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美国国家科学院院刊。2007年8月28日；104(35): 14056–14061.
2007年8月20日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0706517104
预防性维修识别码：项目经理1950339
PMID：17709744

确定IRS-1 Ser-1101作为S6K1在营养和肥胖诱导的胰岛素抵抗中的靶点

弗雷德里克·特伦布雷,*† 苏菲·布雷尔,* 宋熙嗯,‡ 于莉,§ Kohei Masuda公司,‡ 迈克尔·罗德恩, 孙小健,‖ 迈克尔·克雷布斯,** 罗伯托·波拉基维茨（Roberto D.Polakiewicz）,§ 乔治·汤姆斯,‡††和安德烈·马雷特*††
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摘要

S6K1已成为通过磷酸化和抑制IRS-1功能发展胰岛素抵抗的关键信号成分。这种效应可以由氨基酸等营养物质直接触发，也可以通过稳态负反馈回路由胰岛素触发。然而，S6K1在营养过剩的生理环境中调节IRS-1磷酸化的作用尚未解决。这里我们显示S6K1直接磷酸化IRS-1 Ser-1101在体外在蛋白质的C末端结构域中，该位点的突变在很大程度上阻断了氨基酸抑制IRS-1酪氨酸和Akt磷酸化的能力。与这一发现一致，肥胖患者肝脏中IRS-1 Ser-1101的磷酸化增加分贝/分贝和野生型，但不是S6K1系列−/−，小鼠维持高脂肪饮食，并被S6K1蛋白的siRNA敲除阻断。最后，在人体内输注氨基酸会导致S6K1的伴随激活、IRS-1 Ser-1101的磷酸化、IRS-功能的降低以及骨骼肌中的胰岛素抵抗。这些发现表明，S6K1的营养和激素依赖性激活在一定程度上通过调节IRS-1 Ser-1101磷酸化导致小鼠和人类的胰岛素抵抗。

关键词：mTOR、营养感应、氨基酸、胰岛素信号

血糖水平的维持涉及外周组织和胰岛β细胞之间的复杂相互作用(1). 胰岛素触发下游代谢活动（定义为胰岛素抵抗）的能力受损与2型糖尿病的发生密切相关(2). 多种机制被认为是诱导胰岛素抵抗的分子基础(2,三)其中IRS-1对丝氨酸残基的磷酸化已成为一个关键事件(4). 事实上，大量蛋白激酶已被证明能引起IRS-1的丝氨酸磷酸化，包括JNK(5)、IKK(6)，ERK公司(7)，PKC-ζ(8,9)，PKC-θ(10)，百万TOR(11)、以及最近的S6K1(12,13). 已知IRS-1被丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化，通过否定IRS-1作为胰岛素受体酪氨酸激酶信号介体的能力，导致胰岛素信号的抑制(4).

营养过剩是胰岛素抵抗的决定性原因(14)最近的证据表明，mTOR/raptor/GβL（mTOR复合物1）信号复合物是营养和激素信号的效应器(15–17)和其下游目标S6K1是此响应中的关键组件(13,18,19). 胰岛素或氨基酸激活该途径已被证明会导致IRS-1丝氨酸磷酸化增加，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）信号传导中断，以及L6心肌细胞和3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运抑制(20–23). 此外，在小鼠体内注射雷帕霉素可以减少IRS-1的丝氨酸磷酸化，并延长骨骼肌中胰岛素刺激的PI3激酶活性(24). 通过对TSC1–TSC2肿瘤抑制复合物的研究，进一步揭示了S6K1活化与IRS-1丝氨酸磷酸化之间的分子机制，该复合物是典型PI3-激酶信号通路的组成部分，可抑制胰岛素诱导的mTOR复合物1信号和S6K1激活(13). 小鼠胚胎成纤维细胞中这种复合物的破坏导致构成性S6K1激活，导致IRS-1磷酸化和降解，以及IRS-1转录的抑制(12,25). 在TSC1–TSC2缺陷细胞中观察到的对IRS-1功能的负面影响比在胰岛素抵抗模型中观察到更为明显(12,25)可能是因为S6K1的本构激活。事实上，S6K1在营养超载环境中的生理重要性可能与TSC1–TSC2的丢失不同。S6K1在肥胖动物肝脏、脂肪和肌肉中的激活水平升高反映了其在此类环境中的关键作用(26,27)S6K1缺乏小鼠能够抵抗饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗(27).

