GATA-3：一种意外的细胞系决定调节因子皮肤

中的缺陷GATA-3协议-无效胚胎皮肤

在牢牢掌握GATA-3的皮肤表达模式后，我们开始分析GATA-3协议-E18.5胚胎中的无表皮，最新阶段这些动物赖以生存。在此阶段，背部皮肤表皮成熟，大多数卵泡形态发生波已经启动。然而，因为E18.5胚胎中最成熟的卵泡是触须，我们从检查开始须垫。

在E18.5胚胎上可以看到对照窝友的触须，并且野生型触须切片的苏木精-伊红（H&E）染色显示成熟卵泡的形态特征(图3A)。在E18.5中为野生型触须，皮层前区被AE13抗体标记，表明毛发角蛋白表达(图。3Ai、Bi)。类似于出生后的卵泡，有几个细胞层从K6阳性伴细胞中分离出AE13阳性毛干细胞层（用括号标记的分隔图。3Ai，铋)。连续切片显示，正如预期的那样毛干和伴生细胞层之间是IRS细胞层毛黄蛋白抗体AE15阳性染色(图3Aii，Bii).

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图3。

触须卵泡由E18.5发育，但在GATA-3协议-无胚胎。E18.5野生型（WT）和GATA-3nlslacz（z/z）(GATA-3型-null）胚胎被冷冻分段（10μm）。两个野生型的序列段（用i、ii、iii表示）毛囊(A、 B类)和两个KO卵泡(C、 D类)如图所示。切片进行H&E染色(A类——D类)或三重间接免疫荧光显微镜使用下右每个框架的。颜色编码反映用于检测的次级抗体。中的括号艾岛和Bi公司表示头发皮层之间的间隙（红色，AE13）和伴生细胞层（绿色，K6）。该缺口代表IRS（红色，AE15；艾伊和Bii公司)夹在同伴之间野生型卵泡的层和皮层。在KO滤泡中，AE15染色是大部分缺失，K6和AE13染色彼此相邻。胚胎KO卵泡的其他异常包括结节性增厚在触须轴上（标有星号；C类)，不规则ORS中的凸起（例如，双头箭头；D类)，和一个缩写，鳞茎处直径增大的弯曲毛囊。图像显示为20×放大倍数。面板由两个或三个微观场组成。(E类)屏障功能分析。整个胚胎的能力排除蓝染料用于检查正常获得的表皮屏障从E17.5开始，到E18.5完成。注意完全渗透代表性蓝色染料GATA-3协议-无效E17.5胚胎，与大小相当的E17.5野生型胚胎，具有以下特征染料排斥的背侧模式。到E18.5，野生型和无胚胎基于此分析获得了屏障功能。然而，请注意与之相反，KO胚胎的口吻部没有长出胡须野生型室友。

在E18.5中GATA-3协议-无触须，AE13（毛发角蛋白）阳性细胞似乎直接毗邻伴生细胞层的K6阳性细胞(图3Ci、Ciii、Di、Diii)。由用AE13和AE15抗体交替染色连续切片显然，具有IRS特征的AE15阳性细胞要么缺失，要么严重减少GATA-3协议-无E18.5触须(图3Cii，Dii)。此外，AE13阳性毛干和相关的前体层似乎是在中展开GATA-3协议-相对于野生型卵泡的空卵泡（参见AE13染色图3Ai和in3Ci、Ciii、Di、Diii)。所有触须都有这些异常，无论其在GATA-3型-零晶须垫（显示了两个示例）。

形态学畸变GATA-3协议-无触须滤泡包括非典型弯曲形状、奇怪的结节状增厚（星号为图3C)和不规则ORS和灯泡的厚度(图3C，D类)。这些扰动在皮肤表面表现为延迟喷发GATA-3协议-相对于野生型触须为零竖井(图3E，请参阅插图）。

在E18.5皮肤的其他部位，几乎没有发现差异。作为衡量表皮功能、E18.5敲除（KO）胚胎能够排除蓝色染料，表明表皮屏障完好无损(图3E)。E17.5分析胚胎显示屏障功能获得稍有延迟年龄更早，根据蓝色染料完全渗透判断GATA-3协议-相对于仅部分穿透的零蒙皮野生型E17.5皮肤(图3E).然而，总的来说GATA-3协议-空整个E18.5胚胎的表皮与野生型表皮大体相似(图4)。因此，基础（BL），棘层（SL）、颗粒层（GL）和角化层（CL）均存在尺寸和厚度相当。野生型和KO表皮显示正常基底层角蛋白5、基底上层角蛋白1和晚期分化标记物involucrin、loricrin和丝聚蛋白。

