人类胚胎干细胞（hESCs）被认为能够无限增殖（即自我更新）在体外和体内从包括神经元在内的所有三个胚层分化为多能干细胞(1——三). 这使得人胚胎干细胞可能是人类神经元唯一稳定且遗传上易于控制的来源，它除了可能用于治疗目的外，在研究人类遗传背景下神经疾病基因的功能方面也可能是无价的(4). 然而，不同的人胚胎干细胞系是在不同的培养条件下从具有不同遗传背景的胚胎中建立的，这可能使人胚胎干系统及其衍生神经元具有不同的表观遗传和细胞特性，对其在再生医学中的应用具有明显的意义。然而，来自不同人类胚胎干细胞系的神经元的相对特性尚不清楚，这促使了本研究。
在这里，我们开发了一种方法，可以将人胚胎干细胞逐步转化为含有95%以上人类神经干/祖细胞（hNPC）的培养物。hNPC又被分化为含有70-80%人类神经元的培养物，与星形胶质细胞共培养后形成功能性突触网络。使用这些方法，我们比较了来自两个NIH注册的hESC系HSF6[XX，46，国立卫生研究院（NIH）编号UC-06]和HSF1（XY，46，NIH编号UC-01；参见http://stemcells.nih.gov/stemcell). 我们的研究结果表明，这两个细胞系在人胚胎干细胞阶段已经进行了不同的预编程，这表明并非所有人胚胎干系统都是平等产生的，这与以前对这些细胞的基因表达谱一致(5). 对不同人类ESC系的分化偏向和/或表观遗传学预编程的彻底理解将有助于在开发人类疾病模型的细胞替代疗法中使用hESCs，并使用hESC衍生的细胞进行高通量药物筛选。
结果
从HSF6 hESC系衍生hNPC和神经元。
在γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上，我们稳定地将HSF6 hESCs维持在遗传稳定、生化和形态未分化的状态[一,支持信息（SI）图6、和SI文本]，并使用类胚体形成或基质支持的单层培养物将hESC分化为人类神经干/祖细胞（hNPC）（参见SI文本). 在碱性FGF存在下，未分化hNPC随后扩增为≈95%NESTIN和SOX2阳性细胞(一和SI图7).
hNPC和神经元从hESCs衍生。(一)碱性磷酸酶（AP）和OCT4阳性HSF6 hESCs（Top）转化为NESTIN和SOX2阳性NPC，这些NPC也主要为PAX6阳性(中间和底部). （比例尺，100μm）(b条)hNPC的顺序神经胶质分化。上图示意性地说明了分化顺序，而四幅底部图像则描绘了在第2、4或8代分化4天的未分化的hESC和hNPC（分别为P2、P4和P8）。对细胞进行GFAP、MAP2和核染料Hoechst的三重免疫标记。（比例尺，100μm）(c（c）)以辐照小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）作为阴性对照，RT-PCR分析HSF6 hESCs和hNPC中标记物在指定传代数下的表达。(d日)培养小鼠皮层神经元的相控和免疫荧光图像（标记物染色）(右下角)和HSF6衍生的神经元处于V期(左上). (e（电子）)所示数据的代表性相位对比图像. (（f）)第IV和V期MAP2和GAPDH mRNA的半定量RT-PCR分析(克)定量III、IV和V期NPC和神经元培养物中Ki67-、SOX2-、MAP2-和TuJ1-阳性细胞的百分比。
在发育中的哺乳动物中枢神经系统中，NPC首先分化为神经元，然后分化为胶质细胞(6——8). 由于我们发现hNPC在hNPC转化后30–40天内开始分化为神经元，而长时间培养hNPC后出现胶质生成特性，因此hESC衍生的hNPC中保留了连续的神经胶质谱系分化( b条和c（c）). 基于hNPCs的顺序神经元-胶质细胞分化特性，我们开发了一种逐步神经元分化方案，该方案可重复地产生大量高度富集的人类神经元，并避免产生异质性，在大多数已发表的方案中出现的祖细胞草坪上神经元的复杂培养(9,10) (d日). 异质培养使定量分析变得困难，例如细胞计数和基于人群的生化分析(SI图8). 因此，为了将hNPC转化为人类神经元，hNPC在缺乏碱性FGF的hNPC培养基中的早期神经原代（P2或P3）培养2-3周，然后用木瓜蛋白酶处理，使神经元分裂为单个细胞，但大多数hNPC保持为细胞聚集体。最后，将分离的神经元通过细胞过滤器去除NPC聚集物，并将其重新放置在神经元培养基（含有5%血清、B27和青霉素/链霉素的基础培养基Eagle）中的层粘连蛋白涂层板上。免疫细胞化学分析表明，约70-80%的细胞是神经元( d–g和)剩余细胞为SOX2阳性hNPC。根据该方案，我们通常从≈200万hESC（一个35-mm的培养皿）中产生≈1000万到2000万人类神经元（一个100-mm的人类神经元培养皿）。
