肝癌是人类最致命的恶性肿瘤之一，全世界每年发生60万例，自确诊之日起平均生存时间为6个月(1). 肝癌的主要病因是乙型或丙型肝炎病毒感染、慢性酒精中毒、黄曲霉毒素暴露或其他易导致肝硬化的情况。这些原因被认为通过诱导肝细胞反复死亡和增殖而导致肝癌(2)创造了一个宽松的环境，在这个环境中，可能发生遗传或表观遗传变化，从而使原癌基因获得功能，或使抑癌基因失去功能(三). 已经报道了许多这样的变化，但这些产生人类肝细胞癌（HCC）的变化的组合在很大程度上仍然没有特征。在已知的人类肝癌发生的变化中，原癌基因的过度表达、扩增或突变是最常见的遇见，编码受体蛋白酪氨酸激酶Met(4–6)以及通过编码β-catenin的基因突变激活Wnt信号通路(CTNNB1公司)，阿信(AXIN1型)，或axin 2(AXIN2型) (7). 这些变化为本研究提供了出发点。
人类也会发生肝细胞腺瘤（HCA），这是一种相对罕见的肝脏良性肿瘤，在有口服避孕药史的女性中最常见(8). 与HCC相比，HCA中最常见的基因改变是使细胞失活的突变TCF1系列编码转录因子肝细胞核因子1α（HNF1α）的基因。双等位基因失活突变TCF1系列在50%的散发性HCA中发现，一些家族在TCF1系列表现为腺瘤病综合征，在该综合征中，个体发展为10个或更多HCA，表现为杂合性缺失TCF1系列。尽管tcf1−/−小鼠在断奶前后出现肝肿大并死亡，尚未有报告显示有肿瘤形成的证据(9). 因此，除灭活TCF1系列可能是HCA生成所必需的。
我们之前报道过野生型的过度表达遇见如在相当一部分人类肝癌中观察到的，可以在小鼠中启动肝癌的发生(10). 我们现在使用这些小鼠前瞻性地重建HCA和HCC的基因组进展。研究结果似乎重复了人类肝脏良性和恶性肿瘤发生过程中发生的事件。这里描述的小鼠模型应被证明对肝脏肿瘤发生的进一步研究和新疗法的临床前测试有用。
结果
良性和恶性肿瘤遇见转基因小鼠。
我们之前培育了四个独立的小鼠系，它们过度表达人类野生型等位基因遇见强力霉素控制下的肝细胞特异性(10). 人类等位基因的使用遇见允许通过免疫分析区分转基因和内源性Met蛋白。其中两条线(TRE-MET公司第3和第4行）通常在同一肝脏中发生HCC和HCA() (10). 典型的是，在任何一个肝脏中都有一到五个独立的肿瘤结节。HCC在第3行占优势，而HCA在第4行占优势（数据未显示）。
肝脏的大体病理学遇见转基因小鼠。所示为从8个月大的品系4 LAP-tTA/TRE-MET转基因小鼠中取出的肝脏。强力霉素在动物的生命中一直被扣留。肝脏中含有HCA（a）和HCC（c）结节，经组织学分析证实。
组织学上，肝脏依次出现增生灶、异常增生灶，3个月大时出现明显的肿瘤( A–E) (10). 肝癌主要由肝细胞组成，细胞板厚度大于三个细胞，胆管细胞稀少，缺乏小叶结构(D类) (10). 此外，HCC表达胎儿标志物α-脂肪蛋白（AFP）[支持信息（SI）图5N个]如在人HCC中发现的。HCA也由肝细胞组成，胆管细胞稀少，缺乏小叶结构(E类). 然而，与HCC不同的是，HCA的细胞板只有一到两个细胞厚(E类)并且没有表达AFP(SI图5O（运行）). 我们没有观察到HCA内发生HCC，反之亦然。我们得出结论，HCC和HCA可能是相互独立产生的，这一点稍后将得到进一步验证。
