尼安德特人基因组DNA序列的损伤模式

古代DNA片段。

为了研究古代DNA的断裂是主要发生在某些碱基上还是在某些序列背景下，我们分析了DNA序列5′端和3′端附近的碱基组成，即模板DNA中断裂位点附近的碱基组成。为了避免测序错误或序列末端附近的错误合并导致结果混淆（见下文），并允许分析测序片段外的序列上下文，我们将每个454序列与参考基因组对齐，在两个方向上扩展对齐以包括整个454序列，并使用参考序列测量古代DNA模板两端的碱基组成。为了避免3′端受到454测序长度的限制，我们只使用了3′端可以通过B接头的存在来识别的序列。

图2显示了人类参考基因组的碱基组成，从尼安德特尔碱基末端以外的10个碱基分别测序到5′端和3′端序列中的20个碱基。在大多数尼安德塔尔分子中，C和G的频率分别为≈22%，A和T的频率为≈28%。因为G和C在人类基因组中的平均比例是20.5%(15)这反映在454年测序的当代人类DNA中[支持信息（SI）图5]这表明在古代阅读中对GC-rich序列有轻微的总体偏见。引人注目的是，在5′端的-1位置，即测序的5′最碱基上游的第一个位置，G的频率从分析的所有尼安德特尔读数中的≈22%提高到29%（Fisher精确检验，P（P）< 2.2 × 10⁻¹⁶)A的频率从≈28%提高到31%(P（P）= 3.5 × 10⁻¹⁰)而C和T被抑制。相反，在3′端下游+1处，C的频率(P（P）< 2.2 × 10⁻¹⁶)以及T(P（P）= 1.32 × 10⁻⁵)升高到≈30%，而G和A降低。在5′-最有序的位置，A被压到23%(P（P）< 2.2 × 10⁻¹⁶)而T升高到31%(P（P）= 4.7 × 10⁻¹³)，而在3′-最测序的位置，A升高到32%(P（P）= 2.8 × 10⁻¹²)T降低到23%(P（P）< 2.2 × 10⁻¹⁶).

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图2。

尼安德特人DNA序列末端的碱基组成。人类参考序列的基本组成是尼安德特人序列5′端和3′端距离的函数。

虽然454个序列的5′端代表已测序古模板链的5′-断裂的位置，但3′端代表互补链上5′-断的位置(图1). 因此，数据表明，在链断裂之前，鸟嘌呤残基和腺嘌呤残留物相对于胞嘧啶和胸腺嘧啶残基升高。当用同样的方法分析由454过程测序的现代人类DNA时，在链断裂附近看不到嘌呤的升高，而是C的轻微升高和a在-1位置的降低(图2). 这表明尼安德特人数据中所见的模式是由于影响古代DNA的碎片化过程，而不是由于454过程有效测序片段的偏差。从Vindija标本制备的尼安德特人DNA中，嘌呤在5′到链断裂处的出现率增加，这是典型的，这一事实得到了支持，即在质粒载体中克隆并随后测序的同一标本的尼安德特人DNA中也发现了与链断裂相邻的过量鸟嘌呤残基(14) (SI图5). 有趣的是，克隆的尼安德特人序列的总GC含量约为50%，而人类基因组的GC含量为41%(15)，这表明克隆过程的某些特征引入了对富含GC的古老序列的偏见，这种偏见比直接454测序强。

在猛犸象和洞穴熊中(SI图5)DNA直接在454平台上测序，在断裂附近同样可以看到G和A的过量。然而，在洞穴熊中，A的增加量大于G。这些结果表明，嘌呤（G和A）可能在许多或大多数古代标本中立即过量表达5′链断裂。可能导致这一现象的机制是去排尿，即从DNA的脱氧核糖磷酸骨架水解嘌呤碱。脱尿事件发生后，糖磷酸主链易被3′水解到脱尿部位(16). 在许多情况下，脱尿都会影响DNA(17)和无基位点已被证明存在于古代DNA中(1). 然而，值得注意的是，这似乎只能解释直接测序的尼安德特人样本中所有股断裂的10%。

