出利尿和尿钾增多，醛固酮水平升高，锂清除率降低。急性速尿给药增加了利尿和尿钠/尿钾，但令人惊讶的是，在Pvalb公司−/−老鼠。氯化钠补充Pvalb公司−/−小鼠在基线检查和速尿后尿钙增加。这个Pvalb公司−/−小鼠对氢氯噻嗪无明显利尿反应，但低钙尿加重Pvalb公司−/−肾脏无超微结构和凋亡改变。PV缺乏小鼠的Ca呈阳性2+平衡并增加骨密度。对小鼠DCT细胞的研究表明，内源性NCC表达是Ca2+-依赖性和可由PV表达水平调节。这些结果表明，PV通过调节细胞内钙来调节NCC的表达2+DCT细胞对ATP的反应信号。它们还提供了对Ca的见解2+-噻嗪类药物的保留作用和远端小管病变的病理生理学。
关键词：远端曲小管、肾脏、盐丢失性肾病、氯化钠协同转运
Parvalbumin（PV）属于EF-hand Ca超家族2+-在多种细胞过程中发挥作用的结合蛋白，包括基因转录、离子转运、蛋白质磷酸化和酶活性(1). 这些蛋白质具有高度保守的螺旋-环-螺旋基序，结合钙2+具有高亲和力的离子，导致构象变化。这些钙的构象可塑性和细胞特异性表达2+传感器或缓冲蛋白有助于钙的多功能性2+信号(2). PV是一种109-aa细胞溶质蛋白，含有一对功能性EF-hand基序，形成一个稳定的单元，结合两个Ca2+离子(三). 这个Ca2+缓冲区在数量有限的脊椎动物组织中表达，包括快速收缩/放松的骨骼肌纤维和大脑中的GABA神经元(4). PV淘汰赛的产生(Pvalb公司−/−)小鼠证实了PV在肌肉和大脑中发挥的重要作用(5). The fast muscles ofPvalb公司−/−小鼠的抽搐松弛率下降(5)表明PV促进Ca2+肌原纤维向肌浆网的扩散(6). 大脑中缺乏PV会导致短期突触可塑性和网络特性的改变，从而增加癫痫发作的易感性(7). 虽然没有人类疾病与PVALB公司22q12-q13.1上的基因，在患有精神分裂症和认知功能受损的个体中，含有PV的神经元中GABA合成减少(8).
除了肌纤维和神经元外，PV在大鼠和小鼠肾脏中位于远端卷曲小管（DCT）的上皮细胞中表达(9,10). DCT再吸收≈Na过滤负荷的5%+，一个涉及Na的过程+-氯离子−共转运蛋白（NCC）和ClC-Kb氯离子通道，分别位于细胞的顶膜和基底外侧膜。噻嗪类利尿剂可能会竞争氯离子，从而抑制氯化钠的再吸收−顶端NCC结合位点(11). DCT在活性钙中也起着关键作用2+远端肾单位通过涉及钙被动进入的跨细胞途径重新吸收2+通过顶端通道TRPV5，细胞溶质扩散到Ca2+-通过Na结合钙结合蛋白（CBs；CB-D28k和CB-D9k）和活性基底外侧挤出+-钙2+交换器1和质膜钙2+-ATP酶1b（PMCA1b）(12). 此外，DCT参与镁的最终再吸收2+通过顶端通道TRPM6和基底外侧主动转运(12). PV在DCT早期的选择性分布及其独特的Ca2+缓冲特性提出了一个问题，即它是否在肾单位段的运输系统中发挥作用。
在本研究中，我们使用了Pvalb公司−/−研究PV对基础条件下和急性利尿剂给药和氯化钠补充后肾脏处理氯化钠和二价阳离子的影响。PV缺乏小鼠的特征是在DCT早期NCC表达减少，导致离散的NaCl丢失表型，利尿剂反应受损，Ca阳性2+保持平衡，增加骨矿物质含量和抵抗力。在小鼠DCT（mDCT）细胞中进一步研究了PV和NCC之间的功能关系，揭示了PV调节Ca2+ATP诱导的瞬变并调节NCC的内源性表达。
结果
PV分布在小鼠和人类的早期DCT中。
PV的细胞质染色在位于大脑皮层外的小管亚群中检测到Pvalb公司+/+肾脏(A类). 所有PV阳性片段均显示顶端NCC染色，从而证实了NCC在DCT中的分布。然而，PV仅限于DCT的早期，而NCC沿整个DCT表达，CB-D28k在DCT的远端和连接小管中更为丰富(B类). 肾脏结构和组织学异常并未反映PV的缺失[支持信息（SI）图6]. 在人类肾脏中也检测到PV( C类和D类)位于与尿调节蛋白共分布的早期DCT内(E类).
