用于rRNA序列快速分配到新细菌分类中的朴素贝叶斯分类器^{▿ †}

摘要

从20世纪80年代中期开始，卡尔·沃斯（Carl Woese）以rRNA为基础的系统发育比较描述了生命的三个主要分支，从而彻底改变了微生物学领域(28). 如今，基于rRNA的分析仍然是微生物学的中心方法，不仅用于探索微生物多样性，还用作细菌鉴定的日常方法。从概念上来说，鉴定方法比分子系统发育分析更容易解释，并且在对类群有很好的了解时，通常会首选鉴定方法。与系统发育（聚类）方法相反，大多数rRNA鉴定（分类）方法都是基于最近邻的分类方案(10,18; 然而，请参阅参考4). 在某种程度上，这是由于缺乏一致的、更高级别的细菌分类结构（分类学）。最近的几起事件帮助改变了这种情况。2002年，细菌学物种定义重新评估特设委员会(24)建议所有新的细菌物种描述都包括来自该型菌株的rRNA序列，并且在2001年，Bergey’s Trust发表了一份修订后的高阶分类法，试图将细菌分类与基于rRNA的系统发育相协调(12,13).

朴素的贝叶斯分类方法简单，但效率极高。“天真”是指（天真）假设数据属性是独立的。多明戈斯和帕萨尼(11)结果表明，即使违反了这种属性独立性，贝叶斯方法仍然是最优的。据报道，该方法在与序列数据分类类似的问题上表现良好，例如文本文档的分类，这些文档具有高维特征空间和稀疏数据(16).

核糖体数据库项目II（RDP）为研究界提供与rRNA序列相关的数据、工具和服务。截至2007年1月，RDP保持了超过300000个细菌序列，平均每月超过5000个新序列。为了处理这一数量的序列，我们开发了一种朴素的贝叶斯分类器，用于将细菌rRNA序列分类为新的Bergey细菌分类法。该分类器速度快，不需要序列比对，并且可以很好地处理部分序列。（公共数据库中绝大多数rRNA序列是部分的。）它能够分类到属级的近全长和400碱基片段，总准确率超过88.7%。

基于16S rRNA基因序列库的微生物群落比较已成为微生物生态学中的普遍现象。然而，大多数比较方法，无论是来自传统宏观生态学，如Sorensen指数和Jaccard指数，还是专为序列数据设计的，如LIBSHUFF(22)、马丁P和F测试(19)和UniFrac(17)，仅提供社区之间差异程度的摘要信息。这些方法未能将差异放在分类上下文中。库比较使用RDP分类器对两个样本库中的序列进行快速分类。对两个样本的赋值进行比较，以估计使用统计检验偶然观察到每个分类单元表示差异的概率。

材料和方法

库比较。

对于1000个以上的细菌分类群中的每一个，将这两个样本进行比较，以估计观察到的成员可能是从单个潜在分布中偶然得出的概率。

对于分配了五个以上序列的分类群，使用标准的两种群比例检验来估计观察到差异的概率(7). 这个P（P）根据Z轴临界值，其中

以及在哪里N个₁和N个₂分别是库1和库2的序列总数，x个和年是分配给分类单元的序列数T型分别来自库1和库2，μ等于(x个+年)/(N个₁+N个₂).

对于分配了少于五个序列的分类群，首先开发了一种统计测试，用于比较“数字北方”分析中的转录水平(2)使用。观察到的分类单元分配差异的概率T型估计如下：

由于每个分类单元都要进行测试（多次测试），因此必须谨慎解释报告的显著性值。分类群（以及测试）是嵌套的，没有尝试对多个测试进行更正。

结果

我们通过对整个Bergey语料库进行详尽的leave-on-out测试来测试分类器。对于每个测试，我们从语料库中保留一个序列作为测试序列，并对其余序列重新训练分类器。对语料库中的所有序列重复该过程。该语料库包含453个属，以单个序列表示。对于这些序列，汇总统计中没有考虑（明显）错误的属分配，但结果包括了包含其他具有有效训练集的属的更高等级（图。​（图1）。1). 除了测试近全长序列外，我们还对从测试序列中随机选择的400、200、100和50个碱基的小邻接区域重复了RDP分类器的leave-on-out测试。近全长和400碱基片段的总体准确率在属水平上高于88.7%。对于200个碱基片段，准确率在科水平上仍高于92.1%，而在属水平上准确分类的准确率为83.2%。在门水平上，50个碱基片段的准确率仅为94.1%，在属水平上，准确率急剧下降至51.5%。