虽然S6K1在调节胰岛素作用中的作用是明确的(13,18,19)，S6K1是否在营养过剩的生理环境中直接介导IRS-1磷酸化还有待确定。雷帕霉素治疗已证明可抑制Ser-307、Ser-312、Ser-612和Ser-636/639上IRS-1的磷酸化（IRS-1 Ser残基的人类标记）(11,12,23,24,27,28). 在这些残基中，mTOR已被证明直接催化Ser-636/639的磷酸化(11)而S6K1被证明磷酸化Ser-307（小鼠Ser-302）在体外(12).S6K1系列−/−小鼠在Ser-312（小鼠Ser-307）和Ser-636/639上显示IRS-1磷酸化降低(27)，尽管这两个站点都不属于S6K1识别基序。在此，我们确定Ser-1101是IRS-1中S6K1介导的磷酸化位点。我们进一步发现，在营养过剩和肥胖情况下，Ser-1101的磷酸化增加，它还通过抑制PI3-激酶/Akt信号通路参与抑制胰岛素作用，从而导致胰岛素抵抗。

结果

氨基酸利用率增加导致对雷帕霉素敏感的胰岛素信号抑制。

已知通过mTOR复合物1信号通路的营养感应会在许多细胞类型中引起胰岛素信号的抑制(13). 使用L6肌肉细胞，我们发现向培养基中添加氨基酸显著增加了S6K1激酶活性，这与IRS-1对丝氨酸和苏氨酸残基的过度磷酸化有关，与氨基酸分泌细胞相比，SDS/PAGE上蛋白质的流动性降低，PI3-激酶的活化受损[支持信息（SI）图6A–C]. 重要的是，这些信号缺陷与胰岛素对葡萄糖转运的缺陷刺激有关(SI图6D类). 相比之下，雷帕霉素对mTOR复合物1信号的抑制消除了S6K1活性，恢复了氨基酸处理细胞的IRS-1迁移行为、PI3-激酶活性和葡萄糖摄取(SI图6E–H（E–H）). 这些发现表明，氨基酸可用性促进L6心肌细胞的胰岛素抵抗状态，这是由雷帕霉素敏感性IRS-1丝氨酸和苏氨酸磷酸化介导的。

Ser-1101的S6K1磷酸化物IRS-1。

为了解决S6K1直接磷酸化IRS-1的能力，编码IRS-1特定结构域的GST融合蛋白作为S6K1底物在在体外激酶测定(图1A类). 独立实验结果表明，从L6肌肉细胞免疫纯化的S6K1具有磷酸化IRS-1的N-、中间和C-末端结构域的能力(图1B类). 此外，每个实验中S6K1介导的IRS-1磷酸化程度取决于胰岛素和氨基酸刺激，而雷帕霉素治疗可消除这种反应(图1B类). 为了确定S6K1对每个特定IRS-1片段的相对偏好，将相同实验中的激酶反应产物在通用SDS/PAGE上解析，并且32P掺入量标准化为每次试验使用的GST-IRS-1的量。尽管它可能不能反映S6K1对特定磷酸化位点的亲和力体内，我们发现，在在体外设置，S6K1首选GST-IRS-1C类（基生以上10倍；P（P）<0.01），与GST-IRS-1相比N个或GST-IRS-1M（M）（分别是基生以上的6倍和4倍；P（P）<0.01）(图1C类).

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S6K1磷酸化IRS-1。(A类)将缺乏血清的L6细胞在氨基酸或含氨基酸的培养基中培养1小时，并在培养的最后30分钟内用100 nM胰岛素刺激或不刺激，如图所示，然后在1小时培养期间添加0.01%二甲基亚砜载体或25 nM雷帕霉素。(B类和C类)使用编码IRS-1不同结构域的GST融合蛋白测定S6K1的激酶活性（如A类). 通过SDS/PAGE分析底物量对照（GST-IRS-1），然后进行考马斯蓝染色。自动放射自显影是至少三个独立实验的代表。酒吧C下部表示使用GST-IRS-1作为底物对S6K1活性进行三次独立测定的平均值±SE。*，P（P）与使用GST-IRS-1进行的相应S6K1分析相比，<0.01N个或GST-IRS-1M（M）作为基底。