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图4。

表皮的经典形态学和生物化学特征分化是正常的GATA-3协议-没有动物。面板来自E18.5野生型枯落物(左边设置）和GATA-3协议-空胚胎(正确的设置）。(A、 B类)背部皮肤被固定用甲苯胺对Epon、包埋和半薄切片（1μm）进行染色蓝色。注意基底（BL）、棘（SL）、颗粒（GL）和角化（CL）层，在野生型和KO之间基本相似皮肤。还应注意野生型和KO远洋毛囊（HF）的相似性，在这个阶段还没有开始区分为轴、IRS和ORS。(C类——J型)E18.5背部皮肤的冷冻切片用DAPI标记细胞核进行三重间接免疫荧光以及以下抗体：K5标记表皮基底层；K1和invlucrin（Inv；在小鼠皮肤中，Inv比在人类皮肤中更为基底上）标记棘层；filaggrin（Fil）和loricrin（Lor）标记颗粒层（Fil检测预处理和处理的filaggrin）。类似正常生化观察移植的成熟表皮的染色模式KO和野生型皮肤。

IRS和毛干分化的形态学和生化标志出生前背部皮肤基本上不存在图4A、B)。缺乏公开性即使是最年长的人背部皮肤也会出现异常GATA-3协议击倒对手胚胎解释了为什么这些皮肤缺陷之前没有被发现动物(Lim等人，2000年).

植皮术显示产后发育存在严重缺陷属于GATA-3协议-无毛发

E18.5中的选择性异常GATA-3协议-空触须可归因于GATA-3在触须中的特殊作用或他们的早期发展。此外，鉴于GATA-3在造血和CNS/PNS发育中，头发可能卵泡缺陷可归因于间接效应而非自主效应。为了区分这些可能性，我们移植了全厚度E17.5皮肤来自GATA-3协议-空白和野生型同窝胚胎收件人数值/数值老鼠。带有数值/数值突变是缺乏T细胞，不能排斥移植物，导致免疫功能受损。他们还几乎没有所有外部毛干形成，但为野生型GATA-3协议(弗拉纳根1966;Nehls等人。1994;Segre等人。1995).

当移植后7天从受体小鼠身上取下绷带时，毛干在野生型移植物上已经很明显，但在GATA-3协议-空移植物(图。5A、B级; 所示示例为植入后第9天）。嫁接是每天进行监测，在所有6个移植物中，KO皮肤始终未能开发野生型移植物展示的厚毛(图5C–F)。相反，KO移植物长出了短的“残茬”，未能发展成普通毛发(图。5D、F).

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图5。

GATA-3协议-空白皮肤移植会产生异常的毛发。完全六种野生型和六种厚皮GATA-3协议-空（KO）E17.5CD-1白化胚胎移植到数值/数值老鼠。之后9天植入后，所有野生型移植物中均出现毛发（白色）(A类)但是全部缺席GATA-3协议-空移植物(B类)。在27–29天之前，所有野生型移植物上都长出了厚厚的毛发(C类和E类展示两种不同皮肤移植的典型示例野生型动物），但KO移植物只产生短粗的毛发(D类和F类显示皮肤移植物的代表性例子两种不同的KO动物）。三种主要的头发类型（锥子、护发和Z字形）在从野生型移植物中拔出的毛发中很明显（示例如所示G公司)12周后漂流。相反，头发相等的GATA-3协议-空移植物（典型示例如H（H）)不符合这些分类，而且又短又厚而非野生型竖井。(一、 J型)扫描电子显微镜（SEM）分析。野生型和KO移植皮肤表面的SEM（600×）12周后漂流。每个发干的外表面是角质层层，在野生型但不是KO小鼠中高度有序。注释轴中的其他不规则性，详细反映了差异以较低的放大倍数记录。

在野生型移植物中，所有三种主要的毛发类型，包括锥子、护发和锯齿状的毛发，很容易通过显微镜检查发现毛发(图5G)。相反，头发来自GATA-3协议-空白移植物较短且较宽，不会脱落任何标准分类(图。5小时)。根据扫描电子显微镜判断这些毛发中有很多是不规则的。野生型毛囊显示“瓦状”图案，具有扁平角质层细胞的特征构成正常发干的外层(图5I)。虽然平坦KO轴中存在角质层细胞，其组织高度发达不正常的(图5J).此外，KO发干较短，直径较大与野生型相比不规则。结节、隆起和向内弯曲GATA-3协议-空头发与下面的毛囊缺陷平行胚胎的皮肤表面GATA-3协议-没有触须毛囊（参见图3).

