在多细胞生物的发展过程中，生长是紧密的通过控制细胞数量和细胞大小来调节，使每个器官达到它的适当尺寸与生物体的大小有关。许多研究表明，生长和增殖是协调但不同的细胞只有在足够的条件下才能通过细胞周期已达到质量、大小和大分子生物合成。(Hartwell等人，1974年;Johnston等人，1977年;Weigmann等人，1997年).通过协调细胞周期进程和存活率，由营养物质可用性、生长因子和温度。生长因子可以通过以下方式刺激细胞分裂和存活激活胰岛素受体，而胰岛素受体又通过两个主要信号起作用转导级联：Ras/MAP激酶(Lee和McCubrey 2002)以及PI3K/Akt激酶途径(坎特利2002). 胰岛素介导的PI3K活化增加3′-磷酸化磷脂（PIP）三)发球作为第二个信使招募Akt进入质膜(Datta等人，1999年). 一次正确定位在膜上，Akt被磷酸化激活进而磷酸化一些下游靶点，最终调节细胞生长。例如，Akt通过以下途径刺激蛋白质合成雷帕霉素（TOR）激酶靶点的激活，随后磷酸化和灭活真核生物的翻译抑制因子起始因子4E结合蛋白（4EBP；Gingras等人，2001年).
除了调节翻译外，Akt还通过以下途径调节转录转录因子FOXO1、FOXO3a和FOXO4系列(汉堡和Kops2002)通过磷酸化这些蛋白质丝氨酸/苏氨酸残留。这导致FOXO转录的保留细胞质中的因子，从而下调特异性RNA合成靶基因(汉堡和Kops2002)影响细胞周期进展(Kops等人，1999年;Alvarez等人，2001年)以及细胞凋亡(Brunet等人，1999年;Dijkers等人，2000年)以及调节代谢基因(Ayala等人。1999;Durham等人。1999;Guo等人。1999;霍尔等人。2000;Nasrin等人。2000;Schmoll等人。2000;Nakae等人。2001;Nadal等人。2002). 因此，FOXO转录因子在调节细胞生长和存活。
最近的遗传学研究果蝇属和隐杆线虫病雅致表明InR/PI3K/Akt信号通路在很大程度上是保守的后生动物(). 在无脊椎动物，该途径显然在调节寿命以及身体、器官和细胞大小(Finch和Ruvkun 2001).秀丽线虫食物有限时可以进入达斡尔邦；什么时候条件改善，通过激活InR/PI3K/Akt刺激生长信号通路。在该途径中发生突变的蠕虫很小(Hekimi等人，1998年)，他们的器官的细胞更少，寿命更长。有趣的是转录因子DAF-16抑制这种表型(Lin等人，1997年;Ogg等人，1997年)，建议这个关键转录因子受到InR/PI3K/Akt的负调控通路(汉堡和Kops2002). 在果蝇属，dInR/dPI3K/dAkt途径也是调节体型和寿命的想法(). 苍蝇与异等位基因组合dInR公司突变减少因为细胞越来越小(Fernandez等人，1995年;Chen等人，1996年;Brogiolo等人，2001年).dInR/dPI3K/dAkt途径其他成分的突变产生类似的结果表型(斯托克和哈芬2000;约翰斯顿和格兰特2002;科兹玛和托马斯2002). 尽管特定基因靶点的身份和数量胰岛素信号通路果蝇属仍不清楚，一个胰岛素信号的重要下游效应器似乎是翻译抑制剂d4EBP(米隆等人2001年).
(A类)胰岛素受体信号通路在哺乳动物，秀丽线虫、和果蝇属. (B类)识别果蝇属FOXO/DAF-16同源物。顺序显示DNA结合中高度保守的排列FOXO4和dFOXO的结构域。三个保守的Akt磷酸化基序是方框中，可以磷酸化的氨基酸用黑体表示。星号表示相同的氨基酸；结肠标记保守氨基酸变化；点表示弱保守的变化。(C类)FOXO系列成员在螺旋2和3之间具有5-氨基酸插入DNA结合域，在其他叉头相关蛋白中缺失。(D类)针对重组C末端和N末端区域的抗体dFOXO识别出一个在果蝇属S2电池提取物。dFOXO的表示，表示抗体所用的片段生产情况如图所示在下面. (E类)胰岛素治疗产生用检测到的dFOXO的慢迁移形式（标有星号）内生（车道1,2)或过度表达（车道3,4)dFOXO公司。(F类)过度表达的dFOXO在胰岛素治疗后被磷酸化S2单元（车道2). 前用LY294002预处理样品胰岛素治疗减少磷酸化的dFOXO量（lane三). 胰岛素治疗后dFOXOA3未磷酸化（lanes4–6). 这个降低面板显示相同的示例磷酸酶处理后。一种表示野生型和突变型dFOXO的方案显示了在下面.