为了识别IRS-1的C末端结构域中潜在的S6K1介导的磷酸化位点，我们搜索已知的S6K1-底物识别基序RxRxxS公司x个(29)，并识别Ser-1101(1)作为具有这种主题的独特序列。测试S6K1调节Ser-1101磷酸化的能力在体外、GST-IRS-1C类在没有或存在雷帕霉素的情况下，将片段与来自经胰岛素处理的L6肌肉细胞的S6K1孵育，并用磷酸特异性抗体测定Ser-1101磷酸化的程度。结果表明，来源于胰岛素处理细胞的S6K1增加了Ser-1101磷酸化，这种作用因氨基酸的存在而增强，并通过雷帕霉素（25 nM）预处理而完全减弱(图2A类). 平行实验表明，Ser-1101没有被来自相同细胞的S6K2免疫沉淀磷酸化(图2A类)尽管它对40S核糖体蛋白S6有活性（数据未显示和参考。30). 我们还发现，来自L6细胞的S6K1免疫沉淀物中既没有S6K2也没有mTOR，这与S6K1与S6K2在介导IRS-1 Ser-1101磷酸化中的特异参与一致(SI图7). 重要的是，该位点的丝氨酸-丙氨酸突变强烈减弱32P并入GST-IRS-1C类S6K1免疫沉淀的S1101A来自胰岛素刺激的L6心肌细胞、3T3-L1脂肪细胞或Fao肝癌细胞(图2B类)表明Ser-1101是IRS-1 C末端结构域中S6K1介导的主要磷酸化位点。事实上，磷酸化仍然发生在GST-IRS-1中C类S1101A肽提高了选择性S6K1磷酸化位点的可能性，尽管识别基序较弱。我们之前报道过PKC-θ也磷酸化IRS-1 Ser-1101(10). 然而，在S6K1免疫沉淀物中既不存在PKC-θ、δ、z，也不存在γ(SI图7)，排除了这些激酶在S6K1介导的IRS-1 Ser-1101磷酸化中的潜在作用。

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S6K1在序列-1101磷酸化IRS-1。将缺乏血清的L6细胞在氨基酸或含氨基酸的培养基中培养1小时，并在培养的最后30分钟内用100 nM胰岛素刺激或不刺激，如图所示，然后在1小时培养期间添加0.01%二甲基亚砜载体或25 nM雷帕霉素。(A类)使用GST-IRS-1测定S6K1和S6K2的激酶活性（仅使用冷ATP）C类作为底物，然后通过SDS/PAGE分析反应产物，使用仅在Ser-1101磷酸化时检测IRS-1的抗体。基质量控制（GST-IRS-1C类)用SDS/PAGE分析免疫沉淀激酶（S6K1或S6K2），然后分别用考马斯蓝染色和特异性抗体的Western blot进行分析。(B类)S6K1的激酶活性由在体外GST-IRS-1激酶测定C类或GST-IRS-1C类（S1101A）作为衬底。三个单独实验的平均值±SE如下所示B。*,P（P）与使用野生型GST-IRS-1进行的相应S6K1分析相比，<0.01C类作为基底。

IRS-1在Ser-1101的磷酸化取决于营养物质的可用性并导致胰岛素信号的抑制。

因为氨基酸增加了胰岛素诱导的IRS-1对丝氨酸和苏氨酸残基的过度磷酸化(SI图6B类)接下来，我们通过增加IRS-1 Ser-1101磷酸化来确定这种效应是否反映在特定细胞模型中。结果表明，当L6肌肉细胞在富含氨基酸的培养基中孵育时，胰岛素诱导的IRS-1 Ser-1101和S6K1 Thr-389磷酸化均增加，而雷帕霉素抑制了这种作用(图3顶部). 在3T3-L1脂肪细胞中也获得了类似的结果(图3 中部)和Fao肝癌细胞(图3 底部). 因此，IRS-1在Ser-1101的磷酸化和S6K1在胰岛素靶细胞中的激活状态与在在体外实验中，发现S6K1以雷帕霉素敏感的方式介导Ser-1101处IRS-1的磷酸化。

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IRS-1在Ser-1101的磷酸化取决于营养物质的可用性。将血清剥夺的L6肌肉细胞、3T3-L1脂肪细胞或Fao肝癌细胞在含氨基酸或氨基酸产生的培养基中培养1 h，并用100 nM胰岛素刺激或不刺激，如图所示，然后在1 h培养期间添加0.01%二甲基亚砜载体或25 nM雷帕霉素。IRS-1和S6K1的磷酸化是通过使用仅在Ser-1101和Thr-389磷酸化时识别IRS-1及S6K1之抗体来测定的。对总IRS-1和S6K1的剥离膜进行重复处理。结果是一个具有代表性的实验重复至少三次。

