哺乳动物伴侣的多分散性：质谱法揭示αB-结晶蛋白中低聚物的群体

摘要

小热休克蛋白（sHSPs）是一个分子伴侣家族，参与应激条件下蛋白质的稳定(1). 哺乳动物sHSPαB-crystallin系统表达(2)与αA-晶体蛋白一起，也是眼睛晶状体的主要结构蛋白。αB-晶体蛋白通过抑制未折叠蛋白的聚集而显示分子伴侣活性(三). 晶状体外αB-晶体蛋白的过度表达与许多异常蛋白质疾病状态相关，包括阿尔茨海默病、亚历山大病、帕金森病和克雅氏病(4–7). 尽管原核生物的结构信息越来越多(8)和工厂sHSP(9)，包括α-晶体蛋白、HSP27和HSP20在内的该家族哺乳动物成员的结构尚待阐明。这些sHSP是从组织中分离出来的多分散多聚体，正是这种异质性混淆了结构生物学家的努力(10,11).

尤其是α-晶体蛋白，其分子质量分布长期以来一直是相互矛盾的结果(12); 然而，公认的是，从晶状体中分离出的α-晶体蛋白是一种多聚物组合，其分子质量范围为300 kDa到>1 MDa(10). 最近，采用尺寸排除色谱法和多角度激光散射相结合的方法测定了重组人αB-晶体蛋白的质量范围，为530-684kDa，洗脱曲线的峰值处为585kDa(13). 这是迄今为止对α-晶体蛋白固有多分散性的最准确评估；然而，它仅限于洗脱图谱中的主要物种，对于分布中低聚物的相对数量几乎没有提供任何信息。

电喷雾电离耦合飞行时间质谱（MS）为定义非共价配合物的亚单位组成提供了独特的见解(14–16)包括sHSP(17,18)和其他陪同人员(19–21). 然而，无法解释来自多分散蛋白质（如αB-晶体蛋白）的数据。这主要是因为它们的高分子量和涉及的寡聚物种类众多，导致质谱中出现重叠峰。

串联质谱（MS/MS）是一种肽序列测定的常规方法，涉及在一个明确定义的米/z（z）射程和随后与惰性气体的碰撞诱导解离（CID），以产生碎片离子(22). 这个过程也可以用来从蛋白质的非共价组合中去除单个亚单位(14)导致产品费用重新分配。这里我们表明，通过对αB-晶体蛋白应用这种方法，我们能够定义构成这种多分散组装的不同低聚物的范围和相对数量。

材料和方法

牛的纯化αB-晶体蛋白。通过Sephacryl S300HR凝胶过滤柱（Amersham Biosciences）从2-4周龄牛小牛晶状体提取物中分离出α-晶体蛋白。将蛋白质平衡到缓冲液A中（50 mM Tris·HCl/2 mM DTT/6 M尿素，pH 8.5）并浓缩至10 mg·ml^–1在超滤池（Millipore）中。将样品加载到MonoQ离子交换柱（Amersham Biosciences）上，并使用0–14%B的线性梯度用缓冲液B（缓冲液a/1M NaCl）洗脱，分离出α-晶体蛋白a和B亚基的磷酸化和非磷酸化形式对应的峰。将未磷酸化的αB-结晶蛋白浓缩至30 mg·ml^–1通过使用YM10 Centricon（Millipore）。将70微升样品加载到Superdex 200HR10/30凝胶过滤柱（Amersham Biosciences）上，并在0.3 ml·min下洗脱^–1在4°C下使用200 mM醋酸铵。收集折叠蛋白的部分并将其储存在冰上，以尽量减少四元结构重排(23)并在收集后1小时内通过MS进行分析。将收集到的每个组分合并成等量，得到1.2 mg·ml的组合组分蛋白质浓度^–1.用AG 50W-X8树脂（Bio-Rad）酸化此溶液的等分试样，以获得变性的单体样品，其质量（20079.2±0.7 Da）与20078.8 Da的未磷酸化牛αB-晶体蛋白的序列质量一致（未显示光谱）。