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图1。

按查询大小划分的总体分类准确性（使用Bergey语料库进行详尽的leave-on-out测试）。数字是正确分类的测试的百分比。

Bootstrap分析用于估计每个任务的置信度。总的来说，对于近全长序列，97.5%的分类单元分配在100个引导试验中的95个或更多匹配，这些分配98%的时间是正确的（表​（表22和​和3三).

我们还使用RDP-SeqMatch工具进行了一系列类似的详尽的leave-on-out测试。近全长测试序列的总体准确度与RDP分类器的结果相似：门、纲、目、科和属的等级分别为99.5%、98.8%、97.8%、95.1%和91.9%。

使用RDP 9对齐(8)，我们提取了对应于100个基本区域的大肠杆菌参考序列{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“J01695”，“term_id”：“170787319”，“term_text”：“J01695“}}J01695号以25个基本间隔，并独立使用每个区域进行详尽的leave-on-out测试，从每次测试的训练中删除相应的全长序列。一般来说，映射到16S高变区的区域的准确性更高（图。​（图2A）。2年). 在高变量区域，平均引导置信估计值同样较高（图。​（图2B2B型).

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图2。

（A） Bergey语料库的分类准确率，其序列段为100个碱基，每次移动25个碱基。上的灰色条x个axis定义了高变量区域。在所有100个基区中，属级的平均分类准确率为70%。（B） 每个段的平均引导置信估计。

对于393个在属水平上被错误分类的近全长序列中的每一个，我们通过使用RDP网站上对应的对齐序列计算序列之间的成对恒等式来确定与Bergey语料库其他成员的距离。对于250个错误分类的序列，不同属中的一个或多个序列比分类学中该序列所属的所有其他序列更接近（表​（表44).

为了理解其中三个错误分类的性质，我们研究了脂环杆菌科家庭。我们选择这个系列是因为它包含三个被RDP分类器错误分类的序列，其中只有一个被SeqMatch错误分类。Bergey对这三个序列的分类位置似乎与衍生的系统发育不一致（图。​（图3三).

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图3。

的系统发育分析脂环杆菌科，包括属硫杆菌属和脂环杆菌11种类型菌株的序列脂环杆菌科在Bergey的分类大纲5.0版中提供，以及四个脂环杆菌科大纲发布后可用的物种类型菌株（用星号标记），以及两个芽孢杆菌用加权邻接法分析种型菌株(5). 树的根是使用大肠杆菌序列J01695为外群。显示了超过85%的引导置信估计。RDP分类器所做的三个错误分类被突出显示，原始（5.0版）描述附加了一个更正的描述。二硫过氧化物链球菌^T型成为A.二硫氧化物^T型2005年，二硫过氧化物链球菌正式重新分类为新组合，A.二硫氧化物(14).热硫氧化物链球菌VKM 1269号^T型成为“A.耐受性K1。“在版本5中，序列Z21979被列为来自热硫氧化物链球菌这与该序列的原始出版物一致(25). 同一组后来报道，该序列可能来自热硫氧化物链球菌应变K1，而非VKM 1269(15). 型菌株的两个独立序列（X91080和AB089844）热硫氧化物链球菌可用。它们几乎相同（0.2%差异），与Z21979的差异为19%。2005年，热硫氧化物链球菌菌株K1被重新分类为一新种的类型菌株，A.耐受性(14). 然而，在我们的分析中，命名论文（登录号AF137502）中给出的K1序列与Z21979的序列相差8%。尽管自年起仍列在GenBank记录中A.耐受性菌株K1、Z21979很可能不是来自菌株K1，甚至不是来自该物种的成员A.耐受性。A.酸杆菌^T型成为芽孢杆菌sp.序列X60602发表于1991年，来自用于嗜酸土霉(1). GenBank记录也列出了来自菌株DSM 3922的菌株，但1992年报道了DSMZ提供的培养物中的菌株混合(27). 2005年，对类型菌株（ATCC 49025，DSMZ列出为等同于DSM 3922）进行了重新排序（AY573797[9]). 这两个序列相差14%，GenBank现在将X60602描述为芽孢杆菌服务提供商。

