δEF1蛋白在TGF-β诱导的上皮-间充质转化中对上皮和间充质标记物的差异调节

DNA构建

通过对pGL2中小鼠E-cadherin启动子（−178到+92碱基对）进行基于PCR的突变，构建了在E-box（称为E1、E2、E3、E21、E13、E23和E213）中具有点突变的小鼠E-cadhelin启动子(近藤等。, 2004). 使用PCR从DNeasy（QIAGEN，Chatsworth，CA）分离的人类角质形成细胞HaCaT细胞的基因组DNA中克隆人类δEF1启动子（翻译起始点的−1107到+55碱基对）。使用寡核苷酸5′-CAGAAATCCAAAACTTGTACC-3′（正义）和5′-CTGCTTCTGCGCTTACCT-3′（反义）通过高保真Taq聚合酶（LA-Taq，Takara，Kyoto，Japan）进行扩增。首先使用TA克隆试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）将纯化的PCR片段克隆到pCR2.1载体中，并通过测序进行确认，然后重新整合到pGL3载体中（Promega，Madison，WI）。小鼠SIP1和δEF1 cDNA分别来自根特大学的F.van Roy博士和大阪大学的Y.Higashi博士。人类E47和Ets1 cDNA分别由C.Murre博士（加州大学圣地亚哥分校）和N.Kamata博士（广岛大学）提供。使用ViraPower腺病毒网关表达系统（Invitrogen）构建编码SIP1或δEF1表位的腺病毒载体，该表位在其N端用Flag标记。根据制造商的方案，在转染的293A细胞中产生腺病毒，并在相同的细胞中扩增。使用腺病毒5的Virakit和重组衍生物4-Pack（Virapur，Carlsbad，CA）纯化腺病毒。

抗体

小鼠单克隆抗Flag M2和抗α-微管蛋白抗体购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯），小鼠单克隆抗体抗E-cadherin和抗N-cadherin抗体购自BD Transduction Laboratories（肯塔基州列克星敦）。用于免疫染色的大鼠抗E-钙粘蛋白单克隆抗体来自Zymed（加利福尼亚州旧金山）。山羊多克隆抗纤维连接蛋白抗体和抗δEF1抗体分别来自Calbiochem（加利福尼亚州La Jolla）和Santa Cruz Biotechnology（加利福尼亚州圣克鲁斯；E-20，批号K0702）。

DNA的转染和感染

按照制造商的建议，分别使用Fugene 6试剂（印第安纳波利斯罗氏分子生物化学公司）和Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）瞬时转染NMuMG细胞和MDCK细胞。对于腺病毒感染，将NMuMG细胞以1.0×10的密度进行培养⁵八周培养载玻片中的细胞/微孔（马萨诸塞州贝德福德BD Falcon）。8小时后，用每种腺病毒感染细胞1小时，轻轻搅拌，用相同的培养基清洗一次，然后再培养24小时。

RNA干扰

根据HiPerFect试剂（QIAGEN）推荐的方案，在12孔组织培养板中转染短干扰RNA（siRNAs）。所用siRNA的最终浓度为5 nM，但SIP1 siRNA的最后浓度为10 nM。转染后8 h，向培养基中添加1 ng/ml TGF-β，并继续培养24 h。这些siRNA双链体的靶序列如下：小鼠SIP1（GGAAAACGUGGUGAACUACA；加州桑尼维尔B-Bridge），小鼠δEF1（隐形RNAi MSS210696；Invitrogen）、小鼠E2A（隐形RNAi MSS210711；Invit罗gen），小鼠Ets1（隐形RNA干扰MSS215651、MSS215652和MSS215653；Invitorgen）和阴性对照（隐形RNAi 12935-200；Invitroren）。

免疫印迹法

NMuMG细胞以8.0×10的密度接种⁴12孔组织培养板中的细胞/孔。12 h后，用1 ng/ml TGF-β处理细胞24 h。细胞在RIPA缓冲溶液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，10 mM EDTA，1 mM EGTA，1%Nonide P-40，0.5%脱氧胆酸钠和0.1%SDS）中溶解。在使用BCA蛋白质检测试剂盒（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）测量蛋白质浓度后，对每条通道等量的总蛋白质进行SDS凝胶电泳，然后将蛋白质半干转移至荧光反式W膜（纽约州格伦科夫，帕尔）。在含有5%脱脂奶的TBS-T缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl和0.1%吐温-20）中培养，可阻止蛋白质与膜的非特异性结合。使用ECL印迹系统进行免疫检测（Amersham，Piscataway，NJ）。