表1。
| 阶段 | 基底 | 中等 | 生长因子 | 分离方法 | 培养持续时间 |
|---|
| I.人类胚胎干细胞 | 国际MEF | DMEM/20%肯尼亚先令 | FGF2组 | 胶原酶IV/置换 | 无限制（≈每次5天） |
| 二、。神经诱导 | 层粘连蛋白或EB | DMEM-F12/B27型 | FGF2或Noggin | 胶原酶IV | 7–10天 |
| 三、 hNPC公司 | PO/纤维连接蛋白 | DMEM-F12/B27型 | FGF2组 | 哈佛商学院 | 最多3个通道（每个通道7天） |
| 四、 hNPC+hNeuron | PO/纤维连接蛋白 | DMEM-F12/B27型 | NT3、BDNF | 木瓜蛋白酶 | 2-3周 |
| V.h神经元 | PO/层粘连蛋白或星形胶质细胞 | BME/5%FBS/B27 | 星形细胞CM（可选） | 不适用 | 最多4周 |
HSF1和HSF6 hESCs之间神经元分化潜能的差异。
我们将HSF1 hESCs（XY，46，NIH编号UC01）分化为hNPC，如参考文献所述。9用于H1、H7和H9 hESC。与HSF6衍生hNPC一样，HSF1衍生hNPCs为NESTIN和SOX2阳性，并且主要表达PAX6(一). 然而，HSF1衍生的hNPC含有玫瑰花结结构(一)表达前脑标志物FOXG1B（BF1），而HSF6衍生的hNPC缺乏这些特征(b条). 此外，在单层培养的ESC向NPC转化过程中，noggin处理增强了HSF1 hESC前脑神经元的形成，但消除了HSF6 hESC中可膨胀的hNPC。
HSF1和HSF6 hESCs的不同神经元亚系分化。(一)HSF1衍生hNPC对NESTIN、SOX2、Ki67和PAX6的免疫染色。注意HSF1 hNPC容易形成玫瑰花状结构。(b条)HSF1和HSF6衍生hNPC中FOXG1B和NESTIN表达的免疫荧光比较。(c–g)泛神经标记物TuJ1对HSF1和HSF6衍生神经元的比较免疫荧光标记(c（c）)，非前脑标志物PAX2(d日)，GABA能量标记GAD67(e（电子）和（f）)和多巴胺能标记物酪氨酸羟化酶（TH）(克). 请注意c（c）和e–g由类胚体转化而来d日通过单层转化得到。
对HSF6衍生神经元的分析表明，≈33%是PAX2和GAD67阳性的非前脑GABA能神经元，而通过胚状体形成产生的HSF1衍生神经元包括一些GAD67阴性但很少有PAX2阳性神经元，通过noggin处理的单层转化产生的HSF1衍生神经元不包括PAX2阳性神经元( c–f). 其余HSF6衍生神经元由酪氨酸羟化酶阳性和多巴胺β羟化酶阴性多巴胺能神经元（≈33%），以及RT-PCR分析显示的HB9阳性胆碱能运动神经元、5-羟色胺能神经元和vGLUT1/2阳性谷氨酸能神经元的混合物组成（≈33%；克和数据未显示）。mRNA阵列分析表明，HSF1衍生的hNPC表达更多的前标记，包括EMX2、OTX1/2、LHX2、FOXG1B（BF1）和SIX3，而HSF6衍生的hNFC表达更高水平的后标记，包括HOX基因簇中的许多基因(SI图9). 此外，HSF6中HB9的表达水平高于HSF1神经元(SI图9). 综上所述，这些数据表明HSF1和HSF6 hESC均分化为形态上明显正常的神经元，而HSF1 hESC主要形成前脑神经元，HSF6 h ESC主要是后脑/颈/胸神经元。
HSF1和HSF6衍生神经元形成具有不同性质的功能突触网络。
为了研究人胚胎干细胞衍生神经元的电特性，我们使用了全细胞的斑贴灯记录。再植3天后，HSF1和HSF6衍生的神经元都会激发钠通道依赖性动作电位(SI图10)，但即使在培养2-3周后也不能表现出自发或诱发的突触活动，这表明没有形成功能性突触（数据未显示）。因为星形胶质细胞可以促进突触的形成(11——14)，我们将木瓜蛋白酶分离的人类神经元移植到新生小鼠的有丝分裂抑制的星形胶质细胞单层上。令人惊讶的是，HSF1和HSF6衍生神经元在重放7天后自发的突触事件变得明显，表明星形胶质细胞促进突触形成().