肝脏肿瘤发生过程中的形态学和分子进展遇见转基因小鼠。多西林在所有动物的生命中都被扣留。LAP-tTA转基因动物肝脏切片(A类,F类,K（K）、和P（P）)或第3行1个月大的LAP-tTA/TRE-MET动物(B类,G公司,L（左）、和问)，2个月大(C类,H（H）,米、和R（右）)，或>3个月大(D类,E类,我,J型,N个,O（运行）,S公司、和T型)如图所示。H&E染色后用显微镜对肝脏进行切片和分析(A–E)，用抗磷酸化Met抗体作为激酶活性替代物的免疫组织化学(F–J型)，用抗人Met抗体进行免疫组织化学(K–O型)或用抗β-catenin抗体进行免疫组化(P–T型). 图像代表对照肝脏(A类,F类,K（K）、和P（P）)，增生性病灶(B类,G公司,L（左）、和问)，发育异常病灶(C类,H（H）,米、和R（右）)，肝癌(D类,我,N个、和S公司)或HCA(E类,J型、O和T型). hf，增生灶；df，增生异常灶；nt，非肿瘤组织；广告，HCA。
肿瘤发生的不同途径遇见转基因小鼠。
我们使用免疫组织化学方法来监测Met在各种组织中的表达和活性。Met的磷酸化用作直接测定酶活性的替代物，目前尚不可能进行分析就地酶活性与人Met在Met激活环1234和1235残基上的酪氨酸上的自磷酸化之间有着良好的相关性(11,12). 可通过使用磷酸化酪氨酸残基特异性抗体或使用抗普通磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀和使用抗Met抗体进行检测来检测自身磷酸化。根据我们的经验，当对同一样品并行进行这两种分析时，得出了相同的结果，因此我们可以互换使用它们。
虽然Met在转基因小鼠肝脏的所有肝细胞中都表达(米和L（左）)，磷酸化Met仅在增生性病灶中检测到(G公司)，发育不良病灶(H（H）)，肝癌(我)和HCA(J型). 此外遇见转基因对于维持增生性和异常增生性病灶显然是必要的，因为在缺乏强力霉素的转基因动物中维持6个月，然后放置在强力霉素上6个月没有观察到这些损伤（数据未显示）。我们得出结论，Met的激活在时间和空间上与肝脏癌前病变的发生相一致，并且Met的持续表达遇见转基因是维持这些病变的必要条件。虽然磷酸化蛋氨酸的存在可能只是肝细胞增殖的一个标志，而不是增殖的原因，但我们赞成后一种解释，因为磷酸化蛋清的沉默遇见转基因表达可阻止癌前病变和随后发生的HCC的增殖（数据未显示）(10).
从人类肝癌的先前发现中获得线索，我们接下来研究了在转基因小鼠中，β-连环蛋白的激活是否参与了从增生或异常增生病灶到肝癌的进展。我们通过两种不同的测试测试了β-连环蛋白的激活：β-连环素的核累积(7)β-catenin靶基因的表达胶编码蛋白谷氨酰胺合成酶（GS）(13). 肝癌结节切片中检测到核β-连环蛋白(S公司)而正常肝脏、增生病灶、增生异常病灶和HCA切片中仅出现膜染色( P–R和T型). 与细胞核β-连环蛋白染色一致，GS在HCC结节中表达，但在HCA结节中不表达(SI图5D类和E类). 和正常肝脏一样(13)GS在增生和异常增生病灶中的表达仅限于紧邻中央静脉的区域(SI图5A–C).