免疫荧光标记

为了使肌动蛋白细胞骨架产生直接荧光，将细胞固定在磷酸盐缓冲液（PBS）中3.7%的多聚甲醛中，在室温下用0.2%Triton X-100在PBS中渗透5分钟，然后用0.25 mM四甲基罗丹明异硫氰酸盐（TRITC）-共轭指骨蛋白（Sigma-Aldrich）染色。对8孔培养玻片进行免疫细胞化学分析。细胞固定在1:1丙酮-甲醇溶液中，并在室温下与用Blocking One溶液（日本东京Nacalai Tesque）稀释的抗体孵育1小时。然后将细胞与二级抗体和TOTO3（Invitrogen Molecular Probes，Eugene，OR）孵育1小时。通过共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss，Thornwood，NY）检测荧光。

RNA的提取和定量RT-PCR

使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）从NMuMG细胞中提取总RNA。按照制造商的说明，使用Superscript III逆转录酶（Invitrogen）通过Oligo（dT）启动产生第一链cDNA。使用ABI PRISM 7500快速实时PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）和电源SYBR Green（加利福尼亚州福斯特市应用生物科学）。

荧光素酶分析

将细胞分成两份接种在12孔组织培养板中，然后根据需要使用不同组合的启动子报告结构和表达质粒进行瞬时转染。细胞裂解液中的荧光素酶活性通过使用光度计（AutoLumat LB953，EG&G Berthold，Natick，MA）的双荧光素素酶报告分析系统（Promega）测定。荧光素酶活性归一化为共同转染的phRL-TK质粒（Promega）的海产荧光素酶活性。

电泳迁移率变化分析

E-box2/1 WT探针覆盖小鼠E-cadherin启动子的−84到−73区域。用[γ]标记双标记寡核苷酸-³²P] ATP和T4多核苷酸激酶。核提取物的制备如前所述(小林寺等。, 2007). 简单地说，用标记的SIP1腺病毒感染细胞，用PBS洗涤，收集在缓冲液A中（10 mM HEPES-KOH，pH 7.9，1.5 mM MgCl₂，10 mM KCl，0.5 mM二硫苏糖醇，1 mM苯甲基磺酰氟和50 U/ml抑肽酶），并在冰上培养10分钟。离心后，用缓冲液A清洗沉淀并悬浮在缓冲液C中（20 mM HEPES-KOH，pH 7.9，420 mM NaCl，1.5 mM MgCl₂、0.2 mM EDTA、0.5 mM二硫苏糖醇、1 mM苯甲基磺酰氟和50 U/ml抑肽酶）。将悬浮液在冰上培养20分钟，并将离心获得的上清液用作核部分。用5μg NMuMG核蛋白、poly（dI-dC）[poly（deoxyinosinic-deoxycytidylic acid）]和³²结合缓冲液中的P标记双链寡核苷酸（15 mM Tris-HCl，pH 7.5，75 mM NaCl，1.5 mM EDTA，1.5 mM-二硫苏糖醇，7.5%甘油，0.3%Nonide P-40，和1 mg/ml牛血清白蛋白）。对于超位移实验，将提取物与抗Flag M2抗体孵育，并加载到在0.25×TBE缓冲液中制备的6%聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后，将凝胶干燥，暴露在成像板上，并使用BAS-5000系统（日本东京富士胶片公司）进行分析。

SIP1和δEF1，但不是蜗牛，抑制E-Cadherin表达

由于TGF-β上调了NMuMG细胞中SIP1、δEF1和蜗牛mRNA的表达，我们接下来研究了这些因素对E-cadherin启动子活性的影响。转染TβR-I组成活性形式ALK5TD和E47抑制NMuMG细胞E-cadherin启动子活性(图2A） ●●●●。SIP1或δEF1的过度表达强烈抑制了NMuMG细胞中E-cadherin启动子的活性，达到E47抑制的水平。免疫印迹法测定转染SIP1的蛋白质水平远低于转染E47的蛋白质水平（数据未显示）。蜗牛和鼻涕虫均抑制MDCK细胞中E-cadherin启动子的活性(图2A和数据未显示）。然而，Snail、Slug和Twist均未对NMuMG细胞中的E-cadherin启动子活性产生显著影响，这表明Snail和Slug的功能与细胞上下文相关，正如之前报道的那样(Barrallo-Gimeno和Nieto，2005年).

