分子生物学细胞。2003年6月；14(6): 2603–2616.
p38 MAP激酶对PRAK亚细胞定位的调控
,* ,†和*‡
利国新
*加利福尼亚州拉荷亚斯克里普斯研究所免疫学系92037
贾怀汉
*加利福尼亚州拉荷亚斯克里普斯研究所免疫学系92037
苏珊娜·普菲弗（Suzanne R.Pfeffer），监控编辑器
*加利福尼亚州拉荷亚斯克里普斯研究所免疫学系92037
†第一军医大学病理生理学系，中国广州
收稿日期：2002年8月27日；2002年12月17日修订；2003年2月5日接受。
摘要
p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在在细胞对炎症刺激和环境压力的反应中的作用。p38调节/激活蛋白激酶（PRAK，也称为有丝分裂原激活蛋白激酶激活的蛋白激酶5（MAPKAPK5）在p38α和p38β介导p38通路的信号传导。免疫染色显示内源性PRAK主要定位于细胞质。有趣的是，体外表达的PRAK定位于通过p38α或p38β的共表达，细胞核可以重新分布到p38α和p38β的位置。对接槽中的突变p38α/p38β或PRAK中的p38对接位点干扰了PRAK-p38p38α和p38β相互作用及受损重新分配体外表达的PRAK，表明PRAK的位置可以通过与p38α和p38β的对接作用来控制。尽管大多数PRAK分子在细胞质中检测到一直在细胞质和细胞核之间穿梭。A序列对PRAK的分析表明，PRAK既包含假定的核出口序列（NES）和核定位序列（NLS）。穿梭于PRAK需要PRAK中的NES和NLS基序，并且可以通过细胞调节应激刺激引起的激活。PRAK的核含量降低刺激后，由于PRAK和PRAK核出口的增加。PRAK的核进口独立于p38激活，但核输出需要p38介导的PRAK磷酸化。因此PRAK由多个因素决定，包括其自身的NES和NLS、对接PRAK和对接蛋白之间的相互作用，PRAK的磷酸化，以及细胞激活状态。p38 MAPK不仅调节PRAK活动，而且PRAK激活相关易位，但也将PRAK停靠到选定位置休眠细胞中的亚细胞位置。
材料和方法
试剂
SB203580购自Calbiochem（加利福尼亚州圣地亚哥）。茴香霉素钠砷酸盐、M2抗体和免疫沉淀珠、碱性髓磷脂购买了蛋白质（MBP）、防霉素贴装液和钩体霉素B来自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。TNF-α购自R&D系统（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。抗绿色荧光的多克隆抗体蛋白质（GFP）购自ClonTech（加利福尼亚州帕洛阿尔托）。FITC-标记二级抗体购自BD PharMingen（加利福尼亚州拉霍亚）抗p38α、p38β、PRAK和MAPKAPK-2的多克隆抗体由新西兰白兔通过逐步皮下和肌肉生成注射所述每种亲和纯化重组蛋白以前(新建等。，1998).
蛋白质表达载体的构建
所有的his-tagged重组蛋白都被克隆到T7的下游通过PCR直接插入pETm1载体中的RNA聚合酶启动子包含不同基因全长编码区的片段之前(马里宁等。，1997). 来自ClonTech的GFP-C1矢量用于所有GFP融合构建物，目标基因在下游构建GFP框架内。如前所述，HA-标记的PRAK位于pcDNA3载体中其他地方(新建等。，1998)和标记的p38α和p38β也克隆于pcDNA3载体，但目标基因的Flag-tag序列为5′(Ge公司等。，2002).p38β剪接变异体（也称为p38β2或第38-2页；斯坦因等人。，1997)编码364个氨基酸。PRAK的各种突变通过使用快速更换套件（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫尼），配有设计的相应配对致突变寡核苷酸。通过DNA测序确认每个突变整个靶基因的表达。
细胞培养和转染
Hela细胞和HEK293细胞保存在高糖Dulbecco’s中改良Eagle培养基加10%FBS，37°C，5%加湿一氧化碳2大气。如果是定时显微摄影采用活细胞、室温和正常的实验室环境。用脂质体转染蛋白表达载体2000（加利福尼亚州圣地亚哥因维特罗根），遵循供应商的协议。简要地，Hela或HEK293细胞在1天前新鲜接种到70%的汇合处转染。将总DNA（1-2μg）与3μl滴注前，在200μl非血清培养基中放置脂质乙酰胺2000 30分钟放在电池上。转染基因表达分析在24小时内进行小时。
免疫染色和荧光显微镜
含有p38α、p38β、PRAK和p38α的多克隆IgG抗血清对MAPKAPK-2进行抗原特异性亲和纯化，如下所示：用纯化重组蛋白饱和的0.45-μm硝化纤维素膜（蛋白600μg，0.8ml）完全风干。然后膜是在1 ml缓冲液A（5%BSA，10 mM Tris，0.15 M氯化钠，和0.2%NP-40，pH 7.4）30分钟，再放入新鲜缓冲液A中5分钟min。将膜与相应的抗血清（1 ml）孵育2轻轻搅拌h，然后用1×PBS清洗三次膜结合抗体在200μl洗脱缓冲液（100mM甘氨酸，pH 2.5，用氯化氢调节）并立即中和添加0.1 ml 1 M Tris（pH 8.0）。净化后的浓度抗体为～0.1 mg/ml。
对于免疫染色，不同处理的细胞生长在玻璃室中用4%的1×PBS缓冲甲醛固定载玻片10分钟，然后在-20°C的甲醇/丙酮（1:l）中孵育5分钟用PBS洗涤，将载玻片在封闭缓冲液（10%山羊）中培养血清（PBS中0.1%吐温20）培养1小时，然后用新鲜封闭缓冲液中对应纯化的第一抗体（1:200）1h.用洗涤缓冲液（1×PBS加0.1%吐温20）清洗载玻片在含有10%牛血清白蛋白的洗涤缓冲液中再洗两次和一次在含有FITC-标记的二级抗体的封闭缓冲液中培养50分钟，然后在洗涤缓冲液中洗涤三次，在水。然后用防褪色溶液安装载玻片，盖子滑动用指甲油密封。
GFP融合荧光发射细胞或FITC-标记细胞在倒置Axiovet 200M显微镜，通过卡尔蔡司Vision数码相机（卡尔蔡斯，德国Oberkochen）。