来自hESCs的人类神经元的自发突触活动。(一和b条)在HSF1和HSF6衍生的神经元上重放在小鼠星形胶质细胞单层上7、14和21天后，自发抑制和兴奋性突触反应（sIPCS和sEPSCs）的典型痕迹。在50μM 2-氨基-5-磷酸和20μM 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮中记录sIPCS，在30μM荷包牡丹碱和3μM{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“CGP55845”，“term_id”：“875097176”，“term_text”：“CGP55845“}}CGP55845型用于sEPSC。(c（c）)在复制后第7、14和21天，在HSF1-和HSF6衍生的神经元培养物中表现出自发IPSCs或EPSC的记录神经元的百分比。(d日)表现出自发兴奋性抑制性突触活动的神经元百分比比率（E-I比率）。(e（电子）)再植后第7、14和21天自发IPSC和EPSCs的振幅。(（f）和克)反应性细胞中自发IPSC和EPSCs的频率与重放后时间的关系。(小时)HSF1和HSF6衍生神经元自发兴奋性和抑制性突触事件的频率与再植后时间的关系。数据为平均值±SEM(n个≥3种独立文化；电生理记录中的所有数值，包括每种情况下分析的神经元数量，都列在SI表2和表3; *,P（P）<0.05；**，P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001).
我们在移植后7、14和21天检测了HSF1和HSF6衍生神经元的膜特性。在此期间，神经元输入电阻下降了40–50%，膜电容增加了70–100%，静息膜电位下降了≈15%，动作电位振幅增加了10–20%，钠通道振幅增加了50–60%(SI表2). HSF1和HSF6衍生神经元的总体变化相似，但HSF6的静息膜电位显著低于HSF1衍生神经元的负值（SI表2）.
我们进一步研究了人类神经元的突触特性。越来越多的HSF1和HSF6衍生神经元在移植到星形胶质细胞后的7、14和21天表现出自发兴奋性突触后电流（EPSCs）和抑制性突触前电流（IPSC），频率越来越高( c–h). 然而，这两种神经元之间突触活动的相对特性有显著差异。HSF1衍生神经元比EPSC表现出更多的自发IPSC，而HSF6衍生神经元表现出更多自发EPSC(c（c）). 此外，HSF6-自发突触事件的频率通常高于HSF1衍生神经元，HSF6--兴奋性事件与抑制性事件的频率之比高于HSF1派生神经元( f–h). 我们还使用标准的局部刺激方案测量了HSF1和HSF6衍生神经元的诱发突触反应(15,16) ( 一和b条). HSF1和HSF6衍生神经元的成功率和幅度相似，可以可靠地诱发突触反应( c–e类). HSF6产生EPSCs的反应性神经元的百分比略高于HSF1衍生神经元(c（c）)HSF6衍生神经元的EPSCs突触振幅几乎是HSF1衍生神经元的两倍(e（电子）). 综上所述，这些结果表明HSF6衍生的神经元形成相对较多的兴奋性突触，而HSF1衍生的神经元则形成较多的抑制性突触。
最后，我们检测了短期突触可塑性。在以10 Hz施加5 s的刺激序列后，HSF1和HSF6衍生神经元中兴奋性和抑制性自发突触反应的频率显著增加(（f）). HSF1和HSF6衍生神经元自发IPSC的平均频率增加≈5倍，而HSF1衍生神经元自发EPSCs的平均频率提高≈12倍，但HSF6派生神经元仅≈7倍(克).