毫秒。使用LCT（正交飞行时间）和改进的Q-ToF 2质谱仪（英国曼彻斯特Micromass）进行实验。通常，从内部制备的镀金玻璃毛细管中电喷涂2μl溶液，如所述(24). 为了保持LCT上的非共价相互作用，使用了以下仪器参数：毛细管电压，1.5 kV；锥形气体，150 Lh^–1; 样品锥，200 V；抽出器锥，10V；离子传输级压力9.0×10^–三毫巴（1毫巴=100帕）；和ToF分析仪压力，3.0×10^–6毫巴。在Q-ToF 2仪器上进行了MS/MS实验，该仪器经过改装，可进行大批量操作(25). 在MS模式下，使用以下仪器参数：毛细管电压，1.6 kV；锥形气体，100 Lh^–1; 样品锥，200 V；抽出器锥，100 V；施加在碰撞电池上的电压，4V；离子传输级压力9.0×10^–三毫巴；四极分析器压力，9.5×10^–4毫巴；和ToF分析仪压力，1.7×10^–6和3.5×10^–2碰撞室中氩气的毫巴。对于MS/MS实验，调整四极分辨率以涵盖整个感兴趣的峰值（30米/z（z）单位），提取锥电压降低至60 V，并在80至200 V的范围内对碰撞电池施加电压，获得光谱。所有光谱均使用碘化铯溶液（100 mg·ml）进行外部校准^–1)并使用进行处理大猞猁软件（Micromass）。这里显示的光谱具有最小平滑度，没有背景减法。

模拟光谱。为了证明光谱的理论反褶积，对所涉及的不同物种的单个电荷态包络进行了建模。所示的模拟光谱是使用西格玛计划2001（SPSS，芝加哥）。使用三参数洛伦兹曲线对单个峰进行建模，半高处的峰宽为12米/z（z）单位，峰的强度基于观察到的不同电荷态的强度。

结果和讨论

当在尺寸隔离柱上从尿素复性时，αB-晶体蛋白作为平均分子质量≈600 kDa的单一对称峰洗脱(图1A类). 所示馏分记录的相应光谱如所示图1B类.分数23的光谱(图1B类)发出8000–15000范围内的信号米/z（z）。在相同MS条件下分析的后续馏分显示出降低的趋势米/z（z）分数28的值包括米/z（z）范围为6000–12000。在下部米/z（z）值，可以确定10–18个亚基范围内的αB-晶体蛋白物种的低聚物状态，即200–361 kDa。光谱的未解决部分，如高于8000的基线所示米/z（z）这是由于αB-晶体蛋白的一系列越来越大的低聚物引起的电荷序列重叠。

在单独的窗口中打开

图1。

尺寸排除色谱法分离的αB-晶体蛋白连续组分的质谱变化调查。(A类)牛αB-晶体蛋白从6 M尿素重折叠到200 mM醋酸铵的洗脱曲线。在MS分析之前，收集所示馏分并保存在冰上。mAU，毫吸光度单位。(B类)组分23–28的电喷雾质谱A类.离子在米/z（z）在整个洗脱曲线上观察到从高到低的刻度，表明在峰开始和峰尾的组分之间αB-晶体蛋白的低聚物尺寸显著减小。

将各个馏分合并，得到样品中所有低聚物的代表性样品。结合组分的质谱产生的信号范围为7000–15000米/z（z）并且在较低位置缺乏明确的峰值米/z（z）单个晚洗脱组分的观察结果(图2A类). 事实上，最小的低聚物是16聚体，这表明这是数量可观的最小低聚物。此光谱中可用的信息量有限，因为主峰并非来自单个物种的多次充电（如典型的电喷雾光谱），而是来自不同尺寸低聚物的多个此类系列的重叠。这一点可以通过10040处的强而窄的峰值来证明米/z（z）（以星号表示图2A类)，因为αB-晶体蛋白单个亚单位的分子量为20080Da，对应于携带亚单位两倍电荷的低聚物。

在单独的窗口中打开

图2。

(A类)牛αB-晶体蛋白结合组分的电喷雾质谱（来自尺寸排除色谱）。在7000和15000之间观察到信号米/z（z）最大峰值约为10000米/z（z）这些峰值不是由于单个低聚物的电荷态系列，而是由于不同尺寸低聚物中的几个此类系列的重叠。该光谱是在施加到碰撞电池的电压为4V时获得的(B类)从一系列碰撞能量获得的质谱表明，αB-晶体蛋白低聚物经历了多个单体损失，从施加在120 V碰撞电池上的一个单体到施加在200 V碰撞电池中的三个单体(C类)在120V、160V和200V的碰撞电池上施加电压时，单体区域的膨胀。观察到游离单体的平均电荷状态从120V时的18+降至160V时的16+和200V时的15+。