尽管dInR/dPI3K/dAkt通路在调节细胞中的重要性增长和增殖果蝇属，很少有人知道如何信号在dAkt下游控制(). 在C、。雅致和哺乳动物，Akt下游这条途径的关键成员是转录因子DAF-16/FOXO，可抵消胰岛素信号。然而果蝇属到目前为止，DAF-16/FOXO的当量还没有已描述。此外，用于提供InR通路的反馈调节是未知的。在这里，我们描述了克隆和表征果蝇属同系物DAF-16/FOXO。我们已经调查了dFOXO是否受dInR/dPI3K/dAkt通路，搜索下游靶基因，并分析dFOXO的生物学作用果蝇属。我们的研究结果表明dFOXO是一个关键的转录调控因子，控制下游靶点负责生长的基因以及上游反馈目标胰岛素信号通路。
结果
识别和克隆dfoxo公司
使用FOXO4或其DNA结合域进行的同源性搜索显示只有一个果蝇属与FOXO高度相似的基因转录因子。我们测序了几个cDNA克隆阅读框用计算出的分子编码613个氨基酸的蛋白质质量为67412.12 D。我们将该蛋白质命名为dFOXO。这个dfoxo公司该基因包含11个外显子，全长40kb。DNA结合域位于N末端区域，与人类FOXO4有45%的同源性（84%跨越构成叉头核域；).与FOXO家族其他两个成员FOXO1和FOXO3a的同源性为在DNA结合域中也很重要。所有四种蛋白质共享一个α螺旋2和α螺旋2之间的特征性五氨基酸插入（SNSSA）叉头域的3，它将此子集与其他子集区分开来叉头相关家庭成员(). 重要的是，Akt磷酸化的三个残基FOXO4在dFOXO中保守：FOXO4中的T28、S193和S258对应于T44，dFOXO中的S190和S259(，黑体字残留物）。定义基序的氨基酸Akt（RXRXXS/T）识别的(，盒装残留物）。dFOXO具有具有高Ser和Gln含量（11.7%和分别为13.4%），常见于转录激活域。
胰岛素处理S2细胞后dFOXO被磷酸化
针对N-末端或C-末端的兔多克隆抗体dFOXO区域识别果蝇属表观分子量为113 kD的胚胎提取物SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(). 确认该蛋白对应于dFOXO，我们表达了一个V5-epitope-taggeddFOXO在金属硫蛋白启动子控制下的版本。当这个铜2+-将诱导构建物转染到施耐德系2（S2）细胞，包括N端和C端抗体以及V5抗体特别识别的具有相同流动性的主要多肽（113 kD）这是在胚胎提取物中发现的（数据未显示）。因此，我们将这种113-kD蛋白命名为dFOXO。Western blot分析证实未转染S2细胞表达内源性dFOXO的水平与之类似在胚胎提取物中发现（数据未显示）。
如果我们鉴定出的dFOXO蛋白是哺乳动物FOXO，胰岛素应通过磷酸化作用调节其活性涉及Akt的级联(Brunet等人。1999;Kops等人。1999). 此外，三种特异性蛋白的磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基应将该转录因子隔离在细胞质。为了测试这些特性，S2细胞在有或无条件下生长Western blot分析检测胰岛素和内源性dFOXO。一张单人床N和未处理样本中的C末端dFOXO抗体(，车道1；数据不是如图所示）。相反，经胰岛素处理的样本显示存在两种一个迁移率为113 kD，另一个迁移速度较慢机动性(，第2车道，用星号标记）。用转染dFOXO-V5后在S2细胞中表达并用V5抗体检测(，参见车道4和3）。这些结果表明，慢迁移带可能对应于磷酸化形式的dFOXO。
建立胰岛素诱导的dFOXO缓慢迁移形式治疗确实是由dAkt催化的磷酸化引起的，我们构建了一个dFOXO的突变形式，其中所有三个推定的dAkt磷酸化位点（T44、S190和S259）突变为丙氨酸（dFOXOA3）。两种野生型（dFOXO-V5）和突变（dFOXOA3-V5）蛋白在S2细胞中表达。之后瞬时表达，细胞接受三种不同的处理同时：胰岛素(,车道2,5）；用LY294002（PI3K的一种特殊抑制剂抵消胰岛素的影响）然后进行胰岛素治疗(，车道3,6）；或否处理控制(,车道1,4）。从胰岛素处理的细胞中提取的提取物含有与对照细胞相比，野生型dFOXO迁移速度较慢(，上部面板，参见。车道2和1）。PI3K抑制剂LY294002的预处理降低了缓慢迁移形式的dFOXO数量(，车道3）。相反，三丙氨酸突变体没有观察到缓慢迁移的物种（dFOXOA3）比较对照组、胰岛素治疗组和LY294002+胰岛素处理样品(，车道4-6）。为了进一步确认缓慢迁移的dFOXO的形成是由磷酸化引起的，细胞提取物与小牛肠磷酸酶（CIP）。蛋白质印迹分析(，下部面板）显示dFOXO的缓慢迁移形式被定量转换为CIP处理后的113-kD形式。总之，这些结果表明dFOXO被胰岛素治疗磷酸化，这种磷酸化依赖于关于dAkt共有残基T44、S190和S259的存在。
胰岛素诱导dFOXO的细胞质定位
测试胰岛素介导的dFOXO亚细胞定位如何受到影响磷酸化，S2细胞表达野生型dFOXO或突变体dFOXOA3在无血清条件下孵育48h。然后加入胰岛素转染dFOXO的定位在用V5抗体染色。当S2细胞在没有血清和胰岛素，dFOXO和dFOXOA3主要存在于原子核(). 之后胰岛素治疗，dFOXO定位于细胞质(). 相反，突变体即使经过胰岛素治疗，dFOXOA3仍然是细胞核(). 这个结果是与dFOXO的亚细胞定位受调控的观点一致通过胰岛素。
(A类–D类)胰岛素调节细胞的亚细胞定位dFOXO公司。过度表达dFOXO或dFOXOA3的S2细胞在缺乏的情况下生长(A、 C类)或存在(B、 D类)胰岛素。(E类)阿克特磷酸化并抑制dFOXO活性。(顶部)S2细胞生长于用dFOXO（野生型（WT）通道转染缺乏血清/胰岛素的患者1,4]，dFOXOA3（A3，车道2,5)，或使用空向量（C，车道3,6). Myr-dAkt-V5在车道上被联合感染4–6. (底部)进行荧光素酶分析用上面的样品和一个含有四种FOXO4的报告员测量识别元素。(F类)胰岛素通过dAkt抑制dFOXO。细胞用dFOXO转染（泳道2,4)或dFOXOA3（车道1,3)和dsRNA对抗dAkt（车道1,2)或lacI公司（车道3,4)已添加。(底部)荧光素酶活性为使用与中相同的报告器测量E类.