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图2。

外源性SIP1或δEF1下调E-cadherin表达。（A） NMuMG细胞（左）与小鼠E-cadherin启动子报告结构（E-cadherin-Luc.）联合0.5μg ALK5TD或0.7μg E47-、SIP1-、δEF1-、蜗牛-、Slug-和扭曲表达质粒共转染。MDCK细胞（右）与E-cadherin-Luc和0.7μg E47-、SIP1-和蜗牛表达质粒共同转染。转染后24小时，收集细胞并检测荧光素酶活性。（B） NMuMG细胞与E-cadherin启动子报告质粒和野生型SIP1（WT）或SIP1-ΔSBD（ΔSBD）瞬时共转染。如在A中测定萤光素酶活性。（C）用抗Flag M2（左侧第二）和抗E-钙粘蛋白抗体（右侧第二）对感染mock、Flag-SIP1和Flag-δEF1腺病毒的NMuMG细胞进行免疫染色，并用TOTO3染色以检测细胞核（右侧）。（D） 通过定量RT-PCR测定感染模拟、SIP1或δEF1腺病毒的NMuMG细胞中E-cadherin mRNA的表达水平。将数值标准化为GAPDH mRNA。

SIP1最初通过酵母双杂交筛选被鉴定为Smad相互作用蛋白，并显示在其N末端包含Smad结合域（SBD）(维索尔伦等。, 1999). SIP1和δEF1在SBD中的氨基酸序列相似程度为～40%，δEF1与Smad2/3的相互作用弱于SIP1（数据未显示）Postigo，2003年)这表明SBD对E-cadherin启动子活性的抑制是不必要的。为了验证这一点，我们制备了一个缺乏SBD的SIP1缺失突变体（SIP1-ΔSBD），并在NMuMG细胞瞬时转染后测量了E-钙粘蛋白启动子活性。与野生型SIP1类似，SIP1-ΔSBD突变体抑制E-钙粘蛋白启动子活性(图2B） ●●●●。仅在存在TGF-β的情况下观察到野生型SIP1与Smad2/3的结合，而即使在存在TGF-β的条件下也未观察到SIP1-ΔSBD的结合（数据未显示）。这些发现表明，SIP1和δEF1对E-cadherin启动子活性的抑制不需要通过SBD与Smad相互作用。

与E-cadherin报告基因检测结果一致，腺病毒过度表达SIP1或δEF1抑制了E-cadherinmRNA和E-cadherins蛋白的表达(图2、C和D）。这些发现表明，SIP1和δEF1是NMuMG细胞E-cadherin转录的有效抑制剂。

δEF1家族蛋白与小鼠E-Cadherin启动子中的E-box1和E-box2结合

E-cadherin启动子在人类中包含两个E盒（E-box1和E-box3），在小鼠中包含三个E盒。为了确定SIP1和δEF1是否通过E-box影响小鼠E-cadherin启动子的转录，我们将SIP1表达质粒转染到小鼠NMuMG细胞中，报告质粒由小鼠E-cadtherin核心启动子驱动（−178至+92）。SIP1和δEF1诱导小鼠E-cadherin启动子活性降低约60%(图3、B和C）。为了确定哪些E盒参与SIP1和δEF1诱导的抑制，我们对小鼠E-cadherin启动子中的E盒进行了突变(图3A） ●●●●。SIP1和δEF1抑制单个E-box点突变体（E1、E2和E3）的E-cadherin启动子活性，其程度与野生型E-cadherin启动子相似(图3、B和C）。在小鼠E-cadherin启动子的三个双E-box突变体中，E-box1/E-box3突变体（E13）和E-box2/E-box2突变体（E23）表现出与野生型E-cadherin启动子相似的活性。相反，SIP1和δEF1未能抑制E-box2/E-box1双突变体（E21）的转录，类似于小鼠E-cadherin启动子（E213，图3、B和C）。