PV在小鼠和人肾脏中的表达和分布。(A类)小鼠肾皮质切片的双重免疫荧光染色显示PV和NCC以及PV和CB-D28k的免疫阳性染色。注意PV（胞质）和NCC（顶端）的不同表达模式。(B类)尿调节蛋白（UMOD）、PV、NCC、CB-D28k和AQP2沿肾单位的分布。TAL，Henle环的厚上升翼；DCT1，DCT的早期部分；DCT2，DCT晚期；CNT，连接管；CCD，皮质收集管。(C类)RT-PCR检测小鼠和人类肌肉和肾脏样本中的PV（每条车道20μl PCR产品）。(D类)小鼠肌肉和人肾脏细胞溶质提取物中PV（11 kDa）的免疫印迹。(E类)在人类肾脏中，PV在TAL后早期DCT（*）与UMOD共定位。（比例尺：100μm，A左上; 20微米，A右上; 和50μm，A下部和E类.)
Pvalb公司−/−小鼠出现多尿、多饮和尿失禁增加。
在基线，Pvalb公司−/−小鼠尿钾增多，锂清除率降低，醛固酮尿增多，钙尿减少，而镁尿和磷尿没有改变(). 两种基因型的体重、红细胞压积、肾功能、酸碱状态、血浆渗透压和电解质值相似。这个Pvalb公司−/−小鼠出现明显的多尿，尿液稀释，液体摄入增加(Pvalb公司−/−：8.0±1 vs。Pvalb公司+/+：4.1±0.3毫升/24小时，n个=6对，P（P）= 0.002). 缺水诱导了类似的抗利尿作用(SI图7)排除了有缺陷的尿浓缩机制。这个Pvalb公司−/−小鼠血浆1,25（OH）水平较高2D类三水平，有降低电离钙的趋势2+水平().
表1。
| 测量 | Pvalb公司+/+ | Pvalb公司−/− | P（P） |
|---|
| 血液/血浆 | | | |
| 渗透压，mOsm/kg H2O（运行） | 323 ± 5 | 324 ± 3 | 0.98 |
| 红细胞压积，% | 46 ± 1.7 | 43 ± 1.4 | 0.27 |
| 肌酐，mg/dl | 0.25 ± 0.02 | 0.28 ± 0.02 | 0.26 |
| 尿素，mg/dl | 24 ± 2 | 27 ± 2 | 0.22 |
| 纳+，毫微米 | 141 ± 1 | 142 ± 0.4 | 0.42 |
| K（K）+，毫摩尔 | 6.1 ± 0.2 | 5.3 ± 0.4 | 0.18 |
| 镁2+，毫摩尔 | 2.5 ± 0.2 | 2.8 ± 0.2 | 0.32 |
| tCO公司2，毫微米 | 24 ± 1 | 22 ± 0.4 | 0.16 |
| 电离钙2+，毫微米 | 1.28 ± 0.02 | 1.23 ± 0.02 | 0.11 |
| 1,25（OH）2D类三，微微克/毫升 | 112 ± 9 | 177 ± 13* | 0.001 |
| 尿液 | | | |
| 利尿，μl/min·g体重 | 0.03 ± 0.01 | 0.05 ± 0.01* | 0.03 |
| 渗透压，mOsm/kg H2O（运行） | 3861 ± 384 | 2610 ± 226* | 0.02 |
| 纳+/肌酐，nmol/ng肌酐 | 0.36 ± 0.03 | 0.35 ± 0.03 | 0.85 |
| K（K）+/肌酐，nmol/ng肌酐 | 0.35 ± 0.01 | 0.43 ± 0.03* | 0.045 |