dAkt磷酸化dFOXO并抑制其活性
接下来我们询问dFOXO磷酸化是否通过dPI3K/dAkt途径。我们使用了dAkt的组成型活性形式，其中肉豆蔻酰化信号已融合到dAkt的N端(Verdu等人，1999年). Myr-dAkt公司标记有V5表位的抗原表位在无病毒培养的S2细胞中进行共转染含有dFOXO或dFOXOA3的血清和胰岛素，以及磷酸化状态Western blot分析两种蛋白的表达。如果没有dAkt，dFOXO和dFOXOA3均未磷酸化(，上部面板，车道1,2). 当Myr-dAkt存在于细胞中时，dFOXO而非dFOXOA3变成即使在没有胰岛素的情况下也磷酸化(，上部面板，车道4,5). 这一结果表明Myr-dAkt可以磷酸化S2细胞中的dFOXO。为了评估Myr-dAkt对dFOXO磷酸化的影响，我们使用报告构建物包含四个串联FOXO4-结合位点驱动荧光素酶基因的醇脱氢酶远端核心启动子（pGL4xFRE）。在缺乏Myr-dAkt的情况下，与野生型或无血清培养的突变dFOXO构建物显示出可比性荧光素酶活性(,下部面板，通道1、2）。相反，当Myr-dAkt存在时，细胞与野生型dFOXO共转染显示荧光素酶活性减少了65%以上(，下面板，通道4），而突变型dFOXOA3的活性基本保持不变(，下部面板，参见通道2和5）。
上述结果表明胰岛素诱导dFOXO通过dAkt磷酸化，导致细胞质定位和dFOXO的转录失活。为了进一步确认胰岛素通过dAkt抑制dFOXO活性，我们进行了RNAi实验。S2电池转染dFOXO或dFOXOA3并与荧光素酶共同转染报告人pGL4xFRE在胰岛素存在下生长并用dsRNA处理针对dAkt。作为对照，dsRNA对抗乳糖阻遏物(lacI公司)已使用。正如预期的那样，dFOXO活性不受当细胞通过dsRNA处理耗尽dAkt时，会产生胰岛素，但实际上是在中被抑制lacI公司控制(，参见车道2和4）。这些结果证实了dAkt介导dFOXO的胰岛素抑制。
组成活性dFOXO的表达阻止细胞生长
对dInR/dPI3K/dAkt途径几个成分的研究表明胰岛素通过激活dPI3K和dAkt促进生长和增殖(科兹玛和托马斯2002). 我们已经表明，dAkt在胰岛素治疗后抑制了dFOXO活性(). 因此，我们想要了解dFOXO诱导是否会抑制S2细胞的生长。为此，我们培养了稳定转染dFOXO或突变dFOXOA3的S2细胞血清和胰岛素存在48小时，然后是外源性dFOXO和dFOXOA3用CuSO诱导表达4持续8小时。随后，Cu2+被删除，然后允许单元格每隔12小时取样测量细胞数，分为1周。细胞稳定转染以相同速度增殖的野生型蛋白不考虑dFOXO诱导(相反，细胞稳定转染突变蛋白dFOXOA3在与未经dFOXOA3诱导的相同细胞相比(, ▪, □).因为在这些实验中都存在胰岛素（灭活dFOXO但不是dFOXOA3），我们的发现表明，构成活性dFOXO3可以诱导细胞停滞。重要的是，表达dFOXOA3的细胞抑制生长在诱导后的第一个44小时内，当dFOXOA3存在时。44小时后，当dFOXOA3明显被移交时(，下部面板，68–164小时），细胞恢复并再次正常分裂(, □, 68–164h） ●●●●。FACS对不同时间点采集的样品进行分析表明S2细胞在G2/M时停止生长(; 数据未显示）。这些结果表明dFOXO的激活可以诱导细胞周期阻滞胰岛素可以减轻这种影响。
dFOXO抑制细胞生长。(A类)稳定转染S2细胞野生型dFOXO（•，○）或A3突变型(▪, □) 都长大了在胰岛素存在下。为了诱导dFOXO表达铜2+（○，□）。只有表达dFOXOA3的细胞在最初的44h内停止生长(B类)细胞提取物的Western blot从铜诱导的细胞中获得2+在里面A类. (C类)FACS在36小时后检测细胞G1、S或G2/M的频率铜2+添加（箭头在A类).