还应注意的是，除了断裂附近嘌呤的升高外，在一些样品中还可以看到分子末端附近的其他碱基组成畸变。在猛犸象中，在链断裂上游的第二个位置存在多余的T和减少的G。这也见于一个永久冻土保存的乳齿象样本（未发表的观察结果），表明这可能与永久冻土环境有关。有必要对几个古代标本进行进一步分析，以阐明在不同保存条件下的古代DNA样品中，除排尿外，DNA链断裂的发生频率。

核苷酸合并不当。

因为每个454序列都是从一个单链分子衍生出来的，所以与相关基因组的12个可能的碱基差异（例如C到g）中的每一个都可以与它的互补变化（例如g到C）区分开来(9,18). 因此，可以估计每种可能的核苷酸错误整合的模式和流行率。当对大量454个序列进行读取时，任何单核苷酸（例如C）改变为另一特定核苷酸（例如T）的替换数量应等于互补核苷酸（例如g）改变为互补核苷酸（即A）的替换次数，除非发生核苷酸错误整合(9). 当在更新世生物的DNA序列中分析这种股当量的互惠核苷酸替换时，C到T的变化比G到A的变化更频繁(9,10,18). 此外，与从现代DNA测定的DNA序列相比，G到A和C到T的变化率都高于其他两个转变率。然而，有充分证据表明，古代DNA中胞嘧啶残基去氨化为尿嘧啶残基是导致过量的C到T取代的原因(三)，从G到A的替换是难以捉摸的。它们可能是由鸟嘌呤残基脱氨基为黄嘌呤（X）残基引起的，黄嘌呤的DNA聚合酶在454测序过程中作为腺嘌呤残留物读取这些残基，从而可能导致G到A的错误合并(9). 然而，由于DNA聚合酶将X误读为A的效率很低，尚不清楚这是否足以解释观察到的效果。

我们分析了12个取代中每一个发生的频率，作为它们分别与尼安德特人DNA序列的5′端和3′端（由B接头的存在定义）的距离的函数。图3表明与先前的发现一致，C到T和G到A的取代率显著升高，而其他取代率相似且较低。然而，引人注目的是，C到T和G到A的取代在DNA分子中分布不均匀且不同。在分子的最5′核苷酸位置，C到T取代的频率比其他取代至少高出50倍，其中人类参考序列中约21%的所有胞嘧啶残基在古代序列中被视为胸腺嘧啶残基。然后，在分子的第一个≈10个核苷酸上，C到T的取代迅速减少，之后，它们向3′端稳定地减少，尽管相对于其他取代（G到A除外），它们仍然升高，G到A的取代似乎不会高于其他取代，直到约20个核苷酸从5′端进入分子，频率稳定增加，直到最后约10个位置，在分子的最3′端增加到约60倍于背景。其他替代物不仅更加罕见，而且随着DNA序列位置的变化似乎也没有显著变化，尽管检测任何此类变化的能力明显较低，因为它们的频率很低。

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图3。

尼安德特人DNA序列中的错误整合模式。将12个可能的失配频率绘制为距离5′端和3′端距离的函数。在每个位置，替换频率（例如C-T）被计算为携带C的人类参考序列位置的比例，其中454序列为T。10 5′-和10 3′-大多数核苷酸分别从3′-和5′-图中删除。

在猛犸象序列中，同样由454技术确定(SI图6)，由于猛犸象和大象基因组之间的进化距离大于尼安德特人和人类基因组之间的演化距离，所有替代的数量在阅读中都较高。这使得误认公司变得更加困难。然而，很容易检测到5′端C到T取代基升高和3′端G到A取代基升高。洞穴熊产生的直接序列也是如此(SI图6). 在由进行454测序的同一尼安德特人制备的细菌质粒库中(14)插入物的5′端的C到T取代和3′端的G到A取代的升高情况类似，尽管与直接测序的DNA相比没有那么显著(SI图6). 相比之下，在以与尼安德特人DNA相同的方式分析的雾化现代人类DNA中没有发现这种增加(SI图6)，表明这不是454技术的一个功能就其本身而言而是古老的DNA。