探讨β-catenin在肝癌中的激活机制遇见转基因小鼠，我们测序了ctnnb1型在肿瘤中。我们分析的21个肝癌结节中有20个在ctnnb1型(SI图6和SI表2). 这些突变与在ctnnb1型人类肝癌(14). 特别是，通过消除磷酸化的关键位点，它们稳定了β-连环蛋白，使其在Wnt信号通路中积累并获得构成活性(7). 相比之下，我们分析的HCA结节（13个中的0个）在ctnnb1型（未显示数据）。我们得出结论，β-catenin在HCC的进展中被激活，但在HCA的进展中没有被激活。
在我们分析来自同一肝脏的多个肝癌结节的七个案例中，不同的结节具有不同的特征ctnnb1型突变，表明每个结节代表一个独立的克隆(SI表2). 这些独立结节可能来源于单个肿瘤克隆，后来在ctnnb1型。我们不赞成这种解释，因为这些独立克隆经常位于肝脏的不同叶中（数据未显示），使得来自单个克隆的可能性较小。
再次以人类肿瘤数据为例，我们探讨了HNF1α功能缺失参与HCA发生的可能性。α靶基因，多环芳烃，编码蛋白苯丙氨酸羟化酶（PAH）(15)在HCA结节中不表达(SI图5J型)，但在正常肝脏、增生和异常增生病灶以及HCC结节中表达(SI图5F–I型). 尽管有这些发现，但我们无法发现HCA中HNF1α的结构或表达有任何缺陷（数据未显示），因此我们目前无法解释HCA中缺少PAH的原因。然而，通过使用流体动力学转染，我们能够证实PAH的表达似乎依赖于HNF1α的信号传导，从而证明PAH是这种信号传导的替代标记，并且信号传导的缺陷与遇见以引出HCA。因此，我们怀疑在遇见转基因小鼠也来自类似的合作。HCA中β-catenin突变的缺失以及HCC中通过HNF1α而非HCA进行功能性信号传递的证据支持了这两种肿瘤具有独立起源的观点。
通过流体动力学转染诱导小鼠肿瘤发生。
我们的结果遇见转基因小鼠表明，Met激酶的激活可启动肿瘤发生，而β-catenin的激活或HNF1α功能的丧失分别有利于HCC或HCA的进展。为了直接测试这个模型，我们使用转座子载体进行流体动力学转染，在肝脏中稳定表达外源基因(16–20).
为了利用流体动力学转染重建HCC和HCA的发病机制，我们生成了含有野生型人类的载体遇见，构成活动版本的CTNNB1公司(ΔN90-CTNNB1系列) (21)和一个主要的否定版本TCF1系列仅包含N端290 aa(DNHNF1号机组α) (22)类似于引起家族性腺瘤病的突变体(23). 我们能够通过免疫组化和表位标签抗体检测每个转染基因的表达(SI图7A–D). 根据以往经验，1–20%的肝细胞出现稳定表达（数据未显示）(19). 我们无法在转染了遇见单独（未显示数据）。相反，我们推断转染后的蛋白产物遇见在肝脏的三种表型反应中具有功能活性：诱导广泛和大量的发育不良病灶(SI图8B类E-cadherin的上调（数据未显示），以及与活化的β-catenin在肿瘤发生中的协同作用。
Δ的流体动力学转染N90-CTNNB1系列诱导β-catenin靶点的片状表达胶整个肝脏(SI图8我). 流体动力学转染DNHNF1号机组α产生分散的肝细胞，呈现泡沫状(SI图8D类)并抑制HNF1α靶点的表达多环芳烃(SI图8P（P）). 这种抑制支持了以下观点：多环芳烃依赖肝细胞中的HNF1α，从而验证多环芳烃表达作为肝组织中HNF1α活性的替代物。
在一年的时间里，没有一只动物被转染了遇见, ΔN90-CTNNB1型，或DNHNF1号机组α单独显示有肝肿瘤的证据(,SI图8B–D类和数据未显示）。转染后一年遇见，三只动物死于未知原因，但其余六只动物仍然健康，没有肝脏肿瘤(和数据未显示）。我们的结论是，我们产生的等位基因是功能性的，但在我们分析的时间段内，这些等位基因不足以单独诱发肿瘤。鉴于此遇见转基因可以启动肿瘤发生，我们无法解释转基因小鼠没有肿瘤遇见这种差异可能是由于Met表达水平的差异或表达该基因的细胞的相对数量（转基因动物中的细胞数量要大得多）。