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图3。

小鼠E-cadherin启动子中的E-box1和E-box2是E-cadherinSIP1和δEF1依赖性抑制所必需的。（A）荧光素酶分析中使用的小鼠野生型E-cadhern-luciferase构建物（WT）及其突变体的示意图。将浓度为0、0.1、0.25和0.5μg的（B和C）SIP1或δEF1表达质粒与小鼠野生型E-cadherin荧光素酶构建物（WT）及其突变体在NMuMG细胞中共同转染。转染后24小时，荧光素酶活性测定如材料和方法。（D） 用与小鼠E-cadherin基因（E-box2/1 WT）或其突变体（mut.）的E-box2/1相似的探针进行凝胶位移分析。过度表达Flag-SIP1的NMuMG细胞的核提取物与所示探针孵育。与E-box2/1结合的SIP1与50倍摩尔过剩的未标记野生型或突变探针竞争。黑色箭头表示SIP1复合体的位置。在结合反应中加入抗Flag M2抗体后，观察到超移位复合物（白色箭头）。

为了证实这些发现，使用过表达SIP1的NMuMG细胞的核提取物对放射性同位素标记的小鼠E-cadherin探针进行电泳迁移率变化分析（EMSA）(图3D） ●●●●。SIP1与野生型E-box2/1探针结合，产生一个特定的带，该带被未标记野生型探针有效竞争，但仅与过量的（×50）未标记突变探针弱竞争。然而，使用双E-box2/1突变体作为标记探针，在EMSA中无法检测到SIP1蛋白的结合。使用抗Flag M2抗体的超移位试验证实了Flag-SIP1与E-box2/1探针结合的特异性。添加抗标记单克隆抗体导致SIP1特异性条带消失，并出现缓慢迁移的超移位复合物(图3D） ●●●●。Flag-δEF1的过度表达也获得了类似的结果（数据未显示）。这些发现表明，SIP1和δEF1通过与NMuMG细胞中小鼠E-cadherin启动子的E-box2和E-box1元件相互作用，直接抑制小鼠E-cadtherin启动子活性。

SIP1和δEF1的双重敲除阻断TGF-β诱导的E-钙粘蛋白抑制和细胞迁移

为了确定SIP1和δEF1是否是TGF-β介导的E-钙粘蛋白启动子活性抑制所必需的，我们使用针对SIP1或δEF1的siRNA来减少内源性蛋白的表达。将SIP1或δEF1 siRNA转染到NMuMG细胞中，然后用TGF-β刺激细胞。SIP1和δEF1 siRNA各自成功地敲低了相应内源性mRNA的表达(图4A） ●●●●。免疫印迹也证实δEF1蛋白表达下调（参见图5B） ●●●●。在转染对照siRNA的细胞中，TGF-β在刺激后24小时诱导SIP1和δEF1 mRNA的双重表达，并在刺激后的24小时内抑制E-cadherin的表达(图4A） ●●●●。在单独转染SIP1 siRNA或δEF1 siRNA的细胞中，TGF-β介导的E-钙粘蛋白阻遏没有或仅部分被阻断。有趣的是，SIP1和δEF1 siRNAs的转染在mRNA水平上完全消除了TGF-β诱导的E-钙粘蛋白抑制(图4A） ●●●●。NMuMG细胞E-钙粘蛋白的免疫染色也显示，转染SIP1和δEF1 siRNA的细胞中的TGF-β并未抑制E-钙黏蛋白的水平(图4B） ●●●●。

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图4。

SIP1和δEF1的双重敲除减轻TGF-β诱导的E-钙粘蛋白调节。（A） 用1.0 ng/ml TGF-β刺激转染SIP1 siRNA、δEF1 siRNA或两种siRNA（SIP1+δEF1）的NMuMG细胞24小时，并通过半定量RT-PCR分析检测SIP1（左）、δEFl（中）和E-cadherin水平（右）。将数值归一化为GAPDH mRNA的数量。（B）未转染或带有对照（NC）或同时转染SIP1和δEF1（SIP1+δEF1）siRNAs的NMuMG细胞用1.0 ng/ml TGF-β刺激24 h，并进行E-cadherin的免疫荧光染色。（C）通过伤口试验（左）测定敲除细胞在无或存在TGF-β的情况下的迁移行为，并按照材料和方法（右）。NC，控制siRNA。