dFOXO激活dInR和d4EBP转录
上述结果表明dFOXO调节细胞周期阻滞可能是通过转录激活与细胞分裂有关的基因或在细胞生长中。作为识别dFOXO靶基因的初步尝试，DNA使用微阵列稳定评估S2细胞的基因表达谱转染突变dFOXO并在胰岛素存在下生长。细胞表达野生型dFOXO或未转染S2细胞治疗作为对照进行分析。
我们发现在表达dFOXOA3的细胞中，当与dFOXO表达细胞或未转染S2细胞相比。有趣的是，两个基因在这些基因中持续且特异性上调条件是dInR基因（13.5倍）和d4EBP基因（25倍；). 这两种基因与胰岛素调节细胞生长有关(Fernandez等人，1995年;Miron等人，2001年). 作为预期，实验控制基因如肌动蛋白或GAPDH保持不变在这些条件下(). 证实dInR和d4EBP是真正的转录因子针对dFOXO，我们进行了上述相同的实验，但在存在环己酰亚胺以抑制翻译。如预期，dInR和d4EBP继续被转录激活（2.5倍和3.1倍，dFOXOA3，而不是dFOXO。这个结果表明，当胰岛素/dAkt从控制中释放出来时，dFOXO级联，参与来自dInR和d4EBP启动子的转录。
dFOXO上调dInR和d4EBP。(A类)DNA微阵列检测到dInR和d4EBP为dFOXO的假定靶点。肌动蛋白和GAPDH控制保持不变。RNase保护证实了微阵列数据。(B类)核糖核酸酶保护显示通过以下途径快速诱导dInR信使dFOXOA3公司(C类)铜2+或胰岛素治疗本身没有诱导dInR的转录。在缺乏胰岛素的情况下，野生型和A3型突变体诱导dInR转录。在有胰岛素的情况下，只有A3突变体上调该mRNA(D类)PI3K抑制剂LY294002诱导dInR和d4EBP的转录，表明内源性dFOXO是对这种影响负责。对于所有面板，图形在下面表示对RNase保护执行的数据的量化实验显示在上面.
为了证实这些微阵列结果并独立地定量在mRNA转录增加的情况下，我们用从稳定转染dFOXO或dFOXOA3的细胞中提取的mRNA。事实上，dFOXOA3通过16.3-和分别为11倍。时间进程实验()确认dInRdFOXOA3表达后信使核糖核酸迅速增加：CuSO后3小时4此外，已经增加了8倍，在9小时后达到20倍CuSO公司4归纳。d4EBP也获得了类似的结果（数据不是如图所示）。
排除使用胰岛素和/或CuSO公司4本身会对dInR和d4EBP，稳定转染dFOXO或dFOXOA3的细胞在存在胰岛素或硫酸铜4或同时使用胰岛素和CuSO公司4(). 在胰岛素缺乏和硫酸铜的存在4dFOXO和dFOXOA3激活dInR和d4EBP转录(，3、4车道；数据不是如图所示）。然而，在胰岛素和硫酸铜的存在下4，只有组成活性dFOXOA3诱导这两个靶基因的转录(，7、8车道；数据不是如图所示）。在没有CuSO的情况下4，未看到激活(，车道1、2、5、6）。这些结果排除了胰岛素/Cu的可能性2+处理方式自身激活了这些基因的转录。相反，我们的实验表明dFOXO表达能特异激活dInR和d4EBP转录，从而揭示了这一过程中的重要反馈控制机制涉及dFOXO和dInR的通路。
获得外源转染dFOXO对胰岛素并调节下游靶基因d4EBP和反馈控制目标dInR，我们接下来想知道内源性dFOXO是否也会激活这些基因的转录。我们使用PI3K抑制剂LY294002激活内源性dFOXO或胰岛素使其失活用LY294002或胰岛素治疗48小时无血清状态。总计提取RNA并进行RNase保护以检测dInR和d4EBPmRNA。LY294002治疗后，两种mRNA水平均显著升高与胰岛素治疗相比（dInR为5.3倍，d4EBP为4倍）(). 此结果提供了进一步证据表明dPI3K–dAkt途径调节dInR和通过dFOXO的d4EBP转录。
dFOXO结合到d4EBP和dInR启动子并激活他们的转录
接下来我们想确定dFOXO是否直接与启动子结合d4EBP和dInR。确定dFOXO在这两个基因中识别的DNA区域启动子，我们插入了d4EBP启动子的1708 bp片段和1562 bp片段将dInR启动子片段转化为荧光素酶报告载体。什么时候？转染S2细胞后，这些片段对dFOXO激活产生反应（d4EBP为3倍，dInR为200倍以上；，2、6车道）。A系列缺失上游序列的缺失仍然对dFOXO激活有反应，尽管更弱(,通道3,4,7,8），表明dFOXO可以在靠近转录开始（d4EBP启动子为485 bpdInR启动子）。相比之下，dFOXO完全无法激活记者构建转录的上游激活序列（UAS）因子GAL4与荧光素酶基因融合（数据未显示），证实转录激活对d4EBP和dInR启动子都是特异的。
dFOXO直接激活dInR和d4EBP的转录。(A类)荧光素酶分析显示S2细胞中d4EBP和dInR启动子激活与dFOXOA3共转染后（白色条）。（黑色条）空矢量。(B类)用d4EBP和dInR启动子进行的带移表明重组dFOXO与这些启动子特异结合。(C类)dFOXO型在体内特异性结合到d4EBP和dInR启动子。交联的ChIP表达dFOXO或dFOXOA3的S2细胞提取物胰岛素。(D类)重组dFOXO激活d4EBP的转录（车道1–4)和dInR（车道5–9)发起人和含有4个FRE（车道）的合成促进剂10–13)体外试验。(E类)d4EBP和dInR启动子的示意图显示位于转录起始点上游的假定FRE（条纹框）站点（用箭头表示）。显示了带移中使用的探针在下面作为水平括号，那些受dFOXO约束的探针是显示为粗线条。粗横条表示DNA区域结合通过ChIP分析的dFOXO体内。
有趣的是，d4EBP转录起始位点上游125 bp启动子——假定FOXO4识别元件有三个串联拷贝（FRE；). 这些元素与人类葡萄糖-6-磷酸酶中存在的类似启动子，先前显示与FOXO4结合(Yang等人，2002年). 这是令人放心，因为dFOXO和FOXO4在核心叉头DNA结合域(). 类似地，dInR中出现了几个假定的FRE序列包含-1434至-70个核苷酸的区域中的启动子().