| 钙2+/肌酐，ng/ng肌酐 | 0.70 ± 0.10 | 0.51 ± 0.12 | 0.25 |
| 镁2+/肌酐，ng/ng肌酐 | 0.74 ± 0.05 | 0.76 ± 0.06 | 0.80 |
| 分数排泄，PO42− | 67 ± 14 | 72 ± 11 | 0.78 |
| 锂清除率，μl/min | 19.1 ± 1.60 | 12.5 ± 1.32* | 0.01 |
| 醛固酮，μmol/min | 6.5 ± 1.6 | 18 ± 9.9* | 0.02 |
对速尿和氯化钠补充的反应受损Pvalb公司−/−老鼠。
注射速尿Pvalb公司小鼠增加NaCl和Ca2+向DCT交付并测试PV在该细分市场中的作用(). 两组均观察到预期的利尿反应(A类)同时尿钠和尿钾增多( B类和C类). 令人惊讶的是，如Pvalb公司+/+老鼠，在Pvalb公司−/−老鼠(D类). 这个Pvalb公司−/−然后对小鼠进行氯化钠补充( E类和F类)研究基线时较低的钙尿和呋塞米诱导的高钙尿的缺乏是否可以反映体积消耗和补偿性NaCl和Ca2+近端小管（PT）的重吸收，如低锂清除率所示。这个Pvalb公司−/−小鼠对氯化钠溶液（与普通自来水相比，液体摄入量增加82%）表现出惊人的亲和力，这在Pvalb公司+/+老鼠(E类). 短期和长期补充氯化钠可显著增加患者的利尿、尿钠、钙尿和镁尿Pvalb公司−/−老鼠(SI表2). 速尿用于氯化钠补充Pvalb公司−/−小鼠导致预期的尿钙增加（+195%；F类)但仍低于Pvalb公司+/+老鼠。
速尿试验和氯化钠补充Pvalb公司老鼠。(A–D)速尿注射导致利尿增加(A类)、尿钠(B类)和尿钾(C类)，但没有高钙尿症(D类)在Pvalb公司−/−老鼠。*，P（P）<0.05与。Pvalb公司+/+基线；†，P（P）<0.05与。Pvalb公司−/−基线；，P（P）<0.05与。Pvalb公司+/+速尿。(E类)Pvalb公司−/−与对照组相比，小鼠在48小时的补充期间对氯化钠溶液表现出更高的亲和力Pvalb公司−/−老鼠喝自来水。在Pvalb公司+/+老鼠。(F类)暴露于Pvalb公司−/−小鼠口服氯化钠会增加基线时的钙尿，并导致预期的速尿诱导的高钙尿。*，P（P）<0.05与自来水（TW）；†，P（P）与基线相比<0.05(n个每组6个）。
噻嗪类药物的不良反应和严重的低钙尿Pvalb公司−/−老鼠。
注射单剂量氢氯噻嗪（HCTZ）直接检测DCT(). 这个Pvalb公司+/+小鼠表现出预期的利尿反应，有尿钠和尿钙减少的趋势( A–D). 引人注目的是Pvalb公司−/−小鼠无利尿反应(A类)与明显的低钙尿症形成对比(D类). HCTZ对尿钠排泄的时间依赖性影响+和钙2+已被调查( E类和F类和SI表3). 在Pvalb公司+/+小鼠，Na+在HCTZ后的前6小时内，排泄量显著增加，而钙尿无变化。在接下来的6小时内，观察到尿钠和尿钙显著减少。相反，Pvalb公司−/−小鼠在最初6小时内已经出现明显的低钙尿症，但没有明显的钠尿。在接下来的6小时内，低钙尿症加重，同时尿钠明显减少。