我们在由NCBI在其分类数据库中分类的23095个16S rRNA序列组成的更加多样化的语料库上测试了分类器的性能。如上所述，我们随机选择了其中20%（4619）的测试集进行离场测试。使用NCBI分类数据库和各种查询长度的准确性与前面的结果非常相似（表​（表55).

讨论

RDP分类器的开发是为了根据rRNA序列数据提供快速的分类位置。随着技术的进步，rRNA数据的获取变得更加容易，这些数据的使用已经超出了专门的分子系统发育学家的范围。对于许多这样的用户来说，完整彻底的系统发育分析可能不是一个选择。相反，这些用户可能只需要一种快速的方法，为他们的未知项提供分类位置。此外，高通量环境rRNA项目通常会在每个样本中产生数百到数十万个序列。想象所有这些序列都会被详细检查是不现实的。对于这些高通量实验，RDP分类器可以提供快速的分类位置和摘要数据，包括属于每个分类单元的输入序列数。

对于接近全长和400个碱基的部分rRNA序列，分类器精确到属水平，而即使有200个碱基的部分序列，分类器也精确到科水平。分类器对于长度为50个碱基的部分序列表现不佳，这可能是由于这种短部分序列提供的特征不足。

对于较短的序列，通过使用bootstrap估计分类可靠性，分类置信度大大提高（表​（表2）。2). 在我们的测试中，大多数分类作业都是以高度自信的方式完成的。对于近全长序列，大多数错误分类可能是由于基础分类法中的错误（见下文），但对于较短的序列，错误分类可能反映出缺乏数据。引导程序有助于确定可用数据是否足以进行可靠的分类。大多数可用的rRNA序列都很短（长度小于1200个碱基），短的部分序列通常用于环境调查测序。

朴素贝叶斯分类器是监督分类方法的一个例子。k-NN方法是另一种有监督的分类方法，可以说更简单，并且在实践中通常效果良好(16). 我们比较了RDP朴素贝叶斯分类器和RDP SeqMatch k-NN分类器。我们选择使用SeqMatch进行比较，因为它与RDP分类器一样，是通过RDP提供的。此外，SeqMatch已被证明比BLAST更准确地找到由成对对齐距离定义的最相似rRNA序列(8). RDP分类器和RDP SeqMatch的总体错误率几乎相同。然而，这些错误中只有大约三分之二是常见的（未显示）。对于这两种分类器，许多错误分类似乎都是由基础分类法中的错误造成的（未显示）；然而，这两个分类器对特定分类异常的反应往往不同。

RDP分类器使用Bergey语料库对393个错误分类中的许多（如果不是大多数的话）可能是由于潜在的（16S rRNA）系统发育和Bergey分类之间的差异。超过60%的错误分类序列实际上与其他属的序列更相似，而不是与本属的序列相似，这有力地证明了这些属可能不是单系的。这些错误分类在分类群中的分布并不均匀。在三个最具代表性的门中(厚壁菌属,变形杆菌属、和放线菌门)，的放线菌门错误最少（3%，或1220个试验中的31个），而厚壁菌属约为其5倍（13%，或1295次试验中的165次）。在厚壁菌属，超过三分之二的错误发生在课堂上梭菌属（449个试验中的108个），在该类别中真杆菌属在41个试验中有30个错误分类（见补充材料）。