毛干和毛干前体细胞的扩张GATA-3协议-无毛囊

皮肤移植使我们能够检测成熟的远洋毛囊中的毛囊蛋白，充满毛干。免疫荧光分析显示表达严重异常毛囊内蛋白质的模式GATA-3协议-无皮移植(图6)。根据AE13判断染色（红色）以检测发干的皮层角蛋白，GATA-3协议-空卵泡显示出明显扩张的皮层前区和皮质与野生型移植物的比较(图6A–D)。这些Lef-1阳性的大量增加进一步证明了这些差异KO与野生型卵泡皮质前细胞核的比较(图6E、F)。此外，还有是表达毛黄蛋白的分化髓质细胞的扩增（用in表示图6F; cf.重量在里面图6E)，被侧翼包围通过AE13阳性皮层（参见图6C和6F)。超微结构分析后来证实了这些细胞是髓质，而不是IRS细胞的错位核心。

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图6。

成熟GATA-3协议-无毛囊显示出扩张的皮层和髓质和严重减少的内根鞘。(A类——J型)E17.5中匹配的P35皮肤移植GATA-3协议-对空窝（KO）和野生型同窝仔进行冷冻和切片（10μm），并进行三重间接免疫荧光显微镜检查。大多数毛囊处于毛发周期的生长期。这个上面的正确的表示皮肤的基因型。使用的抗体在每个框架和根据用于检测的二级抗体进行彩色编码。DAPI用于标记细胞核，AE13用于标记皮质角蛋白，AE15用于标记IRS和髓质毛酰蛋白，抗K6，用于伴生层和髓质（此抗体不检测IRS-K6角蛋白），Lef-1标记皮层前细胞。表示AE13-阴性、AE15-阳性的宽条纹细胞，与毛干中心的髓质相对应。请注意突变体中扩张的Lef-1阳性前皮质和AE13-阳性皮质毛囊。括号表示AE15-阳性IRS，KO中基本没有毛囊。箭头表示AE15-阳性IRS的最低范围染色。

分化IRS细胞稀少，但IRS扩张前体细胞GATA-3协议-空皮肤

皮质和髓质细胞的增加与缺乏用AE15抗体标记的分化IRS细胞。因此，与AE15染色的野生型IRS的两条强健条纹形成对比抗体（用括号表示图。第六版)，仅检测到少量AE15-阳性KO IRS细胞（支架在图6F).此外，这些生化上看起来是IRS的残余物是总是在卵泡球上方和卵泡起始处髓质分化（见中箭头图。第6页)。相比之下，野生型移植物的IRS分化始终在灯泡底座附近的水平面上启动，可比较Lef-1阳性的皮层前体细胞，远低于鉴别髓质（箭头图。第六版).

尽管缺乏毛黄蛋白阳性的IRS细胞GATA-3协议-缺失移植皮肤，K6阳性伴层出现大小和位置基本正常(图6G–J)。然而，而野生型卵泡中的伴生层位于卵泡两侧AE13-阴性/AE15-阳性IRS电池（用括号标记图6G，I)，它位于KO滤泡中的AE13-阳性/AE15-阴性皮质细胞(图6H、J)。总的来说，这些这些结果提供了额外的证据，说明分化的IRS细胞在很大程度上在中缺席GATA-3协议-滤泡为空。

我们被大量Lef-1阴性的存在所吸引Lef-1阳性皮质前体细胞周围的上皮细胞毛球的底部(图。第6页)。这些Lef-1阴性细胞可能是IRS前体细胞吗？收件人为了检验这种可能性，我们利用了功能性LacZ编码从下游插入的序列GATA-3型KO发起人动物。之前，我们已经表明GATA-3nlslacZ协议^+/-卵泡显示β-半乳糖苷酶活性模式平行于两行抗GATA-3免疫反应，将IRS的赫胥黎和角质层（参见图2)。我们现在跟踪了的表达模式GATA-3协议条件下的启动子活性其中GATA-3蛋白缺失。令人惊讶的是，GATA-3协议-无毛囊显示了GATA-3协议-促进剂活性（β-gal阳性）细胞(图。7)。因此，与野生型卵泡中的两排整齐的卵泡不同(图7A)，广泛GATA-3协议卵泡细胞内检测到启动子活性GATA-3蛋白缺乏卵泡球(图7B、C)。其中大多数细胞AE13阴性(图。7摄氏度)和AE15染色（参见图。6)。因此，他们的位置和表达模式都不是与皮质前身份一致。