为了进行定量荧光分析，在z平面上拍摄照片以0.3-μm的间隔，然后使用调节输入过滤器程序。定量程序测量使用荧光粒子的强度。选择单个细胞，并测量细胞质和细胞核荧光强度分别进行。对同一字段中的背景进行规范化后一个细胞的核强度除以同一细胞获得LI（定位指数；Chan和Chan，1999年). 四十从四个不同的显微照片视角观察单个细胞到这个测量值。LI的平均值和LI的标准差计算并比较各组细胞。
免疫共沉淀和蛋白质分析
两种不同质粒DNA（1:1）的混合物总计3μg用Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞。20小时后转染后，用冷却的1×裂解缓冲液（新英格兰生物实验室，马萨诸塞州贝弗利），然后收集在微型离心管中。单元格将裂解液与20μl M2珠（反标记）在4°C下孵育4小时随后进行多次严格的洗涤。样品煮沸至完全变性蛋白质5分钟，然后进行SDS-PAGE凝胶分析。要检测如前所述进行免疫沉淀蛋白、蛋白质印迹(新建等。，1998).使用抗-GFP抗体探测共免疫沉淀蛋白然后使用抗标记抗体来探测标记的蛋白质。
免疫复合物激酶检测
转染或共转染激酶24小时后的细胞表达载体，用或不用TNF-α处理一段时间按照指示的时间，然后在冷PBS缓冲液中清洗，并在0.8 ml冷却1×裂解缓冲液。细胞裂解物收集在微型离心管中并在4°C下离心15分钟。上清液被转移到新试管，用20μl抗GFP珠（圣克鲁斯）或在4°C下放置4小时的反旗帜M2珠子。珠子与激酶样品结合离心并在1×PBS缓冲液中清洗两次激酶缓冲液（新英格兰生物抗体）一次。此时每个样品中的抗GFP或M2珠免疫复合物被分成两部分等体积部件。一部分用于激酶分析，另一部分用于留作西方分析以证明每个免疫复合物的数量通过该过程获得。PRAK的激酶反应在在含有免疫物质的1×激酶缓冲液中，总体积为60μl络合物，[γ]的10μCi-32P] ATP和10μg Hsp 27像以前一样准备(新建等人。，1998)在37°C下摇晃40分钟。反应是通过添加30μl SDS加载缓冲液终止。的活动免疫沉淀p38α和p38β及其相应突变体除10μg MBP用作激酶底物。将激酶反应样品煮沸5分钟在SDS-PAGE之前，通过磷化成像。用抗GFP抗体或如上所述进行抗标记抗体。
结果
PRAK的亚细胞定位
为了更好地了解PRAK的调节和功能，我们使用了免疫染色以确定PRAK的亚细胞位置。防PAK用重组PRAK培养的多克隆抗体经过亲和纯化固定化的PRAK蛋白，用于免疫染色。如所示，主要是HEK293（293）和Hela细胞中出现PRAK细胞质染色最亮的染色显示在细胞核周围，并延伸到远端细胞质。
内源性激素的亚细胞定位和胞质核穿梭普拉克。（A） HEK293和Hela细胞固定并用抗PRAK免疫染色一级抗体和FITC-标记的二级抗体。代表显示每个染色的显微图像。PRAK主要位于休眠细胞的细胞质。（B） HEK293细胞未经任何处理（-），LMB（3 ng/ml）1小时，或TNF-α（100 nM）2小时，然后固定用抗PRAK抗体染色。PRAK在当核出口被LMB（中间面板）阻断时，观察到了核。TNF刺激降低了核PRAK（右侧面板，统计见正文分析）。（C） HEK293细胞用GFP-PRAK公司。24小时后在荧光显微镜下观察GFP-PRAK转染。外源性表达的GFP-PRAK定位于细胞核。（D）用HA-PRAK表达载体转染HEK293细胞。细胞转染后24小时固定，并用抗PRAK原代抗体进行免疫染色抗体和FITC-标记的二级抗体。外源表达HA-PRAK定位于细胞核。（E） HEK293细胞转染表达GFP-PRAK载体与标记p38α或标记p38β。GFP-PRAK公司转染24h后在荧光显微镜下观察。p38α和p38β重定位GFP-PRAK的共表达。（F） 高铁293细胞固定并用抗p38α或抗p38β免疫染色抗体和FITC-标记的二级抗体。
PRAK在细胞核和细胞质之间不断穿梭
为了确定PRAK是否在细胞质和细胞核之间传递，我们处理293()以及Hela（我们未发表的结果）细胞与钩端霉素B（LMB），一种特异性妨碍富含亮氨酸的NES对出口受体exportin 1的影响(奥斯萨雷·纳扎里等。，1997). PRAK被发现在核内迅速积聚LMB处理的细胞(,中间面板），意味着PRAK在细胞质和正常情况下的原子核。然而，当细胞受到刺激时用肿瘤坏死因子-α（TNF）处理2 h，PRAK核染色似乎有所减少(). 统计评估TNF对肿瘤易位的影响PRAK，我们测量了共有40个细胞经或不经处理后的每个细胞TNF-α分别使用交互式颗粒体积测量软件程序（卡尔蔡司）。核质比花期强度在操作上被定义为LI(陈等。，1996;Chan和Chan，1999年)以及为每个测量的单元格计算。LI公司意思是±锂标准偏差TNF处理的细胞为0.15±0.03，而未经TNF处理的细胞为0.31±0.04。的价值锂标准偏差两组之间的差距很小，但锂意思是TNF处理的细胞比未处理的细胞。TNF刺激增加PRAK核出口和/或减少PRAK向细胞核的转运。
PRAK与p38α和p38β等蛋白质的对接PRAK亚细胞定位的关键作用
GFP与感兴趣的蛋白质的融合已被证明在研究蛋白质的亚细胞定位。调查PRAK易位，我们利用GFP-PRAK融合系统。如所示，相比之下内源性PRAK，GFP-PARK主要位于293细胞的细胞核中。这个使用Hela细胞时也得到了相同的结果（我们未发表的结果）。收件人排除GFP-PRAK的核定位是由以下原因引起的可能性GFP，我们将GFP表达载体转染到细胞中并观察到GFP在细胞核和细胞质中的扩散分布（我们的未发布的结果）。我们还在293年表达了HA-taged PRAK()和Hela（我们的未发表的结果）细胞，并用抗PRAK染色这些细胞抗体。在转染细胞中检测到HA标记的PRAK与GFP-PRAK亚细胞定位和表明体外表达的PRAK位于不同的亚细胞位置而不是内源性蛋白质。