水动力转染后小鼠存活率。用指定的构建物对6至8周龄FVB/N小鼠进行水动力学转染并进行观察。每组动物的数量显示在所列各组的右侧。黑色箭头表示流体动力转染点。
当单独转染时，没有一个基因产生任何类型的即时反应。相比之下，21%（34只中的7只）的动物通过流体动力学转染遇见与Δ结合N90-CTNNB1系列之后3天内死亡(). 我们不能决定性地解释这些死亡，但建议β-catenin和Met的联合活性干扰了水动力转染后肝损伤的恢复(19). 流体动力学转染遇见和ΔN90-CTNNB1系列74%（27只中的20只）存活动物在1个月内发生肝癌，3个月内死亡(,SI图8E类和数据未显示）。在7只未发生肝癌的动物中，我们无法检测到转染基因的蛋白产物；转染明显失败。肝癌是多灶性的，每个肝脏有>50个结节。结节中含有磷酸化Met和ΔN90-β-catenin(SI图7E类,F类、和H（H）). 就像中的HCC遇见转基因小鼠，水动力转染诱导的肿瘤遇见和ΔN90-CTNNB1系列表达GS、PAH和AFP(SI图8K（K）,问、和W公司). 这些动物的肝脏没有HCA的证据。流体动力学转染遇见后跟ΔN90-CTNNB1系列3周后，或以相同间隔的相反顺序，产生了与同时转染两个基因相似的结果（数据未显示）。我们得出结论遇见和ΔN90-CTNNB1系列无论基因的传递顺序如何，都能快速诱导多灶HCC。
流体动力学转染与遇见和DNHNF1号机组α导致HCA(SI图8F类数据未显示），在1个月内，50%（5/10）的动物出现多发结节（数据未显示。经过10个月的观察，这些动物仍然活着()反映了HCA的懒惰本质。在五只未发生肿瘤的动物中，我们无法检测到转染基因的蛋白产物。就像来自遇见转基因小鼠，水动力转染诱导的肿瘤遇见和DNHNF1型α不表达GS、PAH或AFP(SI图8L（左）,R（右）、和X（X）). 免疫组织化学证实DNHNF1号机组α在每个HCA结节内所有肝细胞的细胞核中表达(SI图7G公司). Western Blotting证实HCA结节中存在磷酸化Met，尽管其水平低于HCC结节(SI图7H（H）). 我们得出结论，转染细胞之间的合作遇见和DNHNF1号机组α快速诱导多灶HCA，这与我们之前的推断一致，即HNF1α信号缺失可能参与了HCA的发生遇见转基因小鼠。
人肝癌中Met和β-连环蛋白的激活。
为了探索我们在小鼠模型中描述的HCC遗传途径是否也在人类中起作用，我们分析了人类HCC样本中Met和β-catenin的激活情况(和SI图9). 在容易检测到Met激活的肿瘤中，60%在CTNNB1公司(). 相比之下，那些Met激活量低或检测不到的肿瘤中，只有12%的肿瘤在CTNNB1公司(). 在活化Met含量低或检测不到的HCC亚群中，43%（41例中的18例）检测到高含量的Met总量(SI图9，车道9和10与100%（15例中的15例）的肿瘤中容易检测到激活的Met相比(SI图9，1-6车道和数据未显示）。我们无法解释某些过度表达该蛋白的肿瘤中缺乏Met激酶活性的原因，但该发现提出了一个警告，即不要将蛋白质水平作为人类肿瘤中Met的唯一评估。总之，大多数含有活化Met的人类肿瘤（60%）携带的突变等位基因CTNNB1公司以及大多数肿瘤（64%）携带的突变等位基因CTNNB1公司包含激活的Met(). 活化Met与突变等位基因的关联CTNNB1公司具有统计学意义P（P）χ值<0.0012测试。
表1。
磷酸化Met与突变株的关联CTNNB1公司在人类肿瘤中