悬垂端和缺口。

由于454测序产生的5′末端代表模板分子的5′端，因此5′端C到T取代的升高必然源于某些过程，导致胞嘧啶残基被解读为胸腺嘧啶残基。胞嘧啶脱氨为尿嘧啶已被证明发生在古代DNA中(1,三)并导致核苷酸错误整合(三). 因此，测序的古老模板链中的脱氨基胞嘧啶残基可能是分子5′端C到T取代的原因。从表面上看，分子3′端G到A的错误结合可能是由于古代模板中的鸟嘌呤残基修饰所致。然而，考虑到分子3′端的G到A取代在频率和模式上与分子5′端的C到T取代相似，并且考虑到454个模板分子的3′端可能代表互补链上的填充5′端悬垂端(图1)，我们认为3′端G到A取代的升高是原始模板分子互补5′端C到T取代的结果。事实上，尽管此前有人认为，直接454测序发现的所有错误公司都反映了测序链上的错误编码损伤(8–10)在454测序过程中，有两个步骤可以对要测序的链产生互补变化。首先，如果在悬垂的5′端出现编码错误的病变，例如尿嘧啶残留(图4A类),T4类DNA聚合酶将在末端修复过程中插入一个互补碱基，即腺嘌呤残基，与错误编码的尿嘧啶残基相对。随后，要么对原始受损的链进行测序，在序列的5′端附近观察到尿嘧啶残基导致的C到T替换，要么对未受损的链测序，并在序列的3′端附近观测到互补的G到a替换。第二，当绞线移位时英国标准时间DNA聚合酶用于完成适配器，酶可以从模板分子的任何缺口或缝隙延伸，取代原来的链顺流到模板链的末端(图4B类). 如果是这种情况，模板链上缺口下游出现的错误编码损伤将导致新合成的序列链上的错误组合，例如，插入尿嘧啶残基对面的腺嘌呤残基。因此，在缺口或缺口的下游，序列链上出现的错误编码损伤将被清除，而相反链上的错误编码病变将被视为错误合并。因此，5′-悬垂末端以及DNA缺口将导致分子的C到T取代率降低，而G到A取代率从5′-末端增加到3′-末端。

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图4。

错误编码病变和454过程。在准备454测序模板的过程中，DNA片段的末端首先通过T4类DNA聚合酶(A类)，在稍后的步骤中，链接器由填充英国标准时间DNA聚合酶(B类). 在钝端修理期间T4类DNA聚合酶(A类)3′-悬垂端的误码病灶（黑圈）被移除，而5′-悬吊端的误编码病灶导致454个序列中出现互补性误码（白圈）。类似地，通过绞线置换延伸英国标准时间DNA聚合酶(B类)导致缺口或缺口下游模板DNA的错误编码损伤，从而导致生成的序列中出现互补性错误组合。

图3表明，即使在前20个5′-核苷酸之后，整个分子的C到T取代的频率也会朝着3′-末端稳步下降，而G到A取代似乎并没有上升到5′-末端。这进一步支持了以下观点，即这些模式的主要损害是影响胞嘧啶残基并导致其被解读为胸腺嘧啶残基的损害。

总之，古代DNA分子中C到T和G到A取代的模式强烈表明，古代DNA中绝大多数错误掺入是由于胞嘧啶残基脱氨基所致。作为推论，先前提出的产生G到a取代的修饰鸟嘌呤残基(9,18)与脱氨基胞嘧啶残基相比，它们要么不存在，要么很罕见。

悬垂端和脱氨。

古DNA序列5′端C到T错误整合的高频率和3′端G到A错误整合的相应高频率表明，古DNA分子5′端胞嘧啶残基的脱氨基作用显著升高。这可能是由于分子末端的胞嘧啶残基有脱氨基的倾向，或者在脱氨基的胞嘧啶残留物附近发生链断裂的倾向。在后一种情况下，人们可能会看到在链断裂周围的对齐参考序列中胞嘧啶残基的升高。然而，情况并非如此(图2). 因此，我们认为，与分子中更内部的胞嘧啶残基相比，靠近古代DNA分子末端的胞嘧啶残留物更容易脱氨。