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图7。

皮层和IRS表达模式的扩展和异常前体人群GATA-3协议-滤泡为空。匹配的皮肤P35野生型和GATA-3协议-将空白移植物冷冻、切片（10μm），并进行三重间接免疫荧光(A类——K（K）)或原位杂交(五十、 M（M）)。这个每个部分的基因型在右上角.使用的Abs为彩色编码并在底部每个框架的。星号在里面B类和我表示自动荧光，是结的伪影在一些KO轴中使用高度角化的材料。方框区域显示在放大倍数更高插入.DAPI（蓝色）表示细胞核。防抱死制动系统反对GATA-3，存在于IRS血统中，而不存在于GATA-3协议-空截面；β-半乳糖苷酶（Bgal），针对GATA-3型启动子活性，与野生型卵泡中的抗GATA IRS标记KO卵泡IRS前体扩增群体；AE13，特定于分化皮质细胞角蛋白；FOG1，GATA-3的共加压剂蛋白质，存在于IRS前体细胞中，标记了野生型，但KO细胞的细胞质(D类和E类,分别；看见插入到E类以及）；Lef-1，特定于皮层前体细胞，在KO中扩张；Ki67，增殖特异性细胞核；和K5，针对卵泡的ORS。cRNA探针是反对嘘，Sonic hedgehog，标记矩阵的一小部分野生型滤泡中的细胞，KO滤泡中无变化。注意，在KO中毛囊、一些AE13阳性的皮质细胞和Lef-1阳性的皮质前细胞对GATA-3协议启动子活性（代表性细胞由中的箭头指示C类和G公司)。还应注意Ki67标签确认野生型和KO卵泡的生长状态，以及一些Ki67阳性细胞对GATA-3协议发起人活动(J、 K（K）).

搜索可能具有这些特征的标记GATA-3协议-启动子活性的球细胞，我们检测了FOG1的表达(F类朋友o（o）如果G公司ATA公司-1)，通常与包括GATA-3在内的GATA因素共同作用，以压制GATA作为激励器(Tsang等人，1997年;Zhou等人，2001年).有趣的是，在野生型卵泡中，一种抗FOG1抗体标记了相同的基因用GATA-3抗体标记的两层IRS(图7D)。抗体GATA-3和FOG1均定位于这些野生型IRS前体的细胞核细胞。在GATA-3协议-无卵泡，抗FOG1与扩张区的抗β-半乳糖苷酶抗体GATA-3协议-启动子活性细胞(图。第七版)。然而，在没有GATA-3的情况下，反FOG标签发生了变化从细胞核到细胞质(图。第七版，插图），开启了GATA-3和FOG-1可能在IRS规范中的某个点上一起运行。增加的人口Lef-1阳性皮层前细胞GATA-3协议-无毛囊令人感兴趣，并表明IRS和皮质祖细胞。然而，考虑到发干的显著畸变，我们想知道IRS和皮层前体细胞的扩大隔室是否真的很正常。更仔细地检查GATA-3协议-启动子活性细胞发现了一些细胞核对这两者都呈阳性的细胞β-半乳糖苷酶和皮质角蛋白（示例以箭头标记放大的照片图7C).相反，一些Lef-1阳性的皮质前体细胞也β-半乳糖苷酶阳性(图。7克，放大照片中的箭头表示单元格示例表达Lef-1和β-gal）。这种生化标记的混合在野生型卵泡中未见Lef-1阳性的皮质前细胞在表达模式上与GATA-3/雾1/GATA-3协议-启动子活性IRS前体细胞（图。​（图2C，2摄氏度,​，第7页第7页).