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图5。

SIP1和δEF1击倒细胞中间充质标志物的变化。（A） 用2.5 ng/ml TGF-β刺激转染SIP1和δEF1（SIP1+δEF1）siRNAs的NMuMG细胞24小时，并通过半定量RT-PCR分析检测E-钙粘蛋白（左）、纤维连接蛋白（中）和N-cadherin（右）的水平。将数值标准化为GAPDH mRNA的数量。（B）用TGF-β刺激转染对照（NC）或SIP1和δEF1（SIP1+δEF1）siRNAs的NMuMG细胞24小时，并使用抗δEF1、E-cadherin、纤维连接蛋白和N-cadherin抗体进行免疫印迹分析。α-微管蛋白水平作为全细胞提取物的负荷控制进行监测。（C） 在不含或含有对照（NC）或SIP1和δEF1（SIP1+δEF1）siRNAs的情况下转染细胞后，细胞在没有或存在1 ng/ml TGF-β的情况下生长，然后使用TRICT-球蛋白直接染色肌动蛋白细胞骨架。NC，控制siRNA。

接下来，我们通过细胞运动试验研究了SIP1和δEF1的功能是否是TGF-β诱导迁移和侵袭所必需的。在转染对照siRNA的细胞中，TGF-β加速伤口闭合(图4C） 和侵袭（数据未显示），可能通过E-cadherin调节细胞-细胞粘附。在转染SIP1和δEF1 siRNA的细胞中，这些反应部分受损(图4C） ●●●●。这些发现表明TGF-β需要SIP1和δEF1来抑制NMuMG细胞E-cadherin的表达和迁移行为。

SIP1和δEF1与TGF-β上调间充质标志物无关

由于SIP1和δEF1 siRNAs的转染完全消除了E-钙粘蛋白对TGF-β的下调反应，因此我们检测了NMuMG细胞中的其他EMT标记物，包括纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白，是否受到这些siRNA的影响。用SIP1和δEF1 siRNA转染细胞。未转染细胞和转染对照siRNA的细胞作为对照。在对照细胞中，TGF-β在mRNA和蛋白质水平下调E-钙粘蛋白的表达，上调纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白(图5、A和B）。与SIP1和δEF1对TGF-β诱导的E-钙粘蛋白阻遏的作用相反，转染SIP1及δEF1 siRNAs的细胞显示出与对照细胞相似的纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白表达谱(图5、A和B）。此外，通过TRITC-类球蛋白染色检查对照细胞中的肌动蛋白重组，发现TGF-β能显著形成肌动蛋白纤维，这在转染SIP1和δEF1 siRNA的细胞中也能观察到(图5C） ●●●●。这些发现强烈表明SIP1和δEF1不参与TGF-β对间充质标志物表达的调节。

TGF-β诱导的SIP1表达需要激活Smad信号转导和随后的De-Novo蛋白合成

为了阐明TGF-β诱导的SIP1和δEF1表达是否需要从头开始的蛋白质合成，在存在或不存在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺的情况下，从用TGF-β刺激的细胞中提取RNA，并通过半定量RT-PCR进行分析。因为TGF-β快速增加Smad7 mRNA已被报道为TGF-？激活Smad信号的直接作用(Akiyoshi公司等。2001年)以Smad7为阴性对照，评价环己酰亚胺的作用。转化生长因子-β在12小时前上调蜗牛mRNA(图6并查看图1E） ●●●●。与环己酰亚胺对TGF-β诱导的Smad7增加的影响类似，环己酰亚胺不影响蜗牛的诱导，表明蜗牛是TGF-β-Smad途径的直接靶点。相反，尽管TGF-β在没有放线菌酮的情况下诱导了SIP1 mRNA的表达，但用放线菌亚胺预处理细胞会阻止TGF-α介导的SIP1的诱导(图6)和δEF1（数据未显示）。因此，SIP1和δEF1 mRNAs的上调可能是一种间接转录反应，需要TGF-β从头合成蛋白质。

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图6。

TGF-β诱导SIP1的从头蛋白质合成要求。用5μM环己酰亚胺（CHX）预处理1 h的NMuMG细胞用1 ng/ml TGF-β刺激12 h。提取RNA并用半定量RT-PCR分析，以确定内源性Smad7、蜗牛和SIP1的水平。将数值标准化为GAPDH mRNA的数量。