对噻嗪的反应Pvalb公司老鼠。(A–D)利尿症(A类)、尿钠(B类)，尿钾(C类)和钙尿(D类)六对Pvalb公司显示基线和HCTZ后的小鼠。这个Pvalb公司−/−小鼠在HCTZ后无明显利尿反应，但尿钙不足加重，P（P）<0.05与。Pvalb公司+/+基线；†，P（P）<0.05与。Pvalb公司−/−基线；，P（P）<0.05与。Pvalb公司+/+速尿。(E类和F类)Na的时间进程+(E类)和钙2+(F类)单次注射HCTZ后6和12小时的排泄(n个=9对）。在Pvalb公司+/+小鼠，Na+在最初的6小时内，排泄量显著增加，而尿钙没有变化。在接下来的6小时里，尿钙显著降低，同时尿钠也减少Pvalb公司−/−小鼠，在头6小时内检测到明显的低钙尿，尿钠无变化。在接下来的6小时内，低钙尿加重，同时尿钠减少。†，P（P）<0.05与。Pvalb公司+/+基线；*，P（P）<0.05与。Pvalb公司−/−基线。
综上所述Pvalb公司−/−小鼠在基线检查时以及对loop和噻嗪类利尿剂的反应提示DCT中存在分子缺陷，可诱导多种肾小管代偿机制。
PV的缺失降低了DCT中NCC的表达。
研究导致Pvalb公司−/−我们分析了参与远端肾小管转运的基因在小鼠肾脏的表达(A类). 编码NCC的mRNA减少了3倍，WNK4和肾特异性WNK1减少了2倍Pvalb公司−/−肾脏。相反，肾素和神经元一氧化氮合酶（nNOS）的mRNA水平在Pvalb公司−/−肾脏，而钠+-K（K）+-ATP酶、TRPV5、CB-D28k、PMCA1b、Na+-钙2+交换器1和ClC-Kb水平保持不变。免疫印迹证实NCC在Pvalb公司−/−肾脏(B类)与之相比，染色强度较弱，根尖募集较低Pvalb公司+/+老鼠(C类). 剩下的少数显示顶端NCC染色的剖面图对CB-D28k呈强阳性，表明它们属于DCT的远端，不表达PV体内（未显示数据）。大剂量噻嗪治疗与DCT上皮萎缩和大量凋亡细胞死亡有关(13). 然而，EM分析并没有显示DCT细胞在Pvalb公司−/−小鼠和阴性TUNEL和聚（ADP-核糖）聚合酶裂解试验排除了细胞凋亡增加(SI图8).
NCC表达减少Pvalb公司−/−老鼠。(A类)靶mRNA的定量（实时PCR）Pvalb公司−/−肾脏，表示为Pvalb公司+/+肾脏(n个=4对）。NCC、WNK4和肾特异性WNK1显著下调，nNOS和肾素上调(P（P）=0.14）英寸Pvalb公司−/−肾脏*，P（P）<0.05与。Pvalb公司+/+. (B类)提取物中NCC的免疫印迹Pvalb公司肾脏。对总肾匀浆的连续稀释液进行SDS/PAGE分析，并与抗NCC抗体孵育。A≈2倍NCC表达减少在Pvalb公司−/−肾脏。(C类)NCC免疫染色。与在Pvalb公司+/+小鼠的DCT中检测到NCC的较弱且主要是细胞内染色Pvalb公司−/−老鼠。（比例尺：50μm）
Pvalb公司−/−小鼠显示骨骼修改。
观察到与噻嗪治疗相关的骨密度增加(14)NCC缺乏小鼠和Gitelman综合征（GS）患者(15). 因此，我们研究了Pvalb中低钙尿症和NCC表达减少−/−小鼠同样与骨表型相关。详细的计算机断层扫描分析显示小梁矿物质含量和肋骨周长显著增加，胫骨近端的机械阻力（轴向惯性矩）增加Pvalb公司−/−老鼠(SI图9和SI表4).