HSF1和HSF6 hESCs、hNPC和人类神经元中microRNA的差异表达。
因为非编码microRNA介导的基因表达调控是一种主要的表观遗传机制(17——20)，我们检测了HSF1和HSF6细胞中hESC、hNPC和人类神经元阶段的microRNA表达模式，使用基于Taqman的实时PCR对184种miRNA进行了分析（加州福斯特市应用生物系统公司）。结果表明，在人胚胎干细胞分化过程中，miRNA表达模式发生了显著变化，可分为五类(一)：当hESCs转化为hNPC和人类神经元时，miRNAs表达增加（组I；≈50%miRNAs）或减少（组II；≈28%miRNA）；miRNAs在hESCs转化为hNPC后表达增加，但在hNPC分化为人类神经元后表达降低（III组；≈5%）；miRNAs在HSF1衍生的NPC中表达减少，但在HSF6衍生的NPCs中表达增加（IV组；≈7%，包括hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR206）；miRNAs无变化（V组；10%）。U6 snoRNA被用作样品装载的内部对照。这些结果通常使用Invitrogen（Carlsbad，CA）的NCode miRNA微阵列在HSF6系中得到证实，但直接比较表明，基于Taqman的定量PCR分析更具定量和敏感性(SI图11和SI表4). 此外，他们证实了ESC特异性和脑特异性miRNAs的先前分配(21——27)除了一些重要的例外。我们发现hsa-miR-134是一种具有假定神经功能的microRNA(27)，在hESCs中高度表达，但在神经元分化后减少100倍以上。Hsa-miR-134在神经元中的表达水平比典型的脑特异性miRNAs（例如Hsa-miR-124a）低1000倍以上，这表明至少在人类神经元中，Hsa-miR134不太可能具有普遍的中枢功能。
HSF1和HSF6 hESCs、hNPC和hNeuron中microRNA的差异表达。(一)184个miRNAs的阶段依赖性表达谱的层次聚类（三个阴性对照秀丽隐杆线虫miRNAs和两个水对照）。三个阶段的相对表达水平（热图）显示为hESC/hESC（因此始终为0）、hNPC/hESC和neurons/hESC的log2比率（红色，表达增加；绿色，表达减少；参见底部的比例尺）。代表性miRNA显示在放大的面板中。请参见SI表4获取每个miRNA的结果列表(b条)具有HSF1和HSF6 hESCs及其衍生hNPC和神经元表达差异的miRNAs的层次聚类。HSF6/HSF1的对数2比率如所示左侧（参见比例尺一)和差异表达的miRNA（>2倍变化）在对（见底部的颜色代码）。(c（c）)HSF1和HSF6衍生神经元中所有miRNA定量miRNA PCR阵列阈值周期的散点图。许多miRNAs在HSF1和HSF6株系之间以相似的水平表达，如高线性相关系数（R2). 确定了具有代表性的差异表达miRNAs。
HSF1和HSF6 hESCs、hNPC和人类神经元之间的比较表明，平均而言，40%的miRNAs在表达上表现出2倍以上的线对线差异。在转化为hNPC和神经元时，HSF6细胞倾向于比HSF1细胞表达更高的miRNA水平，但总体上只有四种miRNA（例如，hsa-miR-10a、-10b、-133a和-133b），HSF6-的表达水平是HSF1衍生神经元的4倍以上，可能参与调节这两个人胚胎干细胞系之间的神经元亚系分化偏倚。有趣的是，hsa-miR-10a嵌入在HOX基因簇中，该基因簇在脑干和颈脊髓中高度表达，与HSF1衍生的神经元相比，HSF6衍生的神经元中其表达更高，这与HSF6系产生更多具有更后向同源性的神经元的概念相一致，而HSF1细胞系产生更多具有前同一性的神经元(和SI图9).