为了评估IRS-1 Ser-1101磷酸化对胰岛素信号的功能影响，我们接下来测量了胰岛素在转染CHO细胞后诱导HA表位标记的野生型IRS-1（HA-IRS-1）或IRS-1 S1101A（HA-IRS-1 S1101A）突变体酪氨酸磷酸化的能力。用氨基酸和胰岛素孵育CHO细胞可增加Ser-1101上HA-IRS-1的磷酸化，但不增加HA-IRS-1S1101A突变体的磷酸化(图4 A类和D类). 重要的是，IRS-1在Ser-307、Ser-312和Ser-636/639（相当于小鼠Ser-302、Ser-307和Ser-632/635）的磷酸化似乎不受HA-IRS-1的S1101A突变的影响(图4A类和SI图8). 我们进一步观察到，与野生型HA-IRS-1相比，氨基酸存在下胰岛素诱导的HA-IRS-1S1101A酪氨酸磷酸化显著升高(图4 B类和E类). 这些发现表明S6K1对Ser-1101的磷酸化对胰岛素受体信号传导具有抑制作用。与这一结论一致，我们发现，与表达野生型IRS-1突变形式的细胞相比，表达S1101A突变形式IRS-1的细胞中，PI3激酶下游效应物Akt Ser-473磷酸化增强(图4 C类和F类).

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Ser-1101处IRS-1的磷酸化导致胰岛素信号的抑制。如图所示，将表达HA-IRS-1或HA-IRS-1（S1101A）的血清缺失CHO细胞在氨基酸脱辅或含氨基酸培养基中培养1 h，并在培养的最后30 min内用100 nM胰岛素刺激或不刺激。(A类和B类)通过使用针对IRS-1 Ser-307、Ser-312、Ser-636/639和Ser-1101的磷酸特异性抗体，在抗HA免疫沉淀物中测定IRS-1的磷酸化(A类)和磷酸酪氨酸(B类). 抗HA免疫沉淀物中恢复的HA-IRS-1水平也显示出来。(C类)使用抗磷酸化Akt Ser-473抗体测定全细胞提取物中的磷酸化和Akt表达(上部)和Akt(下部). 结果是一个具有代表性的实验重复至少三次。(D–F型)IRS-1 Ser-1101的量化(D类)，IRS-1轮胎(E类)和Akt Ser-473(F类)磷酸化。*，P（P）与表达野生型HA-IRS-1的相应CHO细胞相比，<0.05。

IRS-1 Ser-1101磷酸化在小鼠和人类肥胖和营养素诱导的胰岛素抵抗中的增加：S6K1的作用。

我们之前的研究表明，饮食诱导肥胖大鼠肝脏中的S6K1 Thr-389磷酸化在空腹状态下显著升高，并且在胰岛素存在的情况下，这种反应加快，在注射后5分钟达到峰值(26). 在这里，我们确定了小鼠遗传性肥胖是否与S6K1激活和Ser-1101上IRS-1磷酸化增加有关。如所示图5A类在瘦肉动物的肝脏中，S6K1 Thr-389和IRS-1 Ser-1101磷酸化几乎未检测到数据库/数据库老鼠。在这些瘦小鼠中，急性（5分钟）胰岛素注射略微增加了S6K1激活和IRS-1 Ser-1101磷酸化。与之形成鲜明对比的是，肥胖糖尿病患者的肝脏中S6K1激活和IRS-1 Ser-1101磷酸化显著增加数据库/数据库急性胰岛素刺激进一步增强了这一发现(图5A类). 为了进一步评估S6K1在动物、野生型和S6K1系列−/−小鼠被置于正常饮食或高脂肪饮食中14周。我们最近发现，高脂肪饮食在野生型中诱导显著的胰岛素抵抗，但在S6K1系列−/−，只老鼠(27). 在这里，我们发现高脂肪饮食动物的胰岛素抵抗发展与野生型IRS-1 Ser-1101磷酸化增加有关，但与此无关S6K1系列−/−，只老鼠(图5B类). 后面的发现与我们之前的观察结果一致，即S6K1在肥胖啮齿类动物的肝脏中被组成性激活(26,27)因此，在胰岛素抵抗的情况下，有助于IRS-1 Ser-1101过度磷酸化。