PV和Ca2+信号调节mDCT细胞中NCC的表达。
研究了PV调节mDCT细胞NCC表达的机制(16,17)内生表达PV和NCC(). 我们用不同的siRNA转染细胞以对抗PV，结果表明，PV的敲低导致NCC的表达显著降低(A类). 相反，在稳定转染PV的不同克隆中观察到NCC表达的强烈而特异的诱导(B类). 因为DCT细胞对P2受体介导的嘌呤能信号敏感(18)，我们测试了PV是否可以调节ATP诱导的钙2+瞬态和NCC表达。通过RT-PCR证实P2X和P2Y2受体的表达（数据未显示），我们表明10μM ATP诱导Ca2+mDCT细胞中的瞬态(C类). 在稳定转染PV的细胞和暴露于渗透性钙的细胞中，瞬变显著减少2+螯合剂EGTA-AM。同时，我们观察到在用EGTA-AM孵育的细胞中，NCC的表达被诱导了2倍，而ATP的刺激降低了NCC的表现(D类). 在用EGTA-AM预孵育的细胞中未观察到后一种效应，表明钙2+瞬变作用于NCC表达。在这些条件下，PV和PMCA1b的表达没有变化。
PV和Ca的作用2+mDCT细胞中的信号传导。(A类)siRNA-处理的mDCT细胞的特性。PV-siRNA处理的细胞显示PV和NCC的表达显著降低，而PMCA1b没有变化。PCR显示，未处理的细胞和用对照siRNA处理的细胞清楚地表达PV(插入)PMCA1b和NCC表达无明显变化。三种不同的siRNAs获得了类似的结果。*，P（P）与对照siRNA相比<0.05(B类)稳定转染PV的细胞中NCC的表达。与模拟转染细胞相比，在三个过度表达PV的不同克隆（C1–C3）中，NCC的表达水平显著增加。*，P（P）<0.05与模拟。(插入)免疫印迹分析（抗GFP抗体）显示PV-GFP蛋白在稳定转染的细胞中，但在WT和对照转染的细胞中没有。(C类)用10μM ATP刺激mDCT细胞诱导Ca释放2+（否[Ca2+]0,0.5 mM EGTA）。ATP诱导的[Ca2+]我在10μM EGTA-AM存在下预孵育6 h的过度表达PV或mDCT的细胞中，瞬态减少(D类)NCC的表达为Ca2+-依赖。用10μM EGTA-AM孵育6 h的细胞显示NCC表达增加。用10μM ATP重复刺激可诱导NCC表达降低2倍；当细胞与EGTA-AM预孵育时，效果消失，P（P）与对照组相比<0.05。
讨论
我们的研究表明PV对肾脏NaCl和Ca至关重要2+通过调节钙离子对小鼠利尿剂的处理和反应2+ATP诱导的瞬变和调节DCT细胞内NCC的内源性表达。当考虑DCT的作用、利尿剂的作用和远端小管病变的病理生理学时，这些结果是相关的。
因为PV在肾脏中的分布一直存在争议(10,19)，我们确认PV仅限于早期DCT，在早期DCT中与NCC共存。PV的缺失导致了一个离散但一致的表型。在基线，Pvalb公司−/−小鼠出现多尿，可能是由多饮引起的，因为尿浓缩能力没有改变。其内源性锂清除率降低，反映出钠的增加+PT中的再吸收(20)醛固酮水平升高，尿钾增多，nNOS和肾素表达增加，提示容量减少。这个Pvalb公司−/−小鼠的体重、红细胞压积和血浆电解质水平与Pvalb公司+/+小鼠，表明代偿机制有效。出乎意料的是Pvalb公司−/−使用速尿的小鼠没有导致高钙尿，表明利钠素和利尿钙反应分离。因为低血容量会触发钠的代偿性PT重吸收+和钙2+，我们推测细胞外体积耗竭可能在Ca改变中发挥作用2+应对速尿的处理。事实上，氯化钠补充了Pvalb公司−/−小鼠的基线钙尿增加（然而，其仍然低于Pvalb公司+/+老鼠；看见)这些数据表明细胞外容量状态与环路利尿剂的作用之间存在密切关系，肾小管对钠的处理反映了远端和近端肾单位之间的相互作用+和钙2+.