众所周知，蜂窝传输系统在以下方面发挥着关键作用将不同的蛋白质分为不同的亚细胞隔室。然而，特定蛋白质的亚细胞位置也可能受到以下因素的影响其相互作用的蛋白质。外周过度表达的细胞核位置PRAK可能是由于以下事实造成的：相应的PRAK相互作用蛋白对接PRAK，从而导致PRAK分子被分类成核。为了验证这个假设，我们检查了PRAK、p38α和p38β的上游激酶是否相互作用PRAK对GFP-PRAK的定位有任何影响。这是由293例中GFP-PRAK与p38α或p38β共存()和Hela细胞（我们的未发布的结果）。p38α与GFP-PRAK共表达导致GFP-PRAK重新分布到细胞核和细胞质位置(，左侧面板），而p38β与GFP-PRAK共表达导致GFP-PRAK在细胞质中占优势(，右侧面板）。因此，GFP-PRAK的位置似乎受p38α和p38β同时表达的控制，因为p38α位于细胞核和细胞质中(，左侧面板），以及p38β主要位于细胞质中(，右侧面板）。总的来说，结果显示在证明PRAK与其他蛋白可以显著影响PRAK的位置，p38αp38β和p38β是可以与PRAK对接的分子。
GFP-PRAK可以模拟内源性PRAK的穿梭
因为GFP-PRAK与p38β的对接与内源性PRAK在亚细胞定位，我们检测了GFP-PRAK在系统类似于内源性PRAK。我们同时表达GFP-PRAK和293细胞中的p38β()用LMB处理这些细胞(，中间面板）或TNF公司(，右侧面板）。与我们在与内源性PRAK一起，细胞核GFP-PRAK的增加当核出口受到抑制时，浓度变得明显，尽管有些GFP-PRAK仍留在细胞质中(，中间面板）。作为对于内源性PRAK(，右侧面板），TNF治疗降低了核GFP-PRAKp38β共存时的浓度(，右侧面板）。这些结果表明，与p38β共表达的GFP-PRAK表现相似内源性PRAK在静息细胞内不断穿梭增强GFP-PRAK从细胞核向细胞质的输出TNF处理的细胞。利用GFP-PRAK的核位置()，我们比较了已知会引起细胞应激的其他刺激的影响，类似于TNF关于PRAK核出口的声明。如所示、TNF、茴香霉素和亚砷酸盐均能诱导GFP-PRAK从细胞核向细胞质的输出。这些数据与使用内源性PRAK时获得的结果一致(、右侧面板和我们的未发布的结果）。
GFP-PRAK的易位。（A） GFP-PRAK和将p38β标记物共转染HEK293细胞。20小时后转染后，用或不用LMB或TNF-α处理细胞用于所示的各种时间。相同单个细胞中的GFP-PRAK为荧光显微镜监测。（B） HEK293细胞转染GFP-PRAK表达载体经TNF-α（top面板）、安霉素（15μg/ml；中间面板）和亚砷酸盐（250微米; 底部面板）。GFP-PRAK在同一地区的再分配单个细胞通过荧光显微镜进行监测。
PRAK包含典型的富含亮氨酸的NES和二分NLS
校准PRAK、MAPKAPK2和MAPKAPK3的主要蛋白质序列揭示了PRAK包含类似的NES和NLS(). 少校在这些序列中，PRAK和MAPKAPKs的区别在于PRAK中的NLS位于NES部分内。PRAK中假定的NES高度与蛋白激酶抑制剂的原型NES序列保持一致A、 公钥基础设施(文等。，1995;).为了确定在PRAK中发现的序列是否真的起到信号的作用核进出口，我们在年评估了NES和NLS的要求通过产生位点特异性突变实现PRAK的核输入和输出在这两个主题中().NES突变体是通过改变假定NES中的三个亮氨酸（L）而制成的从PRAK到丝氨酸（S），称为PRAK（sss）(). NLS突变体是由四种基本氨基酸的拉伸转化而成精氨酸赖氨酸-精氨酸-赖氨酸（RKRK）谷氨酰胺-三氢嘌呤-三氢甘氨酸（QTTG；)并命名为普拉克（qttg）。当GFP-PRAK（sss）在293细胞中表达时，它位于核心。TNF治疗不能将这种蛋白质赶出细胞核(，右侧面板），表明从核心。然而，GFP-PRAK（qttg）被发现仅局限于细胞质和LMB未能在细胞核内积聚GFP-PRAK（qttg）(，右侧面板），确认预测的核位置序列在普拉克。
NES和NLS对PRAK核出口和进口的要求。（A）在PRAK、MAPKAPK2和MAPKAPK3中发现序列比对NES和NLS。这个核出口顺序（NES）用阴影表示，核定位序列（NLS）既有方框又有阴影。PKI中的一个原型NES序列是显示在序列对齐的顶部。的突变位点指示了GFP-PRAK（ss）和GFP-PRAK（qttg）。（B） HEK293细胞转染GFP-PRAK（sss）或GFP-PRAK（qttg）表达载体。转染后24小时，对细胞进行处理或不处理TNF或LMB适用于指定的时间段。GFP的分布为用荧光显微镜分析。（C） HEK293细胞用GFP-PRAK、GFP-PROK（KM）、GFP-PRAK（qttg）或GFP-PRAK（sss）的表达载体。转染后24小时，对细胞进行处理或不处理不同时间段的TNF（左面板）或2 h。GFP-PRAK及其突变体用抗GFP抗体免疫沉淀。细胞中的激酶活性免疫沉淀物通过体外激酶分析测定，使用Hsp27作为基底。测定免疫沉淀物中等量的GFP-PRAK用抗GFP抗体进行免疫印迹。
接下来，我们测定了GFP-PRAK（sss）和GFP-PRAK（qttg）的激酶活性与GFP-PRAK和激酶死亡突变体GFP-PRAK（KM）的比较采用免疫复合物激酶分析。使用小热休克蛋白（Hsp27）作为激酶分析中的底物。GFP-PRAK的激酶活性为对TNF刺激的反应增强了8-10倍，持续时间至少2.5小时(，右侧面板）。野生型GFP-PRAK具有一些基础激酶活性，而其突变ATP口袋[K51-M突变，GFP-PRAK（KM）]消除了两者的激酶活性休息和刺激条件(，右侧面板）。NES突变体[GFP-PRAK（sss）]具有相似的基础GFP-PRAK活性，可被TNF刺激激活(，右侧面板）。这个NLS突变体[GFP-PRAK（qttg）]保留了基础活性，但不能被TNF刺激。因为PRAK中的NLS与p38对接站点重叠(恩格尔等。，1998;田上等。，2001)并查看)，的NLS突变体对TNF刺激无反应可能是由缺陷引起的易位到细胞核或与p38相互作用的缺陷。
PRAK对接位点的基本氨基酸簇，但不是PRAK上的调节性磷酸化位点或PRAK的活性决定了与p38对接互动。（A） PRAK的示意图显示了催化域、NES、NLS和对接位置的相对位置。这个停靠站点与NLS重叠。（B） 多种免疫共沉淀分析带有p38α或p38β标记的GFP-PRAK突变体被作为中描述的.（C）PRAK不同突变对GFP-PRAK再分布的影响使用方法与中相同.