| 变量 | 低或检测不到的磷酸化蛋氨酸(N个= 41) | 高磷酸化蛋氨酸(N个= 15) |
|---|
| CTNNB1公司突变体(N个= 14) | 5 (12) | 9 (60) |
| CTNNB1公司野生型(N个= 42) | 36 (88) | 6 (40)* |
肿瘤消退后复发。
我们之前报道过肝癌在遇见强力霉素灭活转基因动物(10). 为了检测回归后残留的肿瘤细胞，我们研究了肝癌细胞中β-catenin的核定位。我们坚持遇见转基因动物在没有强力霉素的情况下生存7个月，以允许HCC的发生。然后，我们选择腹部增大的动物，表明存在肿瘤，并将这些动物置于强力霉素治疗6个月。肿瘤消退，但在瘢痕组织中可检测到含有核β-连环蛋白的嗜酸性小肝细胞的显微病灶( A类和B类). 免疫组织化学分析表明，这些细胞中没有转基因Met和磷酸化Met（数据未显示）。相反，我们从未观察到瘢痕组织外有β-catenin核聚积的肝细胞(B类数据未显示），如果通过肿瘤细胞分化重建正常肝组织，则可能会出现这种情况。
肝癌消退后复发。将八个月大的LAP-tTA/TRE-MET 3号系荷瘤小鼠置于多西环素(E类，虚线；n个=18）或继续正常饮食(E类，实线；n个=15），然后继续进行剩余的实验或在6个月后死亡(A–D和F类). (A–D)H&E染色后，用显微镜对处死小鼠的肝脏进行切片和分析(A类和C类)或用抗β-catenin抗体进行免疫组化(B类和D类). (A类和B类)假定的残留肿瘤细胞（箭头）嵌入正常薄壁组织附近的疤痕组织中。(C类和D类)来自复发性肿瘤结节的细胞。(E类)给药多西环素（黑箭头）后，分析荷瘤小鼠的存活率。(F类)对具有针对所示抗原的抗体的肝脏裂解物进行Western Blot分析。车道1，来自LAP-tTA/TRE-MET第3行复发肿瘤小鼠的非肿瘤组织；2-4道，LAP-tTA/TRE-MET 3号线小鼠在强力霉素存在下维持1年的复发肿瘤；车道5，野生型FVB/N控制；通道6，非来自在缺乏强力霉素的情况下维持的LAP-tTA/TRE-MET第3行小鼠；第7通道，来自LAP-tTA/TRE-MET第3行小鼠的HCC，该小鼠在没有强力霉素的情况下保持。
尽管在HCC消退后继续使用强力霉素遇见转基因小鼠在几个月内开始死于复发性肿瘤(E类). 复发肿瘤表现为HCC的组织学表现，并有β-连环蛋白的核蓄积( C类和D类). 对复发性肿瘤裂解物的Western Blot分析表明，磷酸化和非磷酸化Met均不存在(F类). 我们得出结论遇见即使存在突变，转基因也足以诱导肿瘤退化ctnnb1型肿瘤的最终复发可能是由于某种程度上补充了Met的缺失。
我们尚未确定转基因动物使用强力霉素时HCA是否退化。
讨论
肝脏肿瘤发生的不同途径。
我们对转基因小鼠的研究提供了相关证据，证明肿瘤发生是由遇见可能会采取不同的途径，这取决于两种自发发生的遗传事件中哪一种最先发生：β-catenin激活或HNF1α途径失活。我们能够通过将外源基因通过流体动力转染引入成人肝脏来证实这一结论。利用适当的致癌基因组合进行流体动力学转染，可以快速产生大量肿瘤，这表明在这种实验环境下，几乎不需要额外的合作事件来产生肝肿瘤。
自发激活突变的一致性ctnnb1型发现于由遇见转基因可能反映了Wnt信号通路作为合作者的强大选择遇见在肿瘤发生过程中，β-catenin的激活在某种程度上有利于肿瘤的选择。我们在人类HCC中也遇到了类似的活化Met和β-catenin配对，尽管这并非不可避免，但这一对应关系证明了小鼠模型的真实性。