分析Pvalb公司−/−小鼠获得了关于噻嗪类药物反应的信息。HCTZ的管理Pvalb公司−/−小鼠表现出两个显著特征：缺乏利尿反应和显著加重的低钙作用。利尿反应受损可能反映了DCT中NCC表达的降低（见)钠的代偿性再吸收+PT和收集管中（醛固酮诱导）。事实上，HCTZ诱发了严重的低钙尿，但不影响尿钠排泄，这一点尤其相关。NCC-null小鼠的研究(20)以及大剂量HCTZ治疗的大鼠(21)证明PT-passive Ca增强2+转运有助于噻嗪诱导的低钙尿症。负的锂清除率（以及较高的nNOS、肾素和醛固酮水平，提示体积收缩）表明后一种机制可能在Pvalb公司−/−老鼠。然而，我们的数据表明，DCT内的影响也很重要。首先，时间进程分析表明Pvalb公司−/−小鼠，HCTZ诱导早期低钙尿，但不影响钠尿。第二，当Pvalb公司−/−小鼠盐重吸收，尿钙/肌酸比仍低于野生型小鼠（≈1.3）。这些结果表明，噻嗪诱导的低钙尿症可能在没有细胞外体积收缩的情况下发生，这与低剂量噻嗪慢性治疗的小鼠模型一致(22). 几种具有增强PT-passive Ca的模型2+重吸收的特征是DCT的结构严重受损和/或参与远端Ca的分子表达减少2+运输(20,21,23). 相比之下Pvalb公司−/−小鼠有一个完整的DCT，这可能是由于NCC的残留表达和远端钙相关分子的表达引起的2+运输量不变，甚至有所增加（CB-D9k）（英国统计局，未公布数据）。无论如何，Ca不需要PV2+重吸收：低钙尿症与血浆Ca不变的共存2+钙指示水平2+在中积累Pvalb公司−/−据报道，NCC缺陷小鼠和GS患者的骨密度增加(15).
虽然Pvalb公司−/−小鼠与NCC缺乏小鼠有一些相似之处(23,24)，不同菌株之间存在差异。这个Pvalb公司−/−小鼠在基线时出现多尿和多食，可能与尿钾增多和低钾血症的趋势有关。由于PV分布在大脑中，并且Pvalb公司−/−小鼠表现出微妙的运动表型(25). NCC-null小鼠对K无干扰+基线时的体内平衡，但暴露于低钾时出现不适当的尿钾、低钾血症、多尿和多食症+饮食(26). 这个Pvalb公司−/−小鼠在没有特异性激发的情况下没有低镁血症，这与DCT缺乏结构变化一致。相比之下，NCC基因敲除小鼠的肾脏中含有镁2+基线时的消瘦和低镁血症，可能是由于DCT的严重损伤导致TRPM6表达细胞的丢失所致(23,24). 遗传背景对NCC-null表型很重要(23,24,26)也可能在菌株之间的差异中起作用。
肾脏PV的缺乏与NCC的显著下调有关，在没有结构改变或凋亡的情况下，大多数DCT的心尖靶向性降低。剩下的少数显示顶端NCC的小管轮廓对CB-D28k呈强阳性，表明它们位于不表达PV的DCT远端体内WNK4和肾特异性WNK1的mRNA水平也降低，这两种丝氨酸/苏氨酸激酶相互作用控制DCT中的NCC活性(27,28). WNK4和WNK1的表达降低可能构成一种代偿机制(29)抵消NCC在Pvalb公司−/−老鼠。
在mDCT细胞中研究了PV和NCC之间的潜在联系。各种siRNAs对PV的敲低导致内源性NCC的表达显著降低，证实了PV和NCC联系机制的细胞特异性。在神经元和骨骼肌细胞中，PV充当细胞溶质Ca2+影响Ca形状和持续时间的缓冲液2+瞬态(30,31). 这种瞬变在生理上与包括转运体在内的几个基因的转录调控有关(32,33). PV在早期DCT中的分布以及DCT细胞对嘌呤能信号敏感的事实(18)导致我们发现ATP诱导的钙2+mDCT细胞中的瞬态。这种ATP诱导的Ca2+信号受PV调节并调节NCC的内源性表达。这些结果与早期的研究一致，研究表明ATP增加细胞内钙2+浓度（[Ca2+]我)并抑制Na+通过管腔P2Y2受体在远端肾单位的吸收(34). 需要进一步研究来阐明钙的振幅和/或持续时间变化之间的联系2+下游效应器上的信号，如DCT中的激酶和转录因子。钙下调基因2+瞬态已在拟南芥，但机制尚未确定(35,36).