T182磷酸化、激酶活性与PRAK的位置
已经证明，MAPKAPK2的核出口受到监管通过位于激酶结构域C末端的T317上的磷酸化。PRAK和MAPKAPK2的序列比对(恩格尔等。，1998;新建等。，1998)揭示了PRAK不具有相应的磷酸化位点。这个表明可能有不同的监管机制来管理核出口PRAK和MAPKAPK2。众所周知，PRAK的T182和S212可以p38磷酸化，T182磷酸化上调PRAK激酶活动(新建等。，1998). 解决磷酸化和激酶活性PRAK影响PRAK的位置和移位，我们使用了一系列PRAK突变体。突变体如图所示.激酶研究了PRAK（182D）、PRAK以前(新建等。，1998). 在这里，我们测量了这些基因的GFP融合蛋白的活性PRAK突变体。T182突变（D或A突变）消除了PRAK对TNF刺激的反应性()，因为这些突变体在T182不能再被p38磷酸化(新建等。，1998).GFP-PRAK（182D）和GFP-PRAK（182212D）的基础活性稍高与GFP-PRAK和GFP-PROK（182A）相比，这表明D替代物在某种程度上模拟磷酸化的负电荷(新建等。，1998).GFP-PRAK（KM）是激酶死亡，但仍能被p38磷酸化(和我们未发表的结果）。所有这些突变体在表达于293个细胞(，顶部面板），表明在静息细胞中，这些突变不会影响将外源性表达的PRAK转运至细胞核。然而，TNF刺激不能导致T182突变体的核输出(，底部面板），表明刺激介导的182位点需要TPRAK的核出口。因为T182在刺激后被磷酸化TNF公司(新建等。，1998)，很可能需要T182上的磷酸化用于PRAK核出口。保留在182D年的核心刺激后的突变体，表明D突变体不能完全模仿磷酸化对T182的作用。与T182突变体相比，GFP-PRAK（KM）能够在TNF后转位到细胞质处理(，底部面板），表明核不需要PRAK激酶活性出口PRAK。
PRAK的核输出需要调节性磷酸化位点T182而不是PRAK的激酶活性。（A） PRAK的一级结构示意图表示NES和NLS的催化结构域和基序的位置。改变磷酸化位点（T182、S212）或ATP口袋的突变（K51）显示在结构下方。（B） HEK293细胞转染不同GFP-PRAK突变体的表达载体如图所示。二十倍转染后数小时，用或不用TNF处理细胞2小时。GFP-PRAK突变体的激酶活性通过免疫激酶分析作为在里面.（C）HEK293电池转染不同GFP-PRAK突变体的表达载体表明。转染后24小时，用或不含TNF 2 h。通过荧光分析GFP-PRAK的位置显微镜检查。TNF诱导的GFP-PRAK核输出受到突变的损害在T182位点，但不是通过ATP囊中的突变。
PRAK与p38α或p38β对接需要对接两种蛋白质上的基序，但不具有激酶活性或功能任一蛋白质的磷酸化
p38α中的子链基序被证明是与PRAK的互动（Tanoue等。，
2000,2001). 因为p38α或p38β的共同表达导致GFP-PRAK和这种再分配很可能是通过与PRAK，我们检测了p38α或p38β和需要PRAK进行对接交互和重新分配GFP-PRAK到达细胞质。p38α和p38α对接基序的突变p38β的生成如所示.标记的p38α（nqn）、p38β（nqm）、p28α（AF），或p38β（AF）与GFP-PRAK在293细胞中共表达。互动带有p38α或p38β突变体的PRAK的共免疫沉淀。显然，底物对接位点的突变p38α和p38β分别消除了它们与PRAK的相互作用(). 相比之下底物对接位点突变，磷酸化突变p38α和p38β中的位点不影响它们与PRAK的相互作用()，表明对接PRAK不需要p38磷酸化和活性。一致通过共免疫沉淀检测到的相互作用，我们发现p38α（nqn）和p38β（nqm）不能再重新分布GFP-PRAK细胞，而p38α（AF）和p38β（AF将PRAK对接到不同亚细胞位置的野生型蛋白质().
p38上的底物对接基序，但不是调节性磷酸化或p38的活性控制着与PRAK的对接互动。（A） 示意图p38α和p38β的结构显示了催化剂的位置p38上的结构域和基底对接基序。中的关键氨基酸残基这些图案以粗体字母表示。p38（AF）和显示p38（nqn）。（B） HEK293细胞与多种如图所示，p38和GFP-PRAK表达载体的组合。细胞转染24小时后收集裂解物，并用抗flag抗体M2。GFP-PRAK或p38标记在免疫沉淀物通过使用抗GFP或抗滞后抗体。（C） HEK293细胞被转染为B细胞荧光分析GFP-PRAK的亚细胞位置显微镜检查。（D） p38α或p38β突变体在HEK293电池如图所示。转染后24小时，细胞用或不用TNF处理2小时。然后收集细胞裂解物用抗滞后抗体M2免疫沉淀。激酶活性以MBP为底物，采用免疫激酶法检测p38突变体。这个免疫沉淀物中等量的p38α或p38β是通过Western blotting测定。（E） HEK293细胞与p38突变体和GFP-PRAK表达载体的各种组合表明。转染后24小时，用收集细胞裂解物并进行免疫沉淀抗GFP抗体。测定GFP-PRAK的激酶活性通过免疫激酶分析.
进行免疫复合物激酶测定以测量激酶p38α、p38β及其突变体的活性。正如预期，突变底物对接基序缺失激酶的磷酸化位点p38α和p38β的活性(). 共表达带有GFP-PRAK的p38α（AF）或p38β（AF激活GFP-PRAK()，这与这些突变体(黄等。，1997;王等。，2000;Ge公司等。，2002). 相反，对接基序突变体的过度表达对TNF诱导的PRAK激活没有影响(). 这可能是解释为p38α（nqn）或鞭毛p38β（nqn）不能与内源性p38竞争底物和上游激活物，因为p38α和p38β的nqn突变体不能与下游基板结合(田上等。，2001和)或上游MKK(田上等。，2000).
MAPKAPK2中的对接位置已映射到与NLS重叠。PRAK中的NLS()也证明了在共免疫沉淀实验中成为p38对接所必需的基序(恩格尔等。，1998;田上等。2001).为了确定这个图案在对接中的功能，我们同时按下GFP-PRAK（qttg）带有p38α或p38β标记。协同免疫沉淀检测表明PRAK（qttg）不能与p38α或p38β相互作用(). 相反，PRAK磷酸化位点或ATP口袋的突变仍然可能是用p38α（我们未发表的结果）或p38β免疫沉淀(). NES突变PRAK中PRAK的刺激物介导的核出口受损()但对与p38α（我们未发表的结果）和p38β的相互作用(). 支持对接相互作用控制PRAK亚细胞位置的概念，GFP-PRAK（qttg）的亚细胞定位不受共表达的影响p38α或p38β(). 相反，磷酸化位点或PRAK的ATP口袋对PRAK搬迁没有任何影响p38β(). 因此，p38和PRAK的磷酸化和活性似乎不影响两种蛋白质之间的对接相互作用。据观察，这些细胞共表达标记p38β和GFP-PRAK（sss）具有一定水平的细胞质中的GFP-PRAK（sss）(，右下面板）。这种细胞质保留的GFP-PRAK（sss）是最有可能是由该蛋白在其在细胞质中合成，但在其核导入之前，因为核GFP-PRAK（sss）无法从核心导出。
野生型的转染和共转染实验结果或PRAK和p38的突变体在.