为了识别潜在的电荷状态序列，在80至200 V的电压范围内采集了质谱(图2B类). 在这样的实验中，在电喷雾过程中形成的所有离子都会不加区别地与Q-ToF 2碰撞电池中的氩原子发生碰撞，从而从多聚物组合中去除多余的溶剂离子，从而提高光谱质量。当施加在碰撞电池上的电压为100 V时，去溶作用增加，与光谱相比，峰的清晰度也随之提高图2A类将施加在碰撞电池上的电压增加到120 V，导致单体出现≈1500米/z（z），表示发生CID过程。已经确定，受到CID作用的非共价配合物导致低聚物不对称分解为高电荷单体和低电荷“剥离”低聚物(18,26–29). 因为离解产物之间电荷守恒(27,30)，这些剥离低聚物的含量异常高米/z（z）比率。在120 V下获得的光谱中，剥离的低聚物可鉴定为>13000米/z（z）包括2008年的一个相对强烈的峰值米/z（z）提高碰撞室中的加速电压后，单体和剥离低聚物的信号强度都增加，在200 V时，没有观察到与原始完整低聚物对应的峰值。

发现单体的电荷态分布向更高的方向移动米/z（z）当施加在碰撞电池上的电压增加时(图2C类). 单体的平均电荷态，按规定计算(18)发现在120 V时为18+，在160 V时为16+，在200 V时为15+。这些值与低聚物中单体的连续损失一致，从而导致观察到的剥离低聚物。^§这些观察结果可总结为以下方程式：

哪里n个是低聚物中的亚基数量，q个是低聚物上的电荷数，以及x、 年、和z（z）是单体携带的平均电荷米施加在碰撞电池上的给定电压。增加施加在碰撞电池上的电压后，连续形成三个不同的产物离子系列的观察结果表明，αB-晶体蛋白的CID导致n个组成单体和剥离低聚物n个– 1,n个–2，以及n个–3个亚基。

尽管在图2B类大于原始低聚物系列，光谱仍然极其复杂，无法明确解释。为了获得样品中各种低聚物相对数量的信息，使用MS/MS对多分散组装体进行了分离实验。该实验包括分离10040处的峰米/z（z）（包括每个亚单位带有两个电荷的所有物种）和随后的CID。对碰撞电池施加80至200 V的电压范围内，获得了一系列光谱，其组合光谱如所示图3.为碰撞活化而隔离的前体离子在10040时可见米/z（z）。介于12500和16500之间米/z（z），从每个低聚物中去除单个单体产生的离子(n个–1）存在。另一系列离子，归因于双剥离低聚物(n个–2）17500至26000之间米/z（z），主宰高位米/z（z）光谱区域，而其他次要物种(n个–3）约30000米/z（z）。单体多次解离的观察示意图如所示图3.

在单独的窗口中打开

图3。

10040分离峰中重叠成分的MS/MS米/z（z）(图2A类)导致低聚物在较低温度下分解为高电荷单体米/z（z）以及各种高剥离低聚物米/z（z）值。光谱显示了应用于80–200 V碰撞电池的一系列电压的采集总和。Overlaid示意图显示了代表性低聚物的单体多重损失的可能途径，以及气相CID期间产生的质量和电荷不对称。示意图显示了一个顺序路径；然而，我们不能排除两个和三个单体同时从一个低聚物中分离的可能性。

双剥离低聚物系列(图3)峰的定义最高，电荷态序列重叠最少，因此在解释上没有歧义。因此，该系列用于确定αB-晶体蛋白组装中低聚物状态的分布。图4A类显示了在130 V的电压作用于碰撞电池时获得的MS/MS光谱的扩展。在此电压下，双剥离低聚物的数量最大，单剥离和三剥离的低聚物数量大致相等。尽管光谱仍然很复杂，但与不同低聚物αB-晶体蛋白物种相对应的电荷态可以很容易地识别出来。质量测量允许明确分配不同的双剥离低聚物。

在单独的窗口中打开

图4。

(A类)与低聚物相对应的光谱区域的扩展n个–在130 V的电压下，通过MS/MS分析获得2个亚基。峰值对应于具有不同亚基数量的双剥离低聚物的电荷状态(n个–2）。2008年的重叠峰值米/z（z）结果来自与亚单位具有相同电荷数的低聚物。下部的峰组米/z（z）而这个中心峰是由寡聚体种群携带每个亚基一个以上电荷造成的(n个– 1,n个、和n个+1），而较高米/z（z）由每个亚基携带少于一个电荷的低聚物产生(n个– 3,n个–4，和n个– 5). 灰色光谱表示中显示的模拟光谱之和B类. (B类)光谱的理论反褶积表明了几个不同大小的剥离低聚物是如何结合起来形成观察到的光谱的(A类). 不同尺寸双剥离低聚物的光谱[23≤(n个–2）≤30]从理论上进行了模拟米/z（z）每个低聚物离子系列的值以及所示不同电荷态的观察强度A类.