根据在小鼠和mDCT细胞中获得的证据，很容易表明PV可能在影响远端小管的人类疾病中发挥作用。The phenotype ofPvalb公司−/−小鼠与GS中观察到的小鼠相似，GS是一种常染色体隐性肾小管病，由SLC12A3型NCC基因编码(37). GS是一种典型的轻度盐缺乏症，与继发性醛固酮增多症、低尿钙症和高骨密度有关(38). 100多个突变SLC12A3型虽然高达40%的GS患者被发现只携带一个突变，但已被确认。GS的表型高度异质，增加了修饰基因的可能性(39). 因此PVALB公司可能涉及SLC12A3型-GS阴性或类似小管病变或参与表型变异的患者。PV的遗传或获得性变异也可能在DCT的NaCl处理和个体对噻嗪类药物的反应中发挥作用。
方法
动物研究。
实验是在年龄和性别相匹配的情况下进行的Pvalb公司同床共枕，背景为C57BL/6J×Sv129(5,6). 麻醉后采集血样。内源性锂清除率被用作PT-Na的反向测量+再吸收(20). 在基线检查时和注射速尿或HCTZ（10 mg/kg，皮下注射）后获得参数。补充氯化钠的效果在Pvalb公司−/−小鼠接受自来水或0.9%NaCl/0.1%KCl的饮用水48小时或2周。所有方案均符合国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》，并经当地伦理委员会批准。
分析程序。
血浆和尿液参数使用Synchron CX5分析仪（加利福尼亚州Fullerton的Beckman Coulter）、i-STAT分析仪（比利时Ottignies的Abbott Diagnostics）、渗透压计（马萨诸塞州Needham Heights的Fiske）或火焰光度计（视情况而定）进行测量。血浆1,25（OH）2维生素D三（比利时根特的BARC）和尿液醛固酮（比利时亨贝克的DPC）通过放射免疫分析法测定。
RT-PCR和实时定量PCR。
样品在三唑中均质。总RNA用DNase I处理，并用SuperScript II Rnase H（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行反转录。引物列于SI表5用铂进行RT-PCR检测塔克DNA聚合酶（Invitrogen）32个周期，PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上可见。使用iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA）进行实时定量PCR分析，一式两份(40). PCR条件为94°C持续3分钟，然后在95°C、61°C和72°C分别进行40次30 s、30 s和1 min的循环。靶基因/GAPDH mRNA比率的相对变化由以下公式确定：2ΔΔct(40).