表1。
| GFP-PRAK公司 | 与共同感染 | GFP-PRAK本地化 |
|---|
| GFP-PRAK公司 | — | 核 |
| GFP-PRAK公司 | 标记p38α | 细胞核和细胞质 |
| GFP-PRAK公司 | 标记p38β | 细胞质 |
| GFP-PRAK公司 | 标记p38α（AF） | 细胞核和细胞质 |
| GFP-PRAK公司 | 标记p38β（AF） | 细胞质 |
| GFP-PRAK公司 | 标记-p38α（nqn） | 核 |
| GFP-PRAK公司 | 标记p38β（nqn） | 核 |
| GFP-PRAK（182A） | — | 核 |
| GFP-PRAK（182A） | 标记p38α | 细胞核和细胞质 |
| GFP-PRAK（182A） | 标记p38β | 细胞质 |
| GFP-PRAK（182D） | — | 核 |
| GFP-PRAK（182D） | 标记p38α | 细胞核和细胞质 |
| GFP-PRAK（182D） | 标记p38β | 细胞质 |
| GFP-PRAK（182212D） | — | 核 |
| GFP-PRAK（182212D） | 标志p38α | 细胞核和细胞质 |
| GFP-PRAK（182212D） | 标记p38β | 细胞质 |
| GFP-PRAK（公里） | — | 核 |
| GFP-PRAK（公里） | 标记p38α | 细胞核和细胞质 |
| GFP-PRAK（公里） | 标记p38β | 细胞质 |
| GFP-PRAK（数量） | — | 细胞质 |
| GFP-PRAK（数量） | 标记p38α | 细胞质 |
| GFP-PRAK（数量） | 标记p38β | 细胞质 |
| GFP-PRAK（不锈钢） | — | 核 |
| GFP-PRAK（不锈钢） | 标志p38α | 核 |
| GFP-PRAK（不锈钢） | 标记p38β | 细胞核和细胞质 |
TNF刺激对PRAK核出口和进口的影响
我们在前面的图中显示了和TNF刺激导致PRAK或GFP-PRAK的核出口，且出口需要T182普拉克(). 要确定我们表示，PRAK的核出口是否需要p38活性293个细胞中的GFP-PRAK，并用TNF处理这些细胞没有SB203580。如所示，SB203580阻止了由TNF引发的PRAK核出口。因此，TNF诱导的PRAK核输出依赖于p38。
TNF刺激对PRAK穿梭的调节。（A） HEK293细胞转染GFP-PRAK表达载体后，用或在存在或不存在SB203580（20μM）的情况下不含TNF 2小时荧光显微镜检测GFP-PRAK的亚细胞定位。这个p38抑制剂SB203580抑制TNF诱导的GFP-PRAK输出。（B）用LMB和载体（0.1%甲醇和0.1%二甲基亚砜）（Ctrl）、TNF或TNF+SB203580。这个固定细胞，通过免疫染色分析PRAK的位置（C）亲属评估PRAK从细胞质到细胞核的移位速度通过计数核PRAK染色等于或高于，群体细胞质染色（LI≥1.0，详见正文）共60个细胞。这些细胞在TNF治疗和未治疗中的百分比计算并显示了样本。
通过细胞外刺激可以减少核PRAK减少核进口或增加核出口普拉克。确定PRAK的核进口是否在用TNF刺激细胞，我们用LMB和或没有TNF。细胞在治疗后的不同时间固定用抗PRAK抗体染色。获得了与所示相同的结果早些时候.LMB型治疗导致PRAK在细胞核中快速积聚(，顶部面板）。TNF公司治疗显著降低了LMB介导的PRAK核定位(，中间面板）。我们使用LI≥1.0，例如，核PRAK水平等于或大于细胞质PRAK的数量，作为PRAK核积累的标准比较用或没有TNF。如所示，几乎所有细胞在1LMB治疗h，而TNF治疗使细胞数量减少到<10%人口总数。长时间治疗LMB似乎无法克服TNF的作用是因为只有30%的细胞显示细胞核治疗3小时后PRAK累积。
为了测试TNF诱导的p38α和/或p38β的激活是否具有在TNF对PRAK核导入的作用中，我们用TNF处理细胞在SB203580在场的情况下。如所示，抑制p38α和p38β不干扰TNF减少的核输入普拉克。因此，TNF介导的PRAK核进口减少是独立于p38激活。
讨论
我们研究了PRAK的亚细胞定位和穿梭，并得出结论PRAK主要定位于细胞质。2） PRAK不断在细胞质和细胞核之间穿梭。中确定的NLS和NES穿梭需要PRAK。因为几乎所有的PRAK蛋白当核出口受到抑制时，我们认为PRAK分子参与细胞质之间的循环和细胞核。3） 内源性PRAK的细胞质位置最有可能由于p38β过度表达而与p38β发生对接作用定位于细胞核的“自由”PRAK与p38β，一种将PRAK重新定位为细胞质。对接交互需要在PRAK和p38α或p38β，并且不受磷酸化的影响这些激酶的状态和活性。4） T182上PRAK的磷酸化是一种PRAK核出口所需的事件或有助于PRAK核出口。5） 细胞外刺激激活可改变PRAK的核进出口。TNF减少对细胞的刺激PRAK的核输入以p38无关的方式增加通过p38依赖机制实现PRAK的核输出。
根据我们的数据，我们提出了一个监管PRAK的模型p38 MAPK定位和穿梭(). 大多数PRAK定位于细胞质，与细胞质p38β对接。第38页PRAK中的对接位置与NLS区域重叠；因此，相互作用带有p38的PRAK可能掩盖了这个位点，这可能解释了防止PRAK的核进口。很明显，平衡在有利于PRAK和p38β在胞浆中结合。然而，应该有一些剩余的免费PRAK。免费的PRAK可以导入核心，这可能是静息细胞核PRAK水平低的原因。过度表达的PRAK主要位于细胞核，这表明PRAK的核出口信号不如核进口信号重要PRAK的信号或NES在分子内或分子间被其他蛋白质，从而阻止或降低核的速度出口PRAK。PRAK与p38α的对接作用应该发生在细胞核中。p38α的基础和刺激活性应负责休息时核PRAK的磷酸化分别激活细胞。PRAK的核出口可能需要PRAK的磷酸化或至少通过这种磷酸化增强。我们提出p38α对PRAK的磷酸化揭示了PRAK中的MES并导致随后的PRAK核出口。TNF刺激减少PRAK的核进口，使用未知机制，并增加以p38依赖的方式出口PRAK核。因为大多数本报告中描述的实验必须使用过表达系统模型如所示能够过于简单、不完整和不平衡。对接效应PRAK亚细胞定位上的p38α和p38β需要当p38α和p38β敲除细胞可用时确认。
p38α对PRAK亚细胞定位和易位的调控和p38β。有关详细信息，请参阅文本。
当这份手稿正在修订时，塞特内斯等。(2002)报道了一项关于PRAK（MAPKAPK5）亚细胞定位。他们还绘制了NLS和NES图案并得出结论，PRAK可以在细胞核和细胞质之间穿梭。但是与我们不同的是，他们认为PRAK是一种核蛋白。因为塞特内斯和我们使用了相同类型的细胞，结果颇具争议不能由单元格类型差异引起。为了解决这个矛盾的结果，我们用不同来源的抗PRAK抗体重复了我们的实验兔子。我们有来自四只不同兔子的抗体，可以选择性地在Western blotting分析中检测到PRAK而不是MAPKAPK2。我们进行了免疫纯化不同的抗PRAK抗体并将其用于免疫染色实验。正如我们早些时候得到的结果一样()，检测到PRAK主要在细胞质中被来自不同兔子的抗体（我们的未发布的结果）。这些抗体在PRAK染色中的特异性为通过对细胞核中外源性表达的PRAK进行染色进一步证实(和我们未发表的结果）。因此，我们毫不怀疑，大多数PRAK分子局限于胞质溶胶中。