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在肥胖和营养素诱导的小鼠和人类胰岛素抵抗中IRS-1 Ser-1101磷酸化增加：S6K1的作用。(A类)十四周龄瘦肉(数据库/数据库)和肥胖糖尿病(数据库/数据库)在收集肝脏之前，用3.8单位/kg的生理盐水或胰岛素对小鼠进行急性静脉注射（5min）。(B类)Ten-wek-old野生型或S6K1系列−/−在收集肝脏之前，将小鼠维持在正常食物（−）或高脂肪（+）饮食中14周。(A类和B类)结果是在每组至少三只不同的动物身上重复进行的一个具有代表性的实验。(C类和D类)通过siRNA降低S6K1降低IRS-1 Ser-1101磷酸化。缺乏血清的HeLa细胞(C类)或L6心肌细胞(D类)用含有或不含200 nM胰岛素的氨基酸刺激30分钟(E类)在生理盐水和氨基酸输注过程中进行人体骨骼肌活检。在胰岛素输注（−）前120分钟和餐样高胰岛素血症（+）后30分钟进行活检。通过Western blotting分析检测S6K1和IRS-1的表达，以及IRS-1 Ser-636/639或Ser-1101的磷酸化。结果是在至少五名配对受试者中重复进行的一项具有代表性的实验。

使用siRNA-介导的基因沉默，我们先前证明S6K1以细胞自主方式增加IRS-1 Ser-312和Ser-636/639磷酸化(27). 因此，我们测试了该发现是否也适用于IRS-1 Ser-1101。用siRNAs降低HeLa细胞中S6K1水平(图5C类)和L6心肌细胞(图5D类)在没有或存在胰岛素刺激的情况下导致IRS-1 Ser-1101磷酸化降低。此外，我们发现S6K1沉默部分降低了L6肌肉细胞中Ser-636/639处IRS-1的磷酸化(图5D类)这与我们之前在HeLa细胞中的观察结果一致(27). 因此，去除S6K1以细胞自主方式降低IRS-1 Ser-1101磷酸化。

最后，我们验证了以下假设：营养素诱导的胰岛素抵抗也与S6K1介导的人类IRS-1 Ser-1101磷酸化导致的胰岛素信号障碍有关。配对的健康受试者被注入生理盐水或氨基酸，并在胰岛素刺激前后进行肌肉活检。利用这一实验范式，我们先前报道过氨基酸诱导人胰岛素抵抗与S6K1的过度激活有关(31,32). 在这里，我们表明，如增加的Thr-389磷酸化所示，S6K1的激活状态与人类骨骼肌中IRS-1 Ser-1101磷酸化和胰岛素抵抗紧密相关(图5E类). 事实上，尽管胰岛素本身略微增加了Ser-1101的IRS-1磷酸化，但氨基酸和胰岛素的联合输注导致Ser-1101处IRS-1的磷酸化显著增加，并严重削弱了IRS-1相关PI3-激酶催化在体外PI3-磷酸的形成，所有这些都与这些受试者中S6K1的过度磷酸化状态一致(图5E类).

讨论

mTOR复合物1–S6K1信号轴是多种输入的中心整合点，包括氨基酸和激素(15–17). mTOR复合物1及其下游效应器S6K1最初被认为是翻译事件的重要调节剂，现在被认为有助于作用于IRS-1的负反馈回路的操作(13,18,19,22,27). 基于氨基酸对胰岛素刺激的PI3-激酶活性的抑制与S6K1和IRS-1丝氨酸磷酸化的激活迅速而暂时相关的观察结果，我们提出了这种负反馈机制的存在，该过程被mTOR复合物1/S6K1抑制剂雷帕霉素完全消除(13,22). 在年的研究中首次出现了将S6K1作为这种负反馈循环的关键元素的证据果蝇属，证明了果蝇属S6K1的同源基因dS6K是dAkt信号的负调控因子(33,34). 利用生物化学和遗传学方法，最近的研究表明S6K1参与了哺乳动物细胞中IRS-1–PI3-激酶–Akt通路的抑制反馈回路(13,18,19,27). 此外，研究发现S6K1在肥胖动物的肝脏、肌肉和脂肪组织中高度活跃，与IRS-1丝氨酸磷酸化增加和Akt活化缺失平行(26,27). S6K1介导IRS-1的营养依赖性和雷帕霉素敏感性磷酸化的基本机制已成为胰岛素信号传导中的一个关键问题。