抗体。
使用了抗PV抗体（加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术）、NCC抗体（俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学D.H.Ellison的礼物）、AQP2抗体（以色列耶路撒冷阿洛蒙）、尿调节蛋白抗体（生物设计国际，萨科，ME）、CB-D28k抗体（瑞士贝林佐纳州斯旺特）和GFP抗体（荷兰莱斯登州韦斯特堡）。
免疫印迹分析。
如前所述进行膜和胞浆提取及免疫印迹(40). 匀浆以1000×克在4°C下离心15分钟，所得上清液以100000×克在4°C下保持60分钟。以牛血清白蛋白（BSA）为标准物，采用双钦酸法测定蛋白质浓度。
免疫染色。
肾脏样品固定在4%甲醛中。六微米石蜡切片在0.3%H中连续培养2O（运行）2、10%正常血清、在含有2%BSA的PBS中稀释的一级抗体、生物素化二级抗体、亲和素-生物素过氧化物酶、氨乙基咔唑或德克萨斯红结合和FITC-结合亲和素（加利福尼亚州伯灵盖姆向量实验室）。切片在DMR显微镜和DC300数码相机（莱卡，Heerbrugg，瑞士）下观察。
骨骼分析。
使用高分辨率扫描仪（pQCT Research XCT-SA+；Norland-Stratec，Pforzheim，Germany）分析麻醉后胫骨的几何和密度测量参数Pvalb公司小鼠（参考。41和SI文本).
人类肾脏样本。
如前所述，准备用于移植的人肾脏样本用于RNA和蛋白质提取以及免疫组织化学。这些人体样本的使用得到了当地道德审查委员会的批准。
细胞培养。
永生化mDCT细胞由P.A.Friedman（宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院）提供。这些细胞以前被描述为噻嗪敏感钠的模型+和钙2+DCT中发生的传输(16,17). 细胞生长在DMEM/Ham的F-12培养基（Lonza，Verviers，Belgium）中，补充有5%的FCS（Lonsa），2 mM我-谷氨酰胺（Invitrogen）和青霉素/链霉素混合物，在95%空气-5%CO的湿化环境中237°C时。使用细胞传代20-35。用20 nM双链沉默剂siRNA（比利时伦尼克安比昂）和Lipofectamine 2000（Invitrogen）导入mDCT细胞，进行PV的敲除。转染48小时后提取RNA。将小鼠PV序列克隆到编码GFP的pAcGFP1-C In-Fusion Ready载体（荷兰莱斯登韦斯特堡）中，并使用FuGENE 6试剂（印第安纳波利斯罗氏）进行转染，获得稳定转染PV的mDCT细胞。在适当的情况下，用EGTA-AM（10μM）处理mDCT细胞6小时，4小时后用（不含）EGTA-AM，每小时用ATP刺激细胞6分钟，持续6小时。
[钙2+]我测量。
胞浆游离钙2+（[钙2+]我)如前所述，使用FURA2-AM测量单个mDCT细胞中的浓度（参考。42和SI文本).
数据分析。
数据为平均值±SEM。统计比较由双尾Student’st吨测试（Prism软件；GraphPad，加利福尼亚州圣地亚哥）。
致谢
我们感谢J.-P.Cosyns、D.Eladari、P.A.Friedman、B.Kaissling、P.Meneton和D.Prié的有益讨论和材料，感谢V.Beaujean、M.Carrel、Y.Cnops、D.Dienst、H.Sidelmann、M.Van Schoor和L.Wenderickx的出色技术援助。该研究得到了比利时机构Fonds National de la Recherche Scientifique和Fonds de la Rescherche科学医学、协调研究行动、比利时联邦政府的大学间吸引极、欧洲共同体EuReGene综合项目（FP6）、，瑞士国家科学基金会授予3100A0-100400/1和310000-113518/1（授予B.S.）、欧洲青年研究员奖（授予J.G.H.）和ZonMW授予9120.6110（授予R.B.）。H.B.是Fonds National de la Recherche Scientifique的研究员。
缩写
| [加利福尼亚州2+]我 | 细胞内钙2+浓度 |
| CB（断路器） | 钙结合蛋白 |
| 打折 | 远曲小管 |
| 毫伏直流输电 | 鼠标DCT |
| GS公司 | 吉特曼综合征 |
| HCTZ公司 | 氢氯噻嗪 |
| NCC公司 | 纳+-氯离子−共同运输人 |
| nNOS系统 | 神经元一氧化氮合酶 |
| PMCA1b型 | 质膜钙2+-ATP酶1b |
| PT公司 | 近端小管 |
| 光伏 | 帕瓦尔布明。 |
工具书类
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