PRAK的先前特征表明其与同源物相似活化谱和底物特异性中的MAPKAPK2(新建等。，1998).这里我们表明，与MAPKAPK2类似，细胞应激也刺激PRAK的核心出口（数字和). 主要区别迄今为止发现的这两种蛋白质之间是静息状态下的亚细胞定位单元格(和我们的未发布的结果）。PRAK亚细胞定位的差异MAPKAPK2可能是由不同的对接相互作用引起的。停靠相互作用可能在控制某些蛋白质。例如，MEK1和ERK1之间的对接相互作用据报道对ERK1的细胞质定位很重要(福田等。，1997). p38α从细胞核向应激激活细胞的细胞质由其结合伙伴介导，MAPKAPK2号机组(本·勒维等。，1998年b). p38α通过相互作用重新分布GFP-MAPKAPK3用它(田上等。，2001). 然而，对接交互对PRAK的影响本地化显示了与报道研究的一些差异。MAPKAPK2号机组指导p38α的易位，而PRAK的亚细胞定位由p38α或p38β控制(). 此外，与ERK1锚定在细胞质中，并在磷酸化，p38β激活PRAK不会导致PRAK向细胞核的移位。此外ERK1过表达似乎与NLS介导的易位无关(福田等。，1997)而体外表达的PRAK的积累是取决于PRAK的NLS(). 然而，我们的工作和上述工作证明对接互动在确定休息时蛋白激酶的亚细胞位置以及在活化细胞中。因为与其他蛋白质对接在特定蛋白质的亚细胞定位，需要谨慎过表达用于研究蛋白质的亚细胞定位。
一些蛋白质，如线粒体蛋白质，永远不会回到到达目的地后的细胞质(戈里奇，1998年)，而其他蛋白质不断在两个细胞隔室之间运输，例如细胞核和细胞质(Gorlich，1998;村田等。，2002). 人们相信小蛋白有潜力通过核孔自由扩散，而大于60 kDa的蛋白质受到主动和载体介导的运输(戈里奇，1998年). PRAK是一个50-kDa蛋白质，但似乎无法在细胞核和细胞质。PRAK的核进口通过以下过程进行调节NLS依赖性蛋白质输入，其核输出需要CRM1。
PRAK在p38下游作用于介导的细胞反应。然而，PRAK的确切作用尚不明确。与其他穿梭蛋白质一样PRAK的细胞核和细胞质循环必须在正常细胞中发挥作用生理学。活化细胞穿梭的改变应该是细胞对细胞外刺激的反应及其影响值得进一步研究调查。TNF处理细胞中PRAK的增加可能允许PRAK在细胞核中被激活，从而磷酸化细胞质基底。因为p38β可以被类似的细胞外刺激如p38α(江等。，1996;古玛等。，1997;高压注射器等。，1998)，我们认为细胞质PRAK可以细胞应激也会激活。核出口可能应激激活细胞中激活的PRAK是一种细胞补偿反应细胞质中缺乏激活的PRAK。但考虑到大多数PRAK发现于细胞质中，少量PRAK的核输出如果导出的PRAK执行，PRAK金额可能不会产生重大影响与细胞质PRAK的功能相同。PRAK也有可能从核中导出的PRAK与在细胞质。PRAK的182D突变体获得了一定水平的激酶活动(新建等。，1998)但不能从核武器出口(). 而不是行动作为一个显性活性突变体，PRAK（182D）被报道干扰Ras介导的细胞增殖(陈等。，2000). 因此PRAK（182D）可能不是由激酶活性缺陷引起的，但可能是这是由于这种蛋白质的核出口缺陷引起的。如果核武器抑制Ras确实需要出口活化的PRAK相比之下，输出的PRAK应具有不同的功能用细胞质PRAK。MAPKAPK2主要在细胞核中检测到并在细胞应激时转位到胞浆中（Ben-Levy等人。，1998年a；恩格尔等。，1998). 因为这两种激酶在生化特性，MAPKAPK2和PRAK分子是否具有相同易位进入胞浆后的功能有待进一步研究。
MAP激酶下游激酶家族可分为几个组(斯托克等。，1992;路德维希等。，1996;福冈和亨特，1997;沃斯基维奇et（等）其他。，1997;迪克et（等）其他。，1998;新建et（等）其他。，1999). 建议PRAK代表一个分组因为它与激酶只有20-30%的序列同源性在家里(新建等。，1998). 然而，对比研究没有发现差异在PRAK和深入研究的MAPKAPK2之间(新建等。，1998;田上等。，2001).这里描述的研究表明，PRAK的亚细胞位置是与MAPKAPK2不同，从而为研究PRAK和MAPKAPK2之间的差异。因此，不断的穿梭核和细胞质之间是PRAK的另一个重要特征可能对理解PRAK的生物功能至关重要。
致谢
我们感谢Tonya Thompson出色的秘书协助和Sarah博士斯坦顿批判性阅读手稿。这项工作得到了美国国立卫生研究院AI41637和HL07195以及中国国家卫生研究院自然科学基金资助30128009。
工具书类
- Ben-Levy，R.、Hooper，S.、Wilson，R.，Paterson，H.F.和Marshall，C.J.（1998年b）。应激激活蛋白的核输出激酶p38由其底物MAPKAP激酶-2介导。货币。生物。,8,1049-1057. [公共医学][谷歌学者]
- Brunet，A.和Pouyssegur，J.（1997）。哺乳动物MAP激酶模块：如何传递特定信号。论文生物化学。 32,1-16. [公共医学][谷歌学者]
- Chan，P.K.，Qi，Y.，Amley，J.和Koller，C.A。(1996). 使用成像分析。癌症快报。
100,191-197. [公共医学][谷歌学者]
- Chan，P.K.和Chan，F.Y.（1999年）。关于…的研究NPM易位与细胞凋亡的关系柔红霉素。生物化学。药理学。
57,1265-1273. [公共医学][谷歌学者]
- Chang，C.I.、Xu，B.E.、Akella，R.、Cobb，M.H.和Goldsmith，E.J。(2002). MAP激酶p38与核基质MEF2A和活化剂MKK3b上的对接位点。摩尔。单元格。生物。 9,1241-1249. [公共医学][谷歌学者]
- Chen，G.、Hitomi，M.、Han，J.和Stacey，D.W。(2000). p38通路为Ras提供负反馈增殖信号。生物学杂志。化学。
275,38973-38980. [公共医学][谷歌学者]
- Cohen，P.（1996）。蛋白激酶解剖调节细胞对细胞因子和细胞应激反应的级联反应。高级药理学。 36,15-27. [公共医学][谷歌学者]
- Davis，R.J.（1994）。MAPKs:new JNK扩展组。生物化学趋势。科学。 19,470-473. [公共医学][谷歌学者]