δEF1家族蛋白对TGF-β抑制E-Cadherin表达至关重要

据报道，多种转录因子参与EMT(Barrallo-Gimeno和Nieto，2005年). 在这些因素中，TGF-β逐渐增加NMuMG细胞中SIP1和δEF1 mRNA的表达，其表达谱与E-钙粘蛋白的表达谱相互作用(图1D） ●●●●。尽管有报道称SIP1和δEF1（ZEB1）在TGF-β和BMP信号传导中起相反的作用(Postigo，2003年)，我们发现SIP1和δEF1均抑制E-cadherin的表达，并且对于TGF-β诱导的NMuMG细胞EMT至关重要。与我们的研究结果一致，有报道称，在缺乏TGF-β的情况下，SIP1的过度表达完全抑制了NMe细胞（一种来源于NMuMG细胞的细胞系）中E-cadherin启动子的活性(Comijn公司等。2001年)δEF1的过度表达也抑制上皮细胞中E-cadherin的表达(范·格伦斯文等。2003年).

SIP1最初通过酵母双杂交筛选鉴定为Smad相互作用蛋白，并显示其N端含有SBD(维索尔伦等。, 1999). SIP1通过SBD以TGF-β依赖的方式与R-Smad相互作用。相反，即使存在TGF-β，δEF1与Smad的相互作用也很弱（数据未显示Postigo，2003年)可能是由于δEF1和SIP1之间SBD中的序列相似性较低。尽管δEF1和SIP1被报道以TGF-β依赖的方式调节p3TP-lux和p21-lux的启动子活性(Postigo，2003年;波斯蒂戈等。2003年)和科米金等。(2001)据报道，一个缺乏SBD的SIP1缺失突变体未能抑制MCF7细胞中人类E-cadherin的转录，本研究结果表明Smads与SIP1的相互作用不需要抑制E-cadherin的转录。这些发现表明，SIP1和δEF1在NMuMG细胞中独立于与Smads的相互作用而调节小鼠E-钙粘蛋白的转录。

科米金等。(2001)还报道了人E-钙粘蛋白启动子含有E-box1和E-box3，但缺乏E-box2，并且SIP1通过E-box1和E-box3抑制人MCF7细胞中人E-钙粘蛋白启动子活性的转录。然而，在小鼠NMuMG细胞中，E-box1和E-box2足以通过SIP1和δEF1抑制小鼠E-cadherin转录，并且E-box3不需要用于这种抑制(图3). 使用染色质免疫沉淀分析，我们发现过表达的δEF1和SIP1与小鼠E-cadherin启动子的E-box2/1元件结合（数据未显示）。尽管这种差异的原因尚不清楚，但SIP1和δEF1可能通过与Smads的相互作用作用作用于E-box3，并且位于小鼠E-钙粘蛋白启动子中靠近E-box1的E-box2可能补偿E-box3的功能。未来需要使用小鼠和人类E-cadherin启动子以及通过内源性δEF1、SIP1和蜗牛使用染色质免疫沉淀分析进行进一步研究。

蜗牛不参与抑制NMuMG细胞E-Cadherin表达

已证明蜗牛由TGF-β诱导，并在体外和体内各种细胞的E-钙粘蛋白阻遏和EMT中发挥关键作用(Barrallo-Gimeno和Nieto，2005年). 虽然TGF-β强烈诱导NMuMG细胞中蜗牛mRNA的表达(图1E） ，我们无法确定蜗牛蛋白水平，因为几种市面上可买到的蜗牛抗体效率低（我们未公布的数据）。蜗牛的过度表达不能影响NMuMG细胞的表型，也不能调节EMT标记物的表达，包括E-cadherin、N-cadherin，纤维连接蛋白和波形蛋白(图2A和补充图1、D和E）。使用siRNA的实验还表明，TGF-β可有效诱导转染蜗牛siRNA的NMuMG细胞中的EMT标记物（补充图1，A-C）。最近有报道称，蜗牛在EMT期间通过多种机制被激活，包括HMGA2上调调节、GSK3β磷酸化、赖氨酰氧化酶样2激活以及锌转运蛋白LIV1诱导细胞核定位(山下等。, 2004;周等。, 2004;佩纳多等。, 2005;蒂奥等。, 2006). 然而，目前的研究结果表明，蜗牛不是TGF-β介导的NMuMG细胞EMT的主要介质，可能需要其他分子在这些细胞中诱导EMT。