为了确定dFOXO是否与这些假定的FRE结合，我们进行了113-bp DNA探针包含d4EBP-FRE基序的移位实验并且有12个单独的DNA探针（100到150 bp）跨越一个区域来自dInR启动子的1.4 kb(). 纯化重组dFOXO大肠杆菌属大肠杆菌有效结合来自d4EBP的113-bp FRE片段发起人(，条车道1-4）与对照DNA片段比较(，泳道5-8）。此外，dFOXO与d4EBP启动子片段结合可以有效地与未标记的113-bp d4EBP启动子片段竞争(，9–12车道）但不含非特异性DNA(，13–16车道）。同样，纯化的重组dFOXO与dInR内12个DNA片段中的5个有效结合发起人(，条车道17–22; 数据未显示）。正如所料，五个DNA片段中的每一个dFOXO约束包含假定FRE。因此，dFOXO可以专门绑定到这两种启动子都在体外。为了确定dFOXO是否也结合这些相同的DNA我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验S2细胞表达dFOXO或dFOXOA3。细胞与添加CuSO可诱导血清和dFOXO的表达4.6小时后，细胞与甲醛交联，提取物制备并免疫沉淀。交联逆转后，DNA用包含以下区域的引物进行PCR两个发起人的推定FRE(). 我们的结果表明，dFOXO可以直接绑定到体内d4EBP和dInR启动子(，1、3、11车道；数据未显示）。相反，没有特定的d4EBP或dInR启动子片段使用免疫前血清或无关抗体(,泳道2,4,12）。使用U6 snRNA探针进行的对照实验启动子表明dFOXO与dInR和d4EBP启动子的结合是特异性的（未显示数据）。这些结果表明，dFOXO可以特异性地结合体外和体内的d4EBP和dInR启动子。
为了证明dFOXO可以直接激活这些基因的转录在体外，我们使用含有485 bp d4EBP的构建物启动子区和dInR启动子区的514bp。添加纯化的重组dFOXO体外反应激活这些启动子至少增加3倍（d4EBP）和5.5倍（dInR；，车道1、2、5、9），其中与体内观察到的活化情况相当(). 在我们的体外转录条件下，dFOXO激活d4EBP启动子随着dFOXO含量的增加而迅速饱和(，车道2-4）。作为预计dFOXO也会激活（最多六倍；，车道10–13）a含有四个FOXO4-结合位点的合成启动子位于乙醇脱氢酶远端启动子。这些结果表明d4EBP和dInR的转录可被dFOXO直接激活体外试验。
dFOXO调节器官大小果蝇属通过调节单元格编号
综合起来，我们的数据强烈表明dFOXO是胰岛素信号通路。正如预期的那样，dFOXO活性通过以下途径被抑制dInR/dPI3K/dAkt途径。我们还发现dFOXO激活该途径的主要下游靶点（d4EBP）的转录。在果蝇属，该途径与细胞大小和细胞数量有关监管。因此，我们想知道dFOXO在体内的表达是否会影响这些相同的参数。为了解决这一点，我们产生了转基因使用UAS/GAL4系统过度表达dFOXO的苍蝇(布兰德和佩里蒙1993). 什么时候？dFOXO的表达是通过使用无眼-GAL4(Hazelett等人，1998年)，眼睛变得比野生型小得多(). 有趣的是，眼睛尺寸的缩小（35%）是由细胞数量的减少（673）引起的对照眼为±24小眼，而对照眼为438±50小眼ey-GAL4/UAS-dFOXO)，但细胞大小没有显著变化观察到（对照组85.8±5.9个面积单位/小眼，对照组91.2±4.8面积单位/ommatidia英寸ey-GAL4/UAS-dFOXO). 当我们使用GMR-GAL4公司，引导细胞在形态发生沟(Hay等人。1994)，为了驱动dFOXO表达，我们观察到表型。许多小马丢了，剩下的小马缺少鬃毛，看起来杂乱无章，改变了眼睛的总体结构(). 这些结果表明dFOXO过度表达会严重影响眼睛。
dFOXO通过影响细胞数量来控制生长。(A、 B类)表达式dFOXO对苍蝇的作用是在不影响小眼尺寸的情况下减小眼睛尺寸。(A类)ey-Gal4公司/+. (B类)ey-Gal4公司/无人机-dFOXO. (C类)dFOXO在形态发生沟前的眼盘(GMR-镀锌4/无人机dFOXO)导致眼睛明显缩小小腹严重缺失。(D类–克)过度表达翅膀中的dFOXO只影响细胞，导致翅膀尺寸减小数字。值是以百分比表示的总平均面积。(D类)dpp-镀锌4/+ (100% ± 7.8%). 箭头表示受影响的区域司机。(E类)dpp-镀锌4/无人机-dFOXO(79.1% ±5.2%). (F类)MS1096-镀锌4/+ (100% ± 2.9%). (克)MS1096-镀锌4/无人机-dFOXO(60.4% ± 9.8%).(小时–K（K）)dAkt部分挽救了dFOXO表达式。(小时)GMR-镀锌4/+ +/+. (我)GMR-镀锌4/+UAS-dAkt公司/+. (J型)GMR-镀锌4/无人机-dFOXO+/+. (K（K）)GMR-镀锌4/无人机-dFOXO无人机-dAkt/+.