- Deak，M.、Clifton，A.D.、Lucocq，L.M.和Alessi，D.R。(1998). 有丝分裂原和应激激活蛋白激酶-1（MSK1）是直接被MAPK和SAPK2/p38激活，可能介导CREB的激活。EMBO J。 17,4426-4441.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Engel，K.、Kotlyarov，A.和Gaestel，M.（1998）。MAPKAP激酶2对链霉素B敏感的核输出受磷酸化。EMBO J。 17,3363-3371.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Fukuda，M.、Gotoh，Y.和Nishida，E.（1997）。MAP激酶与MAP激酶的相互作用：可能在MAP激酶核质转运的控制。EMBO J。
16,1901-1908.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Fukunaga，R.和Hunter，T.（1997）。MNK1，一种新的MAP一种新的表达筛选方法分离的激酶活化蛋白激酶鉴定蛋白激酶底物的方法。EMBO J。
16,1921-1933.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Ge，B.、Gram，H.、di Padova，F.、Huang，B.，New，L.、Ulevitch、，R.J.、Luo，Y.和Han，J.（2002）。MAPKK依赖激活p38alpha的TAB1依赖性自身磷酸化介导的p38alfa。科学类 295,1291-1294. [公共医学][谷歌学者]
- Gorlich，D.（1998）。进出电池的运输核心。EMBO J。 17,2721-2727.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- O.海登里奇。等。(1999). MAPKAP激酶2在体外和体内磷酸化血清反应因子。生物学杂志。化学。 274,14434-14443. [公共医学][谷歌学者]
- Hotchkiss，R.S.、Tinsley，K.W.、Swanson，P.E.、Chang，K.C.、Cobb、，J.P.、Buchman、T.G.、Korsmeyer、S.J.和Karl，I.E.（1999年）。预防脓毒症中淋巴细胞死亡可提高小鼠的存活率。程序。国家。阿卡德。科学。美国 96,14541-14546.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Huang，S.，Jiang，Y.，Li，Z.，Lin，S..，Ulevitch，R.J.，Nemerow，G。，和Han，J.（1997）。T细胞凋亡信号通路是由ICE/Ced-3家族蛋白酶和MAP激酶6b组成。免疫 6,739-749. [公共医学][谷歌学者]
- Hunter，T.（2000）。信令-2000及以上。单元格 100,113-127. [公共医学][谷歌学者]
- Iordanov，M.、Bender，K.、Ade，T.、Schmid，W.、Sachsenmaier，C.、。，Engel，K.、Gaestel，M.、Rahmsdorf，H.J.和Herrlich，P.（1997）。中波紫外线通过p38/HOG-1依赖性蛋白激酶激活CREB。EMBO J。 16,1009-1022.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- 江，Y.，Chen，C.，Li，Z.，Guo，W.，Gegner，J.A.，Lin，S.和Han，J.（1996）。结构和功能的表征一种新的有丝分裂原活化蛋白激酶（p38β）。生物学杂志。化学。 271,17920-17926. [公共医学][谷歌学者]
- Kotlyarov，A.、Neininger，A.、Schubert，C.、Eckert，R.、Birchmeier、，C.、Volk，H.D.和Gaestel，M.（1999年）。MAPKAP激酶2是对LPS诱导的TNF-α生物合成至关重要。自然细胞生物。 1,94-97. [公共医学][谷歌学者]
- Kudo，N.，Wolff，B.，Sekimoto，T.，Schreiner，E.P.，Yoneda。，Yanagida M.、Horinouchi S.和Yoshida M.（1998年）。瘦霉素B通过与CRM1直接结合抑制信号介导的核出口。实验细胞研究。 242,540-547. [公共医学][谷歌学者]
- Kumar，S.、McDonnell，P.C.、Gum，R.J.、Hand，A.T.、Lee，J.C.和Young，P.R.（1997年）。CSBP/p38 MAP激酶的新同源物：吡啶基的活化、底物特异性和抑制敏感性咪唑类。生物化学。生物物理学。Res.社区。
235,533-538. [公共医学][谷歌学者]
- Kyriakis，J.M.和Avruch，J.（1996）。蛋白激酶应激和炎症细胞因子激活的级联反应。生物学论文集 18,567-577. [公共医学][谷歌学者]
- Le Cabec，V.、Calafat，J.和Borregaard，N.（1997年）。粒细胞成熟过程中特定颗粒蛋白NGAL的分类HL-60细胞。血液 89,2113-2121. [公共医学][谷歌学者]
- Ludwig，S.、Engel，K.、Hoffmeyer，A.、Sithanandam，G.、Neufeld，B.、。，Palm，D.、Gaestel，M.和Rapp，U.R.（1996年）。3pK，一部小说丝裂原活化蛋白（MAP）激酶活化蛋白激酶通过三条MAP激酶途径。分子细胞。生物。
16,6687-6697.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- 马里宁，N.L.，博尔丁，M.P.，科瓦伦科，A.V.和瓦拉赫，D。(1997). MAP3K活化激酶参与NF-κB的诱导TNF、CD95和IL-1。自然 385,540-544. [公共医学][谷歌学者]
- McDonald，P.H.，Chow，C.W.，Miller，W.E.，Laporte，S.A.，Field公司，M.E.、Lin、F.T.、Davis、R.J.和Lefkowitz，R.J.（2000年）。β-arrestin 2：一种受体调节的MAPK支架，用于激活JNK3。科学类 290,1574-1577. [公共医学][谷歌学者]
- Murata，T.、Yoshino，Y.、Morita，N.和Kaneda，N。(2002). 核进出口信号的识别在锌指蛋白TIS11的结构中。生物化学。生物物理学。Res.社区。 293,1242-1247. [公共医学][谷歌学者]
- Nebreda，A.R.和Porras，A.（2000年）。p38 MAP激酶：超越压力反应。趋势。生物化学。科学。
25,257-260. [公共医学][谷歌学者]