一种可能的机制是古代DNA中存在单链悬垂末端，因为单链DNA中胞嘧啶脱氨基的速率比双链DNA高约2个数量级(17). 另一种非互斥的机制是分子末端的“DNA呼吸”，这可能导致分子部分单链，因此更容易脱氨。前一种机制得到了以下事实的支持：3′端G到A取代的升高幅度与5′端C到T取代的升高程度相似。如果这种影响主要是由单股悬垂引起的，那么这是可以预料的T4类DNA聚合酶在末端修复过程中，因为这将在每3′末端产生G到A的取代，延伸到5′末端，带有脱氨基胞嘧啶残基。相反，如果末端效应源于对双链DNA的损伤加剧，则修饰的胞嘧啶残基仅在缺口延伸步骤中得到补充，因此（除非所有分子都带有缺口）5′端C到T取代的升高将大于3′端G到A取代的升高。

古代DNA损伤模型。

鉴于上述数据，我们得出结论，胞嘧啶脱氨基是导致古代DNA中核苷酸错误整合的主要因素，古代DNA包含单链末端和缺口，这导致454个序列数据中出现明显的G到A替换。我们进一步认为，胞嘧啶脱氨基在分子的单链末端比在分子内部更普遍。通过在统计模型中形式化这些发现，我们可以估计与尼安德特人DNA降解程度相关的几个参数。

在这个模型中，我们估计了以下四个参数：刻痕的频率，我们将其建模为每基均匀概率（ν）；单股悬垂端的平均长度，我们取其服从参数λ的几何分布；双链DNA中脱氨基胞嘧啶残基的频率（δ）；以及单链DNA中脱氨基胞嘧啶残基的频率（δ_不锈钢). 注意，该模型明确地包含了影响454测序的输出的两个点。首先，当在相对的链和彼此的下游发现缺口时，片段在454模板制备的缺口修复阶段丢失，因为当复制叉相遇时，分子会分裂。这使得序列碎片中的第一个缺口分布均匀，而不是几何分布。其次，该模型说明了454协议中的端修复步骤(图1)消除所有3′外伸端，只保留5′外伸末端。

给定此模型（详细信息请参见SI文本)，我们使用最大似然来估计给定尼安德特尔数据的四个参数(表1). 估计单链DNA中脱氨基胞嘧啶残基的比例为68%（95%置信区间（C.I.），65-71%），双链DNA中的脱氨基胞苷残基比例为0.97%（C.I.，0.87-1.1%）。这与以前的工作一致(17)这表明，单链DNA中胞嘧啶残基的脱氨率比双链DNA中高约2个数量级。单股悬垂端的平均长度估计为1.6–1.8个核苷酸，单股缺口的频率为2.4%（C.I.1.7–3.6%），即每50个核苷酸约有一个缺口或间隙。请注意，虽然悬垂端长度的C.I.较窄，但缺口频率的C.I..比估计值大得多，这表明我们估计缺口频率的能力相对较低。

如果我们使用上述参数估计值沿着假设的尼安德特尔序列模拟预期的C到T和G到A误判频率，结果与观测数据非常吻合，表明我们的假设与数据大体一致(SI图7). 将此模型应用于未来的数据集将提供一个框架，用于评估通过454测序从古代DNA生成的任何核苷酸位置的错误概率，并将揭示这些参数在多大程度上因样本而异以及随保存条件而异。

我们感谢Graham Coop、Tom Evans、Laurent Excoffier、Christine Green、Michael Hofreiter、Nick Patterson和Matthias Stiller的有益讨论，并感谢Max Planck学会的财政支持。P.L.F.J得到了美国国立卫生研究院拨款R01-GM40282（蒙哥马利·斯拉金）的支持。