接下来，我们测试了dFOXO在其他器官过度表达的影响眼睛。我们使用dpp-GAL4型(斯坦林·汉普顿和霍夫曼1994)在包含的机翼区域直接表达dFOXO第三和第四纵脉(). 如预期，dFOXO过度表达导致隔间大小显著减小（20%；). 再一次，我们证实这种尺寸的减小是由于细胞数量的减少引起的但不包括细胞大小（对照组为71±7.5个细胞/面积单位vs.71±5.5个细胞/面积单位英寸dpp-GAL4/UAS-dFOXO). 异位dFOXO在机翼中的表达MS1096-镀锌4(卡普德维拉和格雷罗1994)机翼尺寸显著减小（40%；)，也是因为细胞数量减少，细胞大小无显著变化（70.6±对照组6.5个细胞/面积单位vs.74.8±11.8个细胞/单位面积MS1096-GAL4/UAS-dFOXO).
我们已经证明dAkt可以磷酸化S2细胞中的dFOXO并使其失活(). 我们想知道dAkt是否也抑制果蝇中dFOXO的表型效应。我们获得表达dFOXO、dAkt或两者的苍蝇(). 的确，dAkt表达部分挽救了dFOXO观察到的眼部表型()，显示它们在基因上相互作用。这些结果为这两者提供了进一步的证据作用于同一途径的蛋白质。
讨论
dFOXO对胰岛素信号通路的反馈调节
虽然人们对胰岛素调节信号了解很多哺乳动物和其他后生动物的转导途径步骤和机制仍不清楚。通过研究InR信号通路果蝇属并将注意力集中在关键的下游组件上，转录激活剂dFOXO，我们已经发现了其新的方面重要的信号级联。首先，我们描述了克隆和功能dFOXO的特性果蝇属DAF-16/FOXO的同源物，adInR/dPI3K/dAkt途径的转录调节因子。令人惊讶的是，dFOXO转录激活下游和上游目标信号级联，为转录反馈提供第一证据InR途径中调节细胞生长和增殖的机制。此外，我们发现dFOXO通过以下途径调节dInR信号通路转录激活此信号级联的两个关键元素：下游效应器d4EBP和dInR本身(). dInR的激活提供了一种有趣的方法，通过反馈调节回路，在发展。
(A类)dFOXO是胰岛素信号传导的关键元素果蝇属胰岛素受体通过以下途径使dFOXO失活dPI3K/dAkt。d4EBP的激活可以解释dFOXO对生长的抑制，而dInR的激活可能提供一种新的转录诱导路径的反馈控制机制。(B类)要解释的模型通过涉及dInR和dFOXO的反馈机制调节生长。
研究表明，发育过程中的生长调节取决于营养素的可用性(布里顿等人2002年)食物限制减少了果蝇属胰岛素样肽（DILP）水平(Ikeya等人，2002年;Rulifson等人，2002年). 安激活的dInR通路促进生长，而该通路中的突变损害正常发育。例如，苍蝇变种奇科,它对果蝇属IRS1-4的同源物是发育性的延迟，严重缩小体型，增加脂肪堆积(Bohni等人，1999年). 同样，dInR途径其他几个组成部分的突变产生相关的表型。我们发现dFOXO与dInR通过反应为细胞调节生长提供了一种新的机制迅速改变营养状况。当营养丰富时，分泌高水平的DILPs来激活dInR通路由此产生的下游信号通过抑制dFOXO促进生长。这些有利的营养条件将允许生长和发育(). 然而，在营养素受到限制的情况下，DILPs将在降低速率，dInR通路将不会被激活，dFOXO将保持不变去磷酸化、核化和活性。因此，生长将受到抑制，部分通过d4EBP的dFOXO激活。另一方面，因为dFOXO会当营养素受到限制时，dInR会上调并启动当DILP水平变化触发时发出信号。这样，当营养条件发生变化时，细胞会高度敏感，并能作出反应快速启动刺激增长的机制，包括关闭通过dAkt磷酸化降低dFOXO。此外，dFOXO介导的dInR转录激活是一种高度敏感的调节dInR/dPI3K/dAkt信号通路对细微发育线索的反应调节DILP水平。高水平的DILP会激活dInR会导致其自身转录受到抑制，从而关闭通路。相反，DILP水平降低会激活dInR转录。这将敏化该途径并提供一种机制通过检测较低水平的DILP来放大生长因子信号。一旦该途径被激活，通过dFOXO的反馈调节就会减弱dInR表达和信号传导。通过dInR途径生长发育因此，可以进行精细的平衡和监管。有趣的是，强启动子（GMR，tubulin）控制下dFOXO的过度表达苍蝇会导致严重的形态缺陷(; 数据未显示）。这些结果表明，异常高水平的dFOXO可能会导致生长发育中器官的阻滞。令人惊讶的是，功能丧失的苍蝇dFOXO突变似乎发展正常（M.Jünger和E.Hafen，pers.comm.），表明dFOXO在苍蝇发育过程中不是必需的。这些结果表明存在其他调节机制胰岛素信号转导并强调这种发育的复杂性路径。
dAkt通过以下途径抑制d4EBP活性并下调其转录dFOXO型
据报道，在哺乳动物中，Akt促进蛋白质合成通过TOR介导的磷酸化和随后的失活翻译抑制剂4EBP。低磷酸化4EBP与eIF4E，为Akt通过TOR调节4EBP提供了一种机制（Gingras等人。1998,1999). 在苍蝇中，类似的机制已被报道(Miron等人。2001). 相反，dFOXO在转录中的作用调制d4EBP之前没有描述。我们发现dFOXO直接调节d4EBP转录提供了一种替代性和平行性dAkt抑制d4EBP功能的机制。在以下条件下胰岛素途径活跃，dAkt在细胞质中隔离dFOXO和d4EBP转录被关闭。当dInR/dPI3K/dAkt途径不活动时，dFOXO可自由刺激d4EBP的转录并抑制蛋白质合成。以前有报道称4EBP的过度表达减缓哺乳动物细胞的生长(卢梭等人。1996)现在我们已经证明dFOXO过度表达导致生长停滞果蝇属S2电池。因此，很可能dFOXO上调d4EBP有助于观察到的生长停滞。然而，我们不能排除其他机制（即诱导dFOXO诱导的细胞凋亡），这也可能有助于观察到表型。