- Nemoto，S.、Xiang，J.、Huang，S.和Lin，A.（1998）。SB202190通过抑制p38beta诱导细胞凋亡丝裂原活化蛋白激酶。生物学杂志。化学。
273,16415-16420. [公共医学][谷歌学者]
- Neufeld，B.，Grosse-Wilde，A.，Hoffmeyer，A.；Jordan，B.W.，Chen，P.、Dinev，D.、Ludwig，S.和Rapp，U.R.（2000年）。丝氨酸/苏氨酸激酶3pK和MAPK活化蛋白激酶2与碱性螺旋-环-螺旋转录因子E47及其抑制转录活性。生物学杂志。化学。
275,20239-20242. [公共医学][谷歌学者]
- New，L.，Jiang，Y.，Zhao，M.，Liu，K.，Zhu，W.，Flood，L.J.，Kato，Y.、Parry，G.C.和Han，J.（1998年）。新型蛋白激酶PRAK由p38 MAP激酶调节。EMBO J。
17,3372-3384.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- New，L.、Zhao，M.、Li，Y.、Bassett，W.W.、Feng，Y.和Ludwig，S.、。，Padova，F.D.、Gram，H.和Han，J.（1999）。克隆和新型RSK相关蛋白激酶RLPK的特性。生物学杂志。化学。 274,1026-1032. [公共医学][谷歌学者]
- Ni，H.，Wang，X.S.，Diener，K.和Yao，Z.（1998）。MAPKAPK5，一种新的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活蛋白激酶，是细胞外调节激酶（ERK）和p38的底物激酶。生物化学。生物物理学。Res.社区。
243,492-426. [公共医学][谷歌学者]
- Nishida，E.和Gotoh，Y.（1993年）。MAP激酶级联对于多种信号转导途径至关重要。趋势生物化学。科学。 18,128-131. [公共医学][谷歌学者]
- Ono，K.和Han，J.（2000年）。p38信号转导途径：激活和功能。细胞信号。
12, 1-13. [公共医学][谷歌学者]
- Ossareh-Nazari，B.、Bachelerie，F.和Dargemont，C。(1997). CRM1在信号传导核中作用的证据蛋白质出口。科学类 278,141-144. [公共医学][谷歌学者]
- M.J.Robinson和M.H.Cobb（1997年）。有丝分裂原激活的蛋白激酶途径。货币。操作。单元格生物。 9,180-186. [公共医学][谷歌学者]
- 谢弗，H.J.，卡特林，A.D.，埃布伦，S.T.，科利尔，L.S.，克劳斯，A.和Weber，M.J.（1998年）。MP1：MEK绑定伙伴增强MAP激酶级联的酶激活。科学类 281,1668-1671. [公共医学][谷歌学者]
- 塞特内斯（O.M.Seternes）、约翰森（B.Johansen）、海格（B.Hegge）、约翰内森（M.Johannessen）、凯斯（Keyse），S.M.和Moens，U.（2002年）。p38的结合和激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在调节MAPK活化蛋白激酶5的核质分布细胞应激。分子细胞。生物。
22,6931-6945.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Stein，B.、Yang，M.X.、Young，D.B.、Jankencht，R.、Hunter，T.、。，Murray，B.W.和Barbosa，M.S.（1997年）。p38-2，一部小说有丝分裂原激活的蛋白激酶，具有独特的性质。生物学杂志。化学。 272,19509-19517. [公共医学][谷歌学者]
- Stokoe，D.、Campbell，D.G.、Nakielny，S.、Hidaka，H.、Leevers、，S.J.、Marshall，C.和Cohen，P.（1992年）。MAPKAP激酶-2；一由丝裂原活化蛋白激酶激活的新型蛋白激酶。EMBO J。 11,3985-3994.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Su，B.和Karin，M.（1996年）。有丝分裂原激活蛋白激酶级联和基因表达调控。货币。操作。免疫学。 8,402-411. [公共医学][谷歌学者]
- Wang，X.、McGowan，C.H.、Zhao，M.、He，L.、Downey，J.S.、Fearns、，C.、Wang，Y.、Huang，S.和Han，J.（2000）。参与γ辐射诱导细胞周期阻滞中的MKK6–p38γ级联反应。分子细胞。生物。 20,4543-52.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Tanoue，T.、Adachi，M.、Moriguchi，T.和Nishida，E。(2000). MAP激酶中一个保守的对接基序底物、活化剂和调节剂。自然细胞生物学。
2,110-116. [公共医学][谷歌学者]
- Tanoue，T.、Maeda，R.、Adachi，M.和Nishida，E。(2001). ERK和p38 MAP上对接槽的识别调节对接相互作用特异性的激酶。欧洲工商管理局J。 20,466-479.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Waskiewicz，A.J.、Flynn，A.、Proud，C.G.和Cooper，J.A。(1997). 丝裂原活化蛋白激酶激活丝氨酸/苏氨酸激酶Mnk1和Mnk2。EMBO J。
16,1909-1920.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Waskiewicz，A.J.和Cooper，J.A.（1995年）。有丝分裂原和应激反应途径：MAP激酶级联和磷酸酶调节哺乳动物和酵母。货币。操作。细胞生物学。
7,798-805. [公共医学][谷歌学者]
- Wen，W.、Meinkoth，J.L.、Tsien，R.Y.和Taylor，S.S。(1995). 蛋白质快速输出信号的识别来自原子核。单元格 82,463-473. [公共医学][谷歌学者]
- A.J.Whitmarsh和R.J.Davis（1998年）。结构酵母和酵母中支架蛋白对MAP激酶信号模块的组织哺乳动物。生物化学趋势。科学。
23,481-485. [公共医学][谷歌学者]
- 温岑，R。等。(1999). p38 MAP激酶MAP介导细胞因子诱导mRNA稳定的通路信号激酶激活的蛋白激酶2和AU富集区域靶向机制。EMBO J。 18,4969-4980.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