为了解决这个问题，我们设计了一款S6K1在体外激酶测定，其中使用编码IRS-1的特定结构域的GST融合蛋白作为底物。我们发现，从胰岛素和氨基酸处理的细胞中纯化的S6K1具有磷酸化位于IRS-1不同结构域内的多个残基的能力。通过质谱和Western blotting进一步分析S6K1介导的IRS-1 N末端结构域磷酸化，确定Ser-307是激酶的直接靶点（F.Tremblay、S.Brölé、J.Hunter和a.Marette，未发表的数据）。这些结果与哈灵顿的发现一致等。(12)，谁发现IRS-1被磷酸化在体外S6K和IRS-1在Ser-302（S302A）的突变（相当于人类Ser-307）钝化了其N末端部分的磷酸化。IRS-1中间部分分析（GST-IRS-1M（M）)当在Ser-636/639磷酸化时，显示对识别IRS-1的抗体的免疫反应（数据未显示）。这一发现并不令人惊讶，因为研究表明，肥胖小鼠这些位点的营养和激素依赖性磷酸化增强(27)，被雷帕霉素阻断(23,24,26)，并发现其脂肪组织中严重减少S6K1系列−/−小鼠(27)以及siRNA介导的HeLa细胞和L6心肌细胞中S6K1的敲除(图5 C类和D类). 与这些发现一致，Shah和Hunter(35)发现Ser-636/639磷酸化虽然不是由S6K1直接介导的，但依赖于IRS-1的S6K1磷酸化体内采用雷帕霉素耐药型S6K1，他们表明，在雷帕霉素存在下，IRS-1 Ser-636/639磷酸化不受影响，认为该位点的激酶调节磷酸化与mTOR不同(35). 然而，其他研究表明，mTOR/raptor在Ser-636/639处直接磷酸化IRS-1，雷帕霉素甚至在表达雷帕霉素耐药型S6K1的NIH 3T3细胞中也抑制这种反应(36). 还应注意的是，S6K1激酶ead突变体的过度表达减弱了293HEK细胞中IRS-1 Ser-636/639的磷酸化(36)支持S6K1通过第二位点磷酸化可以介导该位点的磷酸化。显然，需要更多的研究来阐明S6K1通过mTOR/猛禽和/或其他脯氨酸导向激酶促进Ser-636/639磷酸化的机制。

本研究的主要发现是在IRS-1的C末端Ser-1101处识别出S6K1磷酸化位点。在骨骼肌、肝脏和脂肪细胞中进行的实验表明，该位点的磷酸化依赖于胰岛素刺激，并受氨基酸的调节。此外，我们发现Ser-1101处IRS-1的磷酸化和L6心肌细胞S6K1的激活状态密切反映了在体外检测结果，其中S6K1被发现以雷帕霉素敏感的方式介导Ser-1101处IRS-1的磷酸化。与这一发现一致，该位点的丝氨酸-丙氨酸突变显著降低了IRS-1的磷酸化C类片段，与此残基是S6K1磷酸化的主要位点一致。突变分析进一步揭示了该位点在胰岛素抵抗发展中的重要性在体外因为表达Ser-1101-不可磷酸化形式IRS-1的细胞显示胰岛素诱导的IRS-1酪氨酸磷酸化和Akt-Ser-473磷酸化增强。Ser-1101的磷酸化干扰其酪氨酸磷酸化的机制尚待阐明，但可以推测，Ser-1101在IRS-1的C末端区域的一个或多个潜在酪氨酸磷酸化位点上引起空间位阻，可能拮抗PI3-激酶结合(37). 重要的是，尽管已知与胰岛素抵抗相关的残基Ser-307、Ser-312和Ser-636/639的磷酸化没有改变，但表达IRS-1突变形式（S1101A）的细胞中Akt的胰岛素信号得到改善(5,11,12,24). 这些结果表明，S6K1在Ser-1101对IRS-1的磷酸化有助于在营养素过量的条件下诱导胰岛素抵抗。

哈灵顿最近放映了S6K等。(12)磷酸化IRS-1片段（IRS-1899−1235)包含小鼠IRS-1的899–1235残基。然而在体外IRS-1的磷酸化899−1235与S6K磷酸化IRS-1片段（IRS-1）的能力相比较弱108−516)含有Ser-302。在比较这些发现时，重要的是要注意到哈林顿等。使用从昆虫细胞纯化的重组S6K2在体外激酶分析，而我们使用从胰岛素和氨基酸刺激的哺乳动物细胞中免疫沉淀的S6K1。我们发现S6K1而不是S6K2介导Ser-1101的磷酸化。鉴于GST-IRS-1中存在大量丝氨酸和苏氨酸残基C类可以想象，S6K1和S6K2优先靶向IRS-1内的不同残基。