dFOXO调节细胞数量而不影响细胞大小
已经有充分的证据表明，dInR/dPI3K/dAkt通路调节细胞中的数字和单元格大小果蝇属然而，精确的机制胰岛素途径控制这些参数的机制尚不清楚。该途径某些成员的突变会影响细胞大小以及细胞数量，而其他成员的突变似乎只影响细胞大小。例如，两者的突变dInR公司和dPI3K基因生产细胞数量减少、细胞大小变小的小苍蝇(Leevers等人，1996年;Bohni等人，1999年). 突变在负极调节器中dPTEN公司产生更大的细胞并增加增殖(Gao等人。2000). 相反马克生产更小的器官不影响细胞数量，只影响细胞大小(Verdu等人，1999年).eIF4E结合亲和力增强的突变型d4EBP的过度表达产生细胞更小更少的苍蝇(Miron等人，2001年). 因此，到目前为止，还没有发现dInR途径的任何成分能够只调节细胞数量而不影响细胞大小。因此有趣的是发现dFOXO过度表达会导致细胞减少数量对细胞大小没有任何可测量的影响。这让人想起转录因子c-myc公司在哺乳动物中调节细胞数量不改变单元格大小(特朗普等人。2001)但在果蝇属影响单元格大小和数量(Johnston和Gallant 2002).综合来看，这些结果揭示了调节细胞生长和增殖的机制。事实上，我们的结果表明InR/PI3K/Akt途径远非简单的线性级联。相反，dAkt似乎管理着许多目标，每个目标都有自己的自己的一组下游效应器。此外，可以想象dFOXO可能被dAkt以外的激酶调节。在哺乳动物中，FOXO4已被证明受Ras/MAP激酶途径调节(Kops等人，1999年)、和苍蝇也可能存在类似的机制。有趣的是，我们的微阵列除了d4EBP外，实验还鉴定了200多个基因dFOXO上调（未显示数据），这增加了dFOXO影响的转录调控。其他研究将是必须确定胰岛素信号传递的多种机制级联决定后生动物身体发育过程中的细胞数量和大小计划。
材料和方法
构件，果蝇属菌株和抗体
克隆LD05569和LD19191包含dFOXO的完整cDNA（加入不。{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”AF426831“，”term_id“：”16755691“，”term_text“：”AF428831“}}AF426831型). dFOXO在pMTV5-HisA（Invitrogen）中克隆，得到pMTdFOXO。QuikChange（Stratagene）用于突变三种Akt磷酸化生产pMTdFOXOA3的站点。克隆SD10374包含全长dAkt在pAc5V5-HisA（Invitrogen）中亚克隆。安型钢混凝土肉豆蔻酰化信号通过PCR在N末端添加（MGSSKSKPK），得到pAcMyrdAkt载体。荧光素酶报告子pGL4xFRE通过插入ADH远端构建pGL3Basic（Promega）中的启动子（-42至+40）。四个FOXO4-结合位点添加了（AGTTTGTTTGTCGATTAAAAAA CATGTAAACACTTTTTTTGGATAAAAAAA）PCR上游。d4EBP启动子的DNA片段（-1460至+197）并通过PCR扩增出dInR启动子的1586bp DNA片段在pGL3Basic中克隆，分别产生pGLd4EBP1.6和pGLdInR1.5。这些DNA片段的更短版本是以类似的方式产生的。作为负控制，一个包含上游激活序列（UAS）的构造转录因子GAL4和E1B TATA序列采用荧光素酶报告基因。该结构被GAL4激活，但而不是通过dFOXO。所有结构均通过测序进行验证。
dFOXO-V5在pUAST载体中亚克隆，转基因果蝇通过将构造注入yw公司收件人。四建立了独立的线路。以相同方式注入UAS-dFOXOA3；然而，这种结构没有获得转化株系。w；UAS-dAkt公司苍蝇是莫里斯·伯恩鲍姆（霍华德·休斯宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学医学院；Verdu等人，1999年).y1 w*；重量（wg）Sp-1型/CyO；P{周+毫瓦时=GAL4-dpp.blk1}40C.6/MKRS（布卢明顿1553b）从布卢明敦库存中心获得。MS1096标准(卡普德维拉和格雷罗1994)是Y.Nibu（遗传和美国大学分子与细胞生物学系加利福尼亚州伯克利）。ey-GAL4(Hazelett等人，1998年)以及GMR-GAL4公司(Hay等人。1994)从L.Michaut（Biozentrum，University of巴塞尔、巴塞尔、瑞士）。
兔体内产生了针对氨基酸1-213和dFOXO的214–613。
细胞培养和提取物制备
果蝇属施耐德S2细胞（ATCC CRL-1963）生长于含有10%热灭活胎牛血清、青霉素、，和链霉素在25°C的悬浮液中。稳定转染的S2细胞在300μg/mL潮霉素（Clontech）存在下生长。去除血清从培养基中取出细胞，用磷酸盐缓冲液冲洗一次盐水（PBS）。然后在无血清的M3培养基中培养细胞至少48小时，然后，1×106在一个24孔板。胰岛素（1μg/mL；罗氏）溶于小时2溶解在乙醇中的O或LY294002（20μM；钙生物化学）操作前将细胞培养6小时。在，胰岛素是胰岛素治疗前，孵育40分钟，LY294002孵育10分钟。通过用PBS洗涤S2细胞并将其重新悬浮在被动裂解缓冲液（Promega）。