2008年观测到的主峰米/z（z）对应于每个亚单位携带一个电荷的双剥离低聚物，即由以下组成的低聚物n个–2个亚单位携带n个–2次充电。位于中心重叠峰两侧的一组峰并不是离散的电荷态分布，而是不同双剥离低聚物范围内贡献的结果。为了说明这是如何产生的图4A类通过模拟八种主要双剥离低聚物的单个电荷态分布来进行(图4B类). 这些模拟显示了20080年的主峰米/z（z）在里面图4A类产生于此处峰的重叠米/z（z）来自所有不同的双剥离低聚物。在这两边米/z（z）值电荷态不重叠；因此，观察到了一组峰。这些模拟光谱表明了用于计算相应低聚物质量的峰序列，并证明了单个组分的贡献如何结合起来，从而得出多分散组装的观察光谱。解决双剥离低聚物产生的峰值的能力使我们能够量化其相对数量。通过计算所示光谱区域中每个峰序列的强度(图4A类)，我们观察到双剥离低聚物的对称分布，大小不同于一个亚单位，从22个亚单位到31个亚单位不等，模式值为26个亚单位(图5). 这对应于低聚物在24–33个亚基的原始αB-晶体蛋白样品中的分布，模式值为28个亚基。

在单独的窗口中打开

图5。

显示不同双剥离低聚物相对种群的直方图(n个–2）由αB-晶体蛋白形成，根据MS/MS光谱中的峰强度计算。原始样品中低聚物的数量(n个)根据双重剥离计算(n个–2）数据。

就其本质而言，即狭隘的米/z（z）窗口中，MS/MS实验没有考虑MS光谱中的所有信息，因此也没有考虑样品。因此，这种群体分布并不能完全反映αB-结晶蛋白中低聚物的范围，正如在合并组分的MS光谱中观察到的16-mer这一事实所证明的那样(图2A类)在MS/MS光谱中未观察到。同样，来自高层的信息米/z（z）这个实验可能排除了光谱区域。为了研究这一点，在施加于200 V碰撞电池的电压下获取MS（而非MS/MS）光谱(图2B类)进行了更仔细的检查。这个光谱(图6)由于与观测到的峰值相对应的峰值组图4A类含有更广泛分布的低聚物；因此，它们相互重叠，导致对整个光谱的解释模糊不清。然而，在20080年，在靠近中心峰的位置观察到MS/MS光谱中不重叠的附加峰米/z（z）使用这些峰进行的质量测量表明，αB-晶体蛋白由40个亚基的低聚物组成(n个–2=38）尺寸。因此，当低和高米/z（z）考虑到区域，本研究结果表明，αB-crystallin以10到40个亚基的物种连续体的形式存在，围绕着包含28个亚基、人口最多的集合。

在单独的窗口中打开

图6。

扩展包含n个–在200 V的碰撞电池电压下获得2个低聚物系列(图2B类)无需选择前体离子窗口。在本实验中，样品中存在的所有离子都受到高能气相碰撞，从而产生全系列组分组装的剥离低聚物。接近2008年峰值的非重叠峰值米/z（z）提供了有关此样品中最大低聚物的其他信息。

结论

在质谱仪中使用CID从每个αB-晶体蛋白组件中去除多达三个单体，这使我们能够确定这种多分散蛋白质的精确寡聚性质，此前只报道了一系列分子量。与其他分子质量测定技术相比，使用MS的优点是我们能够测量单个低聚物组装体的相对数量。此外，我们能够定义分布极端的物种，揭示了小到10个单体和大到40个单体的低聚物。这种方法有可能确定参与伴侣作用的αB-晶体蛋白亚基的数量，并对底物相互作用的机制产生见解。

来自植物、酵母和细菌的sHSP已被证明由二聚体构建块组成，它们被认为是参与伴侣活性的活性单位，并有助于它们的单分散性(9,31). 相比之下，αB-结晶蛋白形成的含有奇数和偶数亚基的低聚物强烈表明单体是这种组装的基本组成部分。与更专门的非哺乳动物sHSPs相比，这种内在的多分散性和亚结构的差异可能反映了αB-结晶蛋白更广泛的底物特异性。此外，单体或其可变簇可构成活性单元体内并有助于增强伴侣效能。

这些结果强调了确定其他异质复合物亚基组成的令人兴奋的可能性，迄今为止，仅报道了一系列分子量。此外，还有实时监控反应的能力(17)，这项技术将有助于了解此类物种的动力学，并有助于更清楚地了解其作用机制。

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：HSP，热休克蛋白；sHSP，小HSP；串联质谱；CID，碰撞诱导解离。

脚注

参考文献