鉴于前驱体隔间的扩展GATA-3协议-无IRS以及大脑皮层，我们检查了基质细胞的状态，这些细胞被认为是上升到这些前体种群。在野生型和KO卵泡中，抗增殖核抗原Ki67的抗体显示生长期基质细胞快速增殖的标记(图7H，I，绿色）。总的来说，野生型和KO中Ki67阳性细胞的数量相似毛囊。

最后，我们检查了Sonic hedgehog（Shh）的状态，它是卵泡形态发生通常在基质的小区域表达单元格(Gambardela等人。2000)。CCATT盒位移缺陷突变小鼠系数，CDP，嘘mRNA不存在于该区域，相反在IRS对应的区域激活(Ellis等人，2001年)。因为CDP和GATA-3协议我们评估了突变导致IRS异常在没有GATA-3的情况下，是否也可能发生这种监管不当。作为如所示图7L和M，的的表达式嘘mRNA在GATA-3型突变卵泡。这个和其他的意义下面将更详细地讨论差异。

组织学和电子显微镜

用于免疫荧光和H&E染色的组织被嵌入OCT然后立即在干冰上冷冻。扫描电子组织显微镜（EM）在室温下固定在PBS中的2.5%戊二醛中>1小时，使用标准技术处理(Fujiwara等人，2002年)、和使用JEOL JSM-35扫描电子显微镜观察。用于变速器EM，样品固定在2%戊二醛、4%甲醛和2 mM中氯化钙₂在室温下，在0.05 M二甲氨基甲酸钠缓冲液中>1小时，按照说明进行Epon嵌入处理(Segre等人，1999年)。样品用Tecnai G2透射电子显微镜观察。

现场分析

根据制造商的说明（罗氏）。全贴装原位杂交描述为Conlon和Rossant(1992)，使用修改(Byrne等人。1994)。10-μm（Shh）和15-μm的原位杂交（GATA-3）冷冻切片按所述进行(Schaeren Wiemers和Gerfin Moser1993).

X-半乳糖染色和免疫荧光

OCT切片在0.1%戊二醛中固定30秒，清洗三次在PBS中培养2次，并在37°C的X-gal染色溶液中培养1–2 h。然后将OCT切片固定在PBS和4%PFA中10 min在PBS中清洗四次5分钟。用小鼠单克隆抗体染色时抗体，我们使用了MOM Basic试剂盒（Vector实验室）。在其他情况下，使用以下块/稀释剂：2.5%NDS，2.5%PBS中的NGS、1%BSA、2%明胶和1%Triton X-100指示浓度为AE13（小鼠，1:50–1:100；Lynch等人，1986年)，AE15（小鼠，1:10；O'Guin等人。1992)，K5（gp，1:250；Fuchs实验室），GATA-3（小鼠，1:100；圣诞老人Cruz，HCG3-31），β-半乳糖苷酶（兔子，1:400；小鼠，1:100；哈伦；Sigma）、K1（兔子，1:250；Fuchs实验室）、loricrin（兔子；1:300；Fuchs-lab）、，Lef-1（兔子，1:250；Fuchs实验室），聚丝蛋白（兔子，1:1000；Covance，PRB-417P），K6（兔子，1:500；Fuchs实验室），总苞醇（小鼠，1:200；Babco），Ki67（兔子，1:1000；NovoCastra Laboratories Ltd.）和FOG1（山羊，1:50；圣克鲁斯，sc-9361）。相关FITC或TxR结合驴或山羊抗体（1:100；Jackson Laboratories）用于检测原发性抗体。

屏障功能测定

将胚胎在37°C的1.3 mM溶液中浸泡8小时以上氯化镁₂，100 mM NaPO₄，3毫微米K（K）_三铁（CN）₆，3毫微米K₄铁（CN）₆, 0.01%脱氧胆酸钠、0.2%NP-40和1 mg/mL X-gal，调节至pH4.5（含HCl）(Hardman等人。1998)。在没有表皮屏障的pH值下溶液穿透表皮，内源性β-半乳糖苷酶样活性催化生成蓝色沉淀。

这项研究的一部分是在芝加哥大学进行的，其中，C.K.和D.B.注册为MD/博士生。我们感谢Frank Grosveld（荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学）GATA-3nlslacZ协议^+/+老鼠，琳达·德根斯坦和丽莎·波拉克T.T.Sun（纽约大学医学院）协助饲养老鼠针对AE13和AE15抗体，R.Cannon（北卡罗来纳大学教堂北卡罗来纳州希尔市），针对GATA-3调查，C.Tabin（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）Shh探测器和N.Lampen（斯隆-凯特琳纪念馆EM设施癌症中心）寻求扫描电子显微镜的帮助。C.K.和D.B。得到了医学科学家国家研究服务奖的支持，NIH/国家普通医学科学研究所，批准号5 T32 GM07281。D.B.还得到芝加哥大学生物科学，Naomi Ragins Goldsmith基金。K.C.L.由NIH支持授予GM 28896。E.F.是HHMI调查员。这项研究由国家卫生研究院的拨款。

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