转染
用于转染，1×106S2细胞在24孔板。使用效应试剂（QIA-GEN）转染细胞。对于这是200 ng的表达载体（pMTdFOXO、pMTdFOXOA3或pMTV5-HisA），50 ng报告载体（pGL4xFRE、pGLdInR1.5或pGLd4EBP1.6）和50 ng使用pAcMyrdAkt（必要时）。pMTdFOXO或按建议（Invitrogen）获得pMTdFOXOA3，600μMCuSO公司4用于诱导dFOXO或dFOXOA3表达。
磷酸酶处理与蛋白质印迹
Western blot检测和磷酸酶治疗描述(Miron等人，2001年).用抗dFOXO（1:1000）、抗V5（1:5000；Invitrogen）、，或抗微管蛋白（1∶10.000；西格玛）。
免疫定位
在无血清的M3培养基中培养的S2细胞生长在盖玻片上孵育6h（±胰岛素）。用PBS清洗细胞，用2%固定甲醛在PBS中浸泡10分钟，然后用0.1%皂苷在PBS内渗透20分钟后，用抗V5抗体（1:5000稀释）对细胞进行染色抗鼠Alexa 488（1:200；分子探针）。细胞用含有DAPI（5μg/mL）的vectashield，在共焦显微镜下观察显微镜（LSM510，蔡司）。
细胞生长分析
稳定转染构建物pMTdFOXO或pMTdFOXOA3的细胞培养以0.5×10的速度播种6血清中的细胞/mL和胰岛素。CuSO公司448小时后添加，然后在另一个8小时，将细胞造粒并在PBS中洗涤再次造粒，并在含有血清和胰岛素的M3培养基中重新悬浮。在这里点后每隔12h计数细胞数。中的数据代表三个独立的实验。用V5抗体进行蛋白质印迹检测dFOXO或dFOXOA3水平的每个24小时时间点。FACS分析每24小时执行一次。简单地说，用PBS清洗细胞，在90%乙醇中固定，并保持在-20°C，直到所有样品收集。800个点的细胞数量相等μL PBS、100μL RNAse A（10 mg/mL）和50μL丙酸添加碘化物（1mg/mL）。细胞在37°C下培养1小时用Beckman-Coulter XL仪器进行细胞分析。
RNA干扰
dAkt的核苷酸850–1590或全长大肠杆菌lacI该基因在pCR4 Topo（Invitrogen）中克隆，并用T7和T3的RNApol。等摩尔量的每条RNA链通过在65°C下加热30分钟，并缓慢冷却至室温。然后是5在24孔板中每孔使用μg dsRNA。添加了dsRNA细胞在25°C下培养2天。随后，细胞被转染后，如前所述测量荧光素酶活性。
DNA微阵列
稳定转染pMTdFOXO或pMTdFOXOA3或未转染S2的细胞细胞在含有血清和胰岛素。CuSO作用6小时后4诱导，将细胞制成颗粒，以及用Trizol（Invitrogen）提取总RNA。从总RNA合成cRNAmRNA用于探测包含13500个Affymetrix基因芯片果蝇属抄本。必要时，环己酰亚胺（35μM）诱导后添加2小时，培养5小时。微阵列的所有步骤Affymetrix按照协议进行分析。dFOXO激活的基因被定义为dFOXOA3细胞中上调的基因，但在dFOXO或S2中未上调细胞。
RNase保护
使用RPAIII试剂盒（Ambion）进行核糖核酸酶保护试验。DNA包括d4EBP、dInR、肌动蛋白和18s rRNA通过PCR扩增并克隆到pBluescript II SK+（Stratagene）中用于体外转录；每个样品使用10μg总RNA。这个的实验是通过孵育dFOXO或dFOXOA3转染细胞来进行CuSO公司4加或不加胰岛素6小时，分析内源性dFOXO活性，在无血清条件下培养S2细胞48小时，然后加入胰岛素或LY294002，6小时后提取总RNA如上所述，通过RNase保护进行分析。
带移分析
用113 bp的DNA片段进行带移实验跨越d4EBP启动子的-190到-77个核苷酸。107亿英镑pBluescript SK II（介于Xba公司我和Xho公司I位点）被钝端并用作阴性控件。为了分析dInR，DNA片段-21-119，–94–194, –172–273, –249–369,–346–514, –488–627, –597–854,–828–980, –955–1128, –1103–1216,使用了-1193–1435和-1410–1586。结合按照描述进行反应(科尔曼和普格1997)带有标记探针（20 nM），增加重组纯化dFOXO的量（40–600 nM）和冷竞争对手（200 nM至2μM）。复合物是在4.35%聚丙烯酰胺（37:1）、2.5%甘油、1×TBE和4 mM上分解氯化镁2温度为4°C。
苍蝇分析、细胞计数和面积测量
所有测量均以女性为对象。拍摄了电子显微照片遵循标准协议(博佐拉和罗素1999). Ommatidia被计数为8个（突变型）或7个（控制）苍蝇。从每只眼睛中取出7只小眼，计算它们的使用Adobe Photoshop的直方图功能。对机翼进行了分析如所述(Miron等人。2001). 总共30个(dpp（数据处理程序）)和15(MS1096标准)翅膀计算两种表型。