为了确定分类学中错误来源的例子，我们对该家族中的分类错误进行了系统发育分析脂环杆菌科（图。​（图3）。三). RDP分类器从脂环杆菌科:二硫氧化物硫杆菌和嗜热硫氧化硫化杆菌，这两个都被错误地归类于该属脂环杆菌、和耐热菌，在属中被错误分类芽孢杆菌.SeqMatch仅分类错误嗜酸土霉有趣的是，RDP分类器所犯的这三个“错误”似乎与系统发育分析一致。文献检索证实，在Bergey 5.0版分类学大纲出版之后，所有三个分类学概要都按照RDP分类器给出的分类进行了重新评估。菌株最初归因于硫杆菌属都在2005年重新评估并重新分配到该属脂环杆菌，匹配RDP分类器的分类，但不再匹配SeqMatch中的分类。该序列最初归因于A.酸杆菌是文化融合的结果，属于该属芽孢杆菌，由两个分类器指定。与SeqMatch最近邻分类器不同，RDP朴素贝叶斯分类器使用整个属的平均信息，因此受个别错误放置的训练序列的影响较小。

焦频现在可以在不到8小时内产生高达100 Mb的电流（罗氏产品文献）。Sogin及其同事最近使用了第一个版本的焦磷酸测序技术，该技术提供了高达100 bp的读数，可以快速分析环境样本中大量的16S rRNA V6可变区域(23). 在该研究中，通过与经审查的V6序列参考数据库成员的比对来评估分类多样性。沿着16S rRNA分子的不同区域，RDP分类器对100碱基片段的分类精度差异很大（图。​（图2）。2). 一般来说，可变区域的分类比更多保护区域更准确。可变区域V2和V4(20)在属和科水平上（在所有置信水平下），正确分类的比率分别高达82%和90%，而包含V6区域的片段的准确度则不太可靠（在属水平上为73%）。V6区域相当小（46个碱基），两侧是高度保守的区域(6). 相反，V2区两侧各有一个，而V4区在3′侧各有一部分半晶区。这些区域可能解释了这些可变区域的精确度增加和峰值变宽的原因。随着焦磷酸测序技术读取长度的增加，这些区域可能成为良好的靶区。

在细菌学中，虽然命名法由官方代码管理，但并没有明确或官方的分类法。RDP分类器不仅限于使用Bergey提出的细菌分类法原核生物分类大纲(13). 我们选择使用Bergey的分类法，因为它很容易获得，而且伯杰氏系统细菌学手册在微生物界广受尊重。在接受NCBI分类法培训时，RDP分类器同样工作良好。这两种分类法之间有着显著的一致性，并且两者至少部分地基于系统发育原理。RDP分类器可能适用于未来可能获得认可的其他系统发育相关细菌分类。

对于来自分类法定义较少的细菌多样性区域的查询序列，RDP分类器倾向于提供具有低置信度估计的分类结果。例如，在一个酸性细菌环境克隆序列中，77个序列中有72个被分类，即使在门的水平上也不到80%的置信度（未显示）。这样的低置信度分类结果可能有助于确定更彻底的分析可能会产生最高回报的序列。

RDP分类器的速度足以处理大量样本。例如，在2.66-GHz Apple Intel Xeon处理器上，该程序每秒分类大约9个序列（每个序列有100个引导样本）。分类器的在线版本在几分钟内返回多达10000个用户序列的提交结果，并提供摘要和详细的分类分配。Library Compare工具能够根据分类组的分配来分析微生物群落的组成。此工具利用分类器快速比较两个样本，每个样本包含多达5000个序列。结果可以交互浏览，也可以以适合导入通用电子表格程序的形式下载。

RDP在内部使用RDP分类器和Bergey分类法已有4年多的时间，以便收集300000多个细菌rRNA序列。在此期间，RDP更新了分类器，以使用Bergey分类大纲的三个连续版本中的数据。随着物种的重新评估和差异的解决，这种分类学仍在发展。随着这些更新的发布，重新培训分类器并更新RDP库中序列的赋值相对简单。随着细菌分类法的不断发展，我们预计分类器的性能将继续提高。

补充材料

致谢

脚注

参考文献