啮齿类动物的高脂肪喂养通过促进脂肪组织以及肝脏和骨骼肌中甘油三酯的过度储存而导致胰岛素抵抗(38–40). 也有证据表明高脂肪喂养大鼠骨骼肌中氨基酸的可用性增加(41). 我们最近观察到肥胖动物的脂肪、肝脏和肌肉中S6K1过度激活(26,27)小鼠中S6K1的缺失保护了这些动物免受饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗的发展(13,27). 我们现在提供证据表明，与瘦肉、低脂饮食小鼠相比，脂肪摄入增加导致肥胖的动物肝脏中IRS-1在Ser-1101的磷酸化增加。S6K1在这一过程中的病理生理作用可以通过以下观察得到证明：当喂食高脂肪饮食时，S6K1缺陷小鼠的IRS-1在Ser-1101的磷酸化没有增加，这一发现与它们改善的胰岛素敏感性相一致(27). 在通过RNA干扰去除S6K1后，发现IRS-1 Ser-1101磷酸化钝化，这表明这些作用是以细胞自主的方式介导的。

我们以前报道过，Ser-1101的磷酸化是由胰岛素抵抗的“经典”介质诱导的，如游离脂肪酸和TNF-α(10). 我们进一步发现PKC-θ是一种重要的IRS-1丝氨酸激酶，在PKC家族的其他成员中，IRS-1在Ser-1101的磷酸化在PKC公司-θ−/−小鼠(10). 这些结果强调了Ser-1101作为IRS-1磷酸化位点的重要性，该位点通过PKC-θ和S6K1的营养/激素输入整合应激/肥胖信号，从而形成胰岛素抵抗状态。相比之下，最近的一项研究未能观察到TSC1–TSC2缺陷小鼠胚胎成纤维细胞中Ser-1101磷酸化升高，TSC1–TS C2复合物功能的丧失导致mTOR–S6K1通路显著且无调节的过度激活(35). 然而，mTOR和S6K1在该模型中被组成性激活，导致IRS-1对其他丝氨酸残基的显著过度磷酸化，并显著降解IRS-1(12,25,35). 这一发现明显不同于经典胰岛素抵抗模型中S6K1相对温和且受调控的过度激活，例如肥胖饮食和遗传模型中的肝脏和肌肉(图5 A类和B类) (26,27)或人体肌肉中注入氨基酸(图5E类). 事实上，在这些模型中，我们没有发现IRS-1降解的证据，尽管Ser-1101的磷酸化增加，这表明S6K1的Ser-1101磷酸化是负反馈回路激活的早期事件，对IRS-1的蛋白酶体降解可能不是必需的。

与小鼠一样，人类营养素的过度摄入会促进胰岛素抵抗(13,14). 早期研究也表明，肥胖胰岛素抵抗者的血浆氨基酸浓度，特别是支链氨基酸浓度升高(13,42,43). 与我们在L6心肌细胞中的观察结果类似，人体生理性高胰岛素血症期间氨基酸可用性增加会损害骨骼肌的葡萄糖摄取(31). 在本报告中，我们探讨了氨基酸诱导的胰岛素抵抗与S6K1介导的Ser-1101处IRS-1磷酸化有关的可能性。我们发现，虽然单独注射胰岛素几乎不会增加S6K1活性，但胰岛素和氨基酸的结合会导致S6K1的强烈激活，并增加Ser-1101处IRS-1的磷酸化。这些数据有力地支持了我们之前的结果，即当营养素过量时，S6K1促进了人类的胰岛素抵抗状态(32)与我们之前在小鼠身上的发现一致(27). S6K1活化增加是否是人类肥胖和胰岛素抵抗的常见特征目前尚不清楚，但使用针对IRS-1（Ser-1101）和S6K1（Thr-389）的磷酸化特异性抗体作为诊断工具，可能有助于预测和设计治疗方法。

总之，本研究认为，氨基酸利用率的增加部分通过促进S6K1介导的Ser-1101处IRS-1磷酸化导致胰岛素抵抗。更重要的是，我们的数据强烈表明，S6K1对IRS-1 Ser-1101的磷酸化是动物和人类在营养饱和期间胰岛素抵抗发展的重要原因因素。