为什么β-catenin基因的突变在与Met的致瘤协作中特别受欢迎？一种可能性是，这些突变增强了MET和β-连环蛋白之间的直接生化相互作用。的确，遇见据报道直接磷酸化β-连环蛋白，从而促进其活化(24,25). 然而，这里描述的突变已知可以独立激活β-连环蛋白，因此Met和β-连环蛋白的信号传导似乎同样可能是在肿瘤发生中协同作用的自变量，原因尚不清楚。
组织病理学改变由遇见转基因的发生顺序为：先增生，后异型增生，最后HCC。我们不能明确地得出结论，每种形态损伤都是从这个序列中的前一种类型衍生而来的。然而，形态学损伤的时间顺序与Met和β-catenin的顺序激活很好地平行，这两者都存在于最终的HCC中。这一形态序列也让人联想到实验性化学致癌作用在肝脏中的表现(26). 此外，前瞻性研究表明，患有肝病的人在异型增生结节内发生HCC(27). 尽管如此，这些癌前病变进展为癌症的可能性的确切证据仍有待于适当的血统追踪实验。HCC和HCA可能由双潜能肝干细胞、肝细胞祖细胞或成熟肝细胞引起，但目前尚不清楚同一类型的细胞是否会导致这两种类型的肿瘤。
人类肝脏肿瘤发生的途径。
在我们的分析中，大多数具有活化β-连环蛋白的人类HCC也含有活化的Met。然而，在人类肝癌的一个子集中，β-catenin在缺乏活化Met的情况下被激活。显然，除Met激活外，一个或多个事件也可以在肝肿瘤发生中与β-catenin合作，尽管这样的事件可能只是影响Met控制的信号通路中的一个元素，从而创建Met活性的现象。对复发肿瘤的分析可以提供一种或多种此类事件的信息。我们的研究结果表明约20%的人肝癌可能是通过Met和β-catenin的协同作用而产生的，β-catentin是一个亚群，可能与最近被描述为表达Met特征的HCC亚群相对应(28). 这意味着这种合作只是导致人类肝癌的几种途径之一。这里研究的转基因模型偶然模仿了使用Met和β-catenin的特定途径。该模型可用于针对Met或Wnt信号通路的治疗药物的临床前测试。
最近的一份报告描述了HCA的一个亚群，该亚群特别容易发生恶性进展，并且基因编码的β-连环蛋白也存在突变(29). 我们的HCA转基因模型显然代表了人类HCA的另一个亚群，该亚群不趋向于进展，并且在基因编码的β-连环蛋白中没有突变。新描述的人类HCA的癌前亚群可能类似于癌前增生异常病灶，其具有驱动恶性行为所必需的部分但不是全部突变。
小鼠模型中肿瘤退化的治疗意义。
如前所述(10)，由转基因引发的肿瘤遇见尽管持续存在突变，但当转基因失活时会退化ctnnb1型在退化部位的瘢痕中残留着含有活化β-catenin的异常细胞小病灶。我们推测这些是由于缺乏Met活性而进入休眠状态的残留肿瘤细胞。以前有报道称，在存在假定的协同突变的情况下，各种肿瘤可能会退化，但这种突变的存在和身份尚未确定(30). 然而，一些肿瘤在存在协同癌基因的情况下不会退化(31). 似乎退化的可能性可能因组织类型和参与肿瘤发生的单个癌基因而异。
肝细胞癌灭活后的消退遇见转基因有助于证实Met是治疗人类肝癌的潜在靶点。此外，我们的结果定义了一组人类HCC，这些HCC可能容易接受针对Met和Wnt信号通路的联合治疗。在小鼠中HCC的最终复发，而不重新激活遇见转基因突出了两点。首先，靶向治疗的耐药性可能是由于绕过肿瘤对治疗靶点的最初依赖性，而不是靶点的突变。第二，在人类肝癌的治疗中，任何使用甲硫氨酸作为靶点的努力都应该考虑到联合治疗的必要性，以降低复发的可能性。
方法
老鼠。
以肝脏特异性方式表达tet反式激活因子（LAP-tTA）的转基因小鼠与表达野生型人类的转基因小鼠交配遇见在四环素反应元件（TRE-MET）的控制下生成双转基因小鼠（LAP-tTA/TRE-MET）(10). 所有小鼠均处于FVB/N背景。以LAP-tTA窝鼠或FVB/N小鼠为对照。在食物中施用多西环素（200 mg/kg）以抑制转基因表达。按照描述通过PCR进行基因分型(10).