Ets1和Id蛋白作为SIP1和δEF1的上游因子

Ets1已被证明是某些细胞中TGF-β-Smad信号的直接靶点(秋叶等。2001年;德尔瓦莱佩雷斯等。, 2004). 在本研究中，我们还观察到TGF-β上调了Ets1的表达，这不受放线菌酮治疗的影响（数据未显示）。由于环己酰亚胺治疗阻断了TGF-β诱导的SIP1和δEF1 mRNA的表达，因此Ets1是NMuMG细胞中TGF-。我们进行的启动子报告分析显示，Ets1激活了δEF1启动子的活性，并抑制了E-cadherin启动子的活动(图7、B和C）。Ets1基因敲除降低内源性δEF1或SIP1的mRNA水平(图7D） ●●●●。有趣的是，在Ets1 siRNA-转染细胞中，有无TGF-β均显著抑制Ets1 mRNA的表达，而无TGF--β时SIP1和δEF1的mRNA水平与对照siRNA转染细胞相似(图7D） ●●●●。这可能是由于其他Ets家族转录因子的冗余效应所致；我们观察到，当Ets1表达被Ets1特异性siRNA抑制时，NMuMG细胞中Ets2和ESE1（一种乳腺癌特异性Ets蛋白）的表达上调（我们的未发表数据）。

先前的研究报告称，Ets1的转录活性是通过某些丝氨酸-三氢嘌呤激酶（包括ERK1/2）的磷酸化来调节的(Tootle and Rebay，2005年). 最近，尽管Ras信号通路在TGF-β信号通路中的作用似乎与环境相关，但Ras和TGF-(戈兹曼等。, 2002;佩纳多等。2003年). Smad1被Ras激活的ERK MAP激酶磷酸化，并被Smurf1降解(萨普科塔等。, 2007)而在转染活性Ras的某些癌细胞中，Smad2/3不规则地转位到细胞核(山形县等。, 2005;Oft公司等。, 2002). 有趣的是，据报道，TGF-β诱导的EMT仅在活性Ras存在的情况下发现(戈兹曼等。, 2002)，表明Ets1可能是TGF-β和Ras信号通路之间串扰的关键分子。在本研究中，我们证明，尽管Ets1的过度表达加速了δEF1启动子的活性，但与组成活性TβR-I（ALK5TD）的共表达进一步增强了Ets1诱导的δEF1的启动子活性(图7C） ●●●●。这些发现表明，在NMuMG细胞中，Ets1通过翻译后修饰（包括磷酸化）被TGF-β激活。

我们和另一个研究小组以前曾报道，HLH转录抑制剂Id蛋白通过与NMuMG细胞中E12/E47 bHLH转录因子的组成性关联抑制TGF-β诱导的E-钙粘蛋白抑制(近藤等。, 2004;科瓦内茨等。, 2004). 因此，TGF-β下调Id蛋白消除了这种抑制，导致NMuMG细胞出现EMT。与这些发现一致，当Id2在NMuMG细胞中过度表达时，TGF-β诱导的E-钙粘蛋白抑制和δEF1诱导部分受损(图7E和近藤等。, 2004). 先前的研究报告称，Id蛋白在体外通过保守的HLH结构域直接与Ets1结合(耶茨等。, 1999)，我们在这里已经表明，Ets1诱导的δEF1启动子激活被Id2的过度表达部分抑制(图7C） ●●●●。这些发现表明Id蛋白对TGF-β诱导的EMT中Ets1的抑制作用。此外，转染E12/E47 siRNA后，δEF1启动子上的Ets1活性受到部分抑制（补充图2，A和B），表明Ets1可能与E47协同作用以调节δEF1的表达。然而，目前尚不清楚在TGF-β诱导的EMT中Ets1是直接与E47相互作用还是通过其他分子间接与E47结合(党等。, 1998). 综上所述，这些研究结果表明，Ets1与E47的协同作用可能调节SIP1和δEF1的表达，这可能以细胞和启动子环境的方式发生，TGF-β下调Id蛋白的表达可能会增强这种协同作用，从而诱导δEF1家族蛋白的表达，导致EMT。

我们感谢E.Ohara女士的技术援助，感谢N.Kobayashi、K.Tobiume、M.Taki和N.Kamata博士的建议，感谢东京日本癌症研究基金会癌症研究所分子病理学实验室和生物化学实验室的所有成员的批评性意见。这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部的KAKENHI（科学研究补助金）和上原纪念基金会的资助。