讨论
在这项研究中，我们开发了一种协议，该协议允许将人胚胎干细胞可靠地分化为与星形胶质细胞共培养时形成功能性突触网络的神经元，并且我们描述了这些网络中突触的特性。我们比较了来自两个不同的、成熟的人胚胎干细胞系HSF1和HSF6的神经元的特性。基于对蛋白质和miRNA表达以及突触传递的分析，我们证明来自这些hESC细胞系的神经元表现出重大差异，表明HSF1和HSF6细胞系是“预先编程的”我们的意思是，尽管这两个人胚胎干细胞系完全能够分化为来自所有三个胚层的主要细胞类型，但它们在神经外胚层发育的细胞类型范围内表现出分化偏向，如HSF1和HSF6人胚胎干细胞系分化后形成的神经元类型所述。这些发现对干细胞生物学和干细胞系在影响组织修复和建立人类细胞疾病模型中的应用具有重要意义。
人胚胎干细胞的神经分化。
在人类胚胎干细胞起源之前，直接研究人类神经元的唯一来源是在脑手术或尸检期间获得的流产人类胎儿或成人组织。这里描述的分化方案产生了可用的神经元，这些神经元可以可靠地分离出来，具有相同的特性和相同的遗传背景。此外，我们的方案产生含有70-80%人类神经元的培养物，而大多数其他可用方法产生的异质细胞混合物难以用于细胞分化或神经元功能的机械研究。人类神经元与星形胶质细胞共培养后形成的突触网络不仅可以用于研究人类神经元的基本突触特性，还可以用于研究神经疾病基因触发的病理机制，例如。，亨廷顿蛋白,机械2、和α-突触核蛋白此外，这种人类神经细胞培养系统可用于高通量药物筛选，以识别可逆转各种疾病基因诱导的细胞表型的分子。
人类胚胎干细胞系之间的内在差异。
我们的研究表明，不同的人胚胎干细胞系可能偏向不同的细胞系，可能是因为它们是在不同的条件下获得的。这一结论与之前对三种不同的人胚胎干细胞系HSF1（XY，46）、HSF6（XX，46）和H9（XX，46c）进行的cDNA微阵列分析一致，表明30-50%的基因表现出不同的表达模式(5). 我们发现HSF6 hESCs产生中脑/后脑神经元，但不能产生前脑神经元，而HSF1易于分化为前脑神经元。除其他外，这一发现表明，前脑疾病，如亨廷顿病，HSF1比HSF6 hESCs更适合建模，而泛神经疾病可以由HSF1和HSF6衍生的神经元建模。
HSF6和HSF1 hESC的神经元亚型分化可能仍能由外源信号调节，如小鼠ESC衍生的神经元所述(28). 许多细胞外分子和转录因子调节神经元分化(10,28——32)在人类胚胎干细胞分化范式上测试这些因素和分子将非常重要。
hESCs不同品系的表观遗传学预编程。
HSF1和HSF6 hESCs的预编程可能是通过表观遗传学机制发生的。例如，FoxG1B（BF1）在HSF1和HSF6细胞中的差异表达可能是由这些hESC细胞系中FoxG1B基因的不同染色质状态引起的，这一假设可以通过检查FOXG1基因的表观遗传代码（即其DNA甲基化，及其相关组蛋白的甲基化和乙酰化）来验证在HSF1和HSF6 hESCs中。我们的mRNA表达微阵列分析表明，X连锁基因MECP2在HSF1和HSF6株系中的表达水平相似(SI图9)表明HSF6 hESCs在神经元分化时可能具有适当的X失活。表观遗传基因调控的一个主要机制是非编码miRNAs的表达。hESCs中的miRNAs可能通过在翻译水平抑制分化基因表达，在hESCs的自我更新中发挥关键作用，并作为“主调节器”协调细胞系分化程序。我们的miRNA分析结果表明，在hESC分化为hNPC和人类神经元的过程中，miRNA的表达模式发生了大规模的急剧变化，这与miRNA在神经元分化和成熟（包括突触生长和突触形成）中发挥关键作用的概念相一致。尽管许多miRNA表现出变化，但在人类神经元阶段，只有四个miRNA在两条线之间表现出4倍以上的变化，可能参与调节神经元亚型分化。
总之，我们的结果表明，两种不同的人胚胎干细胞系表现出不同的神经元分化偏向，这可能是因为不同的表观遗传预编程。对包括DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA在内的表观遗传学预编程的进一步研究不仅有助于我们理解hESCs对神经谱系的分化控制，而且对使用hESCs研究和治疗神经疾病具有重要意义。
材料和方法
hESCs、hNPC和人类神经元的培养、阵列分析和免疫细胞化学。
将NIH注册的hESC细胞系HSF1（XY，46，NIH编号UC01）和HSF6（XX，46，NIH编号UC06）保存在CF1照射的小鼠胚胎成纤维细胞上，在补充20%敲除血清替代物（Invitrogen）、碱性FGF（10 ng ml）的DMEM高糖中培养−1)、1 mM谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%青霉素/链霉素和0.1 mM 2-巯基乙醇，每日更换培养基，每4-6天用1 mg ml培养基传代一次−1dispase/Cologenase IV（Invitrogen）在37°C下10–20分钟。细胞的分化、微阵列分析和免疫细胞化学在SI文本.
电生理分析。
在第7天、第14天和第21天，分别用星形胶质细胞和不含星形胶质细胞的HSF1和HSF6衍生神经元进行了电生理学检查。在全细胞电压钳模式下记录突触反应。通过局部细胞外电极（FHC，Bowdoin，ME；同心双极电极，目录号CBAEC75）注入1ms电流（900μA）触发诱发的突触反应(15,16). 有关详细说明，请参见SI文本.
统计分析。
所有统计分析均采用单因素方差分析测试和Fisher事后分析吨测试。