流体动力学转染。
程序如前所述(16–19). 将10至50微克编码睡美人转座酶的质粒和含有致癌基因的转座子以1:25的比例稀释在2.5毫升过滤过的0.9%氯化钠中，然后注射到6至8周龄FVB/N小鼠的侧尾静脉中（查尔斯·里弗育种实验室，密歇根州波塔奇）。
组织学。
处死动物，取下肝脏并在PBS中冲洗。一块在液氮中冷冻，用于制备裂解物，另一块在新鲜制备的4%多聚甲醛中固定过夜。然后将固定组织样本在PBS中清洗三次，并保存在70%的乙醇中，直到将其嵌入石蜡中。将五个微米的切片放在载玻片上，并用H&E染色。
免疫组织化学。
用二甲苯从未染色的载玻片中除去石蜡。然后，通过一系列洗涤，使载玻片重新水化，乙醇的百分比逐渐降低。抗原提取是在10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中进行的，方法是将其置于微波炉中高温加热10分钟，然后在室温下冷却20分钟。然后将样品置于3%过氧化氢中10分钟，以熄灭内源过氧化物酶活性。使用Avidin-Biotin阻断试剂盒（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）与山羊血清或鼠对鼠过氧化物酶试剂盒（Vector Laboratories，加利福尼亚州）进行阻断。一级抗体结合在室温下进行30分钟或在4°C下过夜。使用ABC-Elite过氧化物酶试剂盒（Vector Laboratories）和DAB底物试剂盒（Vector Laburatories）进行检测。用苏木精吉尔3（西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯）浸泡5秒钟进行反染色。抗体和稀释液如下所示：抗磷Met（Tyr-1234/1235）抗体（1:25；Cell Signaling Technology，Danvers，MA）、抗人Met（1:500；Zymed Laboratories，South San Francisco，CA）、抗AFP（1:1000；Dako North America，Carpenteria，CA），抗谷氨酰胺合成酶（1:500，BD Biosciences，San Jose，CA），和抗苯丙氨酸羟化酶（1:500；BD Biosciences）。
裂解液的制备。
通过提取冷冻肝组织样品并将其置于带有裂解缓冲液的组织研磨机中，裂解液由1%Nonide P-40、50 mM Hepes（pH 7.5）、150 mM NaCl、10%甘油、1.5 mM MgCl组成2，1 mM EDTA，183 mg/ml NaVO4100 mM NaF和蛋白酶抑制剂的混合物，包括亮氨酸蛋白酶、抑肽酶和Pefabloc（罗氏诊断公司，印第安纳波利斯）。均质后，通过离心法去除不溶性碎屑。然后对裂解产物的样品进行BCA蛋白质分析（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德）。
免疫沉淀。
对于每个样品，将10μl抗磷酸酪氨酸抗体（4G10）添加到200μl裂解缓冲液中的1 mg蛋白质中，并在4°C下放置在摇杆上过夜。将12微升蛋白G珠添加到每个样品中，将其置于摇杆上，在4°C下放置1 h。用1 ml裂解缓冲液将珠洗涤三次，然后在50μl SDS样品缓冲液中煮沸；然后每个泳道加载20μl，并进行如下所述的Western印迹。
Western Blot分析。
对50微克蛋白质样品进行SDS/PAGE分析。蛋白质被转移到PVDF膜上，并用5%的牛奶封闭。一级抗体结合在室温下进行1小时或在4°C下过夜。检测由ECL（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）执行。抗体和稀释液如下所示：抗磷Met（Tyr-1234/1235）抗体（1:1000；细胞信号技术）、抗人Met（1:2000；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru，CA）、抗谷氨酰胺合成酶（1:5000；BD Biosciences）和抗ubulin（1:250；Abcam，Cambridge，MA）。
DNA序列分析。
用QIAamp Tissue Kit（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）提取肿瘤DNA，然后在以下条件下进行PCR：94°，5 min；35次循环，每次94°循环30秒，56°循环30秒钟，68°循环1分钟；然后将最后一步延伸至68°，持续7分钟。所有PCR均使用铂Pfx聚合酶进行测序。用作测序引物的PCR引物的序列为：小鼠BCAT ex2 F（ctgcccgtcaatatctgaaaa）、小鼠BCAT ex2 R（tcccatggactcatactgac）、人BCAT ex3 F（caatgggtcatactacagat）和人BCAT ex3 R（agtgcatgctatactctc）。