方法

GST-融合蛋白质。

包含大鼠IRS-1片段的GST-融合蛋白，GST-IRS-1N个（氨基酸2–516），GST-IRS-1M（M）（氨基酸526–859）和GST-IRS-1C类（氨基酸900–1235）之前已经描述过(44). S1101A突变是以pGEX-2T/GST-IRS-1（氨基酸900–1235）为模板，以5′-GAGGAGGCACAGCGCCGAGACCT-CTCG-3′和5′-CAGAGAGGTTCGGCGGTGCCTC-3′为诱变引物产生的。测序证实插入突变。

抗体。

用于免疫沉淀S6K1、S6K2和IRS-1的多克隆抗体从Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）获得。IRS-1和S6K1免疫印迹的多克隆抗体来自Upstate Biotechnology（纽约州普莱西德湖）。抗磷酸酪氨酸、IRS-1（Ser-307、Ser-312、Ser-636/639和Ser-1101）、S6K1（Thr-389）和Akt（Ser-473）的抗体购自Cell Signaling Technology。

细胞培养和治疗。

L6骨骼肌细胞在含有10%FBS的α-MEM中培养，直至达到70%的融合。为了诱导分化，细胞在含有2%FBS的α-MEM中进一步培养7天。如前所述，3T3-L1脂肪细胞生长并分化(23). 大鼠肝癌Fao细胞在添加10%FBS的RPMI培养基1640中生长和维持。CHO IR/IRS-1细胞在含有10%FBS（FBS）的DMEM中培养，并转染野生型HA-IRS-1或HA-IRS.1（S1101A），如前所述(10).

RNA干扰。

纯化、退火与人S6K1（5′-AAGGGGCTATGGAAGGTTT-3′）对应的RNAi双链体，并使用寡病毒胺（Invitrogen，Carlsbad，CA）转染HeLa细胞。对照组以相同的方式处理，但没有转染siRNAs。60小时后，将细胞剥夺血清过夜，然后剥夺氨基酸2小时。此时，用含有或不含有200nM胰岛素的氨基酸刺激细胞30分钟。通过蛋白质印迹分析测量RNAi对S6K1表达的影响。

老鼠研究。

拉瓦尔大学动物护理和处理委员会和弗里德里希·米歇生物医学研究所（瑞士巴塞尔）批准了动物研究。S6K1系列−/−小鼠的产生如前所述(45). 在10周龄时，雄性小鼠被指定为正常的饮食（KLIBA-NAFAG，饮食3807）或高脂肪饮食（研究饮食，饮食D12492），持续14周。收集6小时禁食小鼠的肝脏，并在液氮中冷冻，直至分析。精益数据库/数据库和肥胖数据库/数据库小鼠在尾静脉注射生理盐水或胰岛素（3.8单位/kg）前禁食5h。注射5分钟后，取下肝脏并在液氮中冷冻，直至进行上述分析(26).

人体受试者和肌肉活检。

如前所述，在氨基酸输注和对照盐水输注期间，对健康男性志愿者进行了两次随机研究(31).

PI3-激酶分析。

如前所述，在IRS-1免疫沉淀物中测量PI3-激酶活性(22).

S6K1/2激酶测定。

如前所述，使用S6K1底物测量S6K1活性(23). 在一些实验中，还使用5μg GST-IRS-1测定S6K1和S6K2激酶活性C类作为基底。

统计分析。

用方差分析比较氨基酸、胰岛素和雷帕霉素的作用，然后用最小二乘法测定。差异被认为具有统计学意义P（P）<0.05。

补充材料

支持数字：

致谢

我们感谢Attila Brehm博士和Elisabeth Bernroider博士的人类研究方案，感谢Luce Dombrowski博士对肌肉活检的生化分析的帮助，感谢Patrice Dallaire和Sandra Favret博士在维护和护理数据库/数据库和数据库/数据库老鼠。这项工作得到了加拿大卫生研究院研究员奖和拨款（授予a.M.）、美国国立卫生研究院（NIH）拨款（授予G.T.）、美国国立卫生研究院拨款R01 DK73802（授予G.T.和K.M.）、诺华生物医学研究所拨款（授予G.T.）、奥地利科学基金会拨款P15656，欧洲糖尿病研究基金会Novo-Nordisk 2型糖尿病补助金、Herzfelder家庭信托基金（发给M.R.）、奥地利糖尿病协会补助金（发给M.K.）、加拿大卫生研究院学生奖学金（发给F.T.）和魁北克圣母院国家研究员基金（发给a.M.）。

脚注

作者声明没有利益冲突。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/cgi/content/full/0706517104/DC1.

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