跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
分子生物学细胞。2003年6月；14(6): 2508–2519.
doi（操作界面）：10.1091/桶。E02-11-0729号
预防性维修识别码：1949年8月
PMID：12808047

α-平滑肌肌动蛋白对局部粘连成熟至关重要肌成纤维细胞V⃞

鲍里斯·欣兹,*† 维拉·杜吉纳,‡ 克里斯托夫·巴列斯特姆,§ 伯恩哈德·韦勒·霍勒,*和克里斯汀·查波尼耶*
Paul T.Matsudaira，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

培养的肌成纤维细胞以应力纤维为特征，包括α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）与超自然局部粘连（FAs），大于α-SMA阴性成纤维细胞的FAs。我们研究了α-SMA在肌成纤维细胞粘附和FA中的作用成熟。反向离心揭示了初始的两个阶段肌成纤维细胞附着：在微丝板的前2h束主要含有细胞质肌动蛋白和肌成纤维细胞粘附与α-SMA阴性成纤维细胞相似。然后，肌成纤维细胞在应力纤维中结合α-SMA，形成成熟的FA其粘附能力显著提高。当α-SMATGFβ或低血清水平在培养5 d时诱导表达，成纤维细胞粘附性进一步增加与FA“过饱和”。肌成纤维细胞的治疗抑制α-SMA介导的α-SMA融合肽（SMA-FP）收缩活性，将其粘附性降低至α-SMA水平成纤维细胞阴性。使用柔性微图形基板和EGFP构建，我们发现SMA-FP的应用导致肌成纤维细胞收缩，随后不久巴西林和含β3整合素的FAs；α5整合素分布不是影响。β3整合素EGFP的FRAP显示FA蛋白增加SMA-FP处理后的营业额。我们的结论是超天然脂肪酸的稳定性取决于高α-SMA介导的肌成纤维细胞应激纤维的收缩活性。

简介

肌成纤维细胞是创伤期间出现的特殊成纤维细胞在各种纤维收缩性疾病中发挥显著收缩活动（有关综述，请参阅塞里尼和加布亚尼，1999年);它们的特征是发育良好的微丝束(加比亚尼等。，1971)类似于成纤维细胞的应力纤维文化。相比之下，常驻组织成纤维细胞不表现出这种收缩器（查看托马塞克等。，2002). 关于TGFβ刺激(德穆利埃等人。，1993;罗诺夫·杰森和彼得森，1993年)肌成纤维细胞表达从头开始的α-光滑肌肉肌动蛋白（α-SMA）；斯卡利et（等）其他。，1986)并与体内称为纤维连接的ECM(歌手等。，1984)或体外“超自然”局灶性粘连(杜吉纳等。，2001).

培养的成纤维细胞与ECM通过一系列不同的粘附位点，这些粘附位点都含有跨膜整合素家族受体与细胞质肌动蛋白(盖革等。，2001). 这些要求的活动的多样性信号转导、ECM重组、细胞迁移和物理粘附锚定反映在其复杂多样的分子组成中（对于评论请参见海恩斯，1999;卡尔德伍德等。，2000;亚当斯，2001;盖革等。，2001).它们可以分为焦点复合体、经典FA和纤维粘连以其大小、细胞内定位、，形态和分子组成(扎莫等。，1999).最近，机械应力被认为是最重要的定义这些不同粘附类型命运的因素（有关综述，请参阅Geiger和Bershadsky，2001年).焦点复合体(贵族和霍尔，1995;克拉克等。，1998)起源于～1μm的点状结构2并且通常被描述为以与张力无关的方式形成，尽管一些报道显示，它们在抑制肌动球蛋白介导的收缩活动(罗特纳等。，1999). 病灶复合物在增加时成熟为FAs细胞内的(克尔扎诺夫斯卡·沃德尼卡和伯里奇，1996年)和/或细胞外张力(里弗利纳等。，2001). 这些经典FA长约2–5-μm通常含有αvβ3整合素、长春新碱、帕罗西汀和talin(盖革等。，2001). 伴成纤维细胞分化为肌成纤维细胞、成熟FA将其长度增加到6–30μm转化为超天然脂肪酸，与经典脂肪酸不同的是紧张素的显著水平(杜吉纳等。，2001). Tensin常用作纤维粘连，与超自然和经典FA形成对比只含有微量的帕西林，不含维库林和β3整合素，但α5β1整合素；它们的功能是纤维连接蛋白（FN）组织细胞器和对细胞内收缩的抑制不敏感活动(扎莫等人。，1999)；此外，它们与应力纤维无关，但带有细肌动蛋白纤维(卡茨et（等）其他。，2000).

最近，已经证明超自然脂肪酸的发生与α-SMA的表达密切相关(杜吉纳等。，2001). α-SMA的表达增加成纤维细胞收缩活性(Arora和McCulloch，1994年;辛兹et（等）其他。，2001年a)减少成纤维细胞的运动（罗诺夫·杰森和延森，1996年）。虽然已经对超天然脂肪酸进行了详细研究，其功能尚不清楚，并且目前尚不清楚它们的形成和维持是否取决于应力纤维中α-SMA的表达。为了解决这些问题，我们分析应力纤维中α-SMA表达与FA的相关性成纤维细胞扩散过程中的超饱和度和细胞粘附强度在长期文化中。为了更具体地测试α-SMA介导的收缩活性影响超天然脂肪酸，我们通过α-SMA融合肽（SMA-FP）抑制这种作用。SMA-FP包含α-SMA的N末端序列AcEEED，即对肌动蛋白聚合很重要(沙波尼耶等。，1995)体内外肌成纤维细胞收缩活性(辛兹等。，2002).我们的结果表明，α-SMA在应激中的表达水平纤维与FA成熟度和成纤维细胞粘附。通过SMA-FP导致超天然FA的分解并减少细胞粘附。我们提出了一个模型，其中收缩蛋白的表达α-SMA增加FA的细胞内机械应力，从而导致他们过度饱和。

材料和方法

细胞培养

获得并培养大鼠肺（LF）和皮下成纤维细胞（SCF）如前所述(辛兹et（等）其他。，2001年a)；REF-52在DMEM（Life Technologies，瑞士巴塞尔），含10%FCS。转化生长因子β1（10 ng/ml，研发系统，明尼苏达州明尼阿波利斯市）和TGFβ-RII（250 ng/ml，Biogen Inc.赠予。，马萨诸塞州剑桥市；科梅斯利等。，1998)加入培养基中培养5d。FP，包括细胞穿透载体(德罗西et（等）其他。，1994)和α-SMA N-末端序列AcEEED（SMA-FP）或α-骨骼肌肌动蛋白N末端AcDEDE（SKA-FP，分别按照前面所述进行生产(辛兹等。，2002)并以1至10μg/ml的浓度使用。

附着力测定

为了避免基底成分的特殊影响，我们已经涂覆了所有表面用20%FCS处理4小时。FCS涂层在电池上产生了类似的结果与10μg/ml混合物的粘附和接触形态比较在初步实验中测试的玻璃体凝集素和FN（Sigma，Buchs，CH）。免疫荧光证实两种ECM蛋白的可用性都超过FCS涂层表面。为了测试其在摊铺过程中的粘附能力，将成纤维细胞胰蛋白酶解并接种在96孔板（5000个细胞/孔）上已经被涂过了。在电镀细胞30分钟后添加FPs（5μg/ml）。所有使用FPs的实验均在无血清F12培养基（Life）中进行技术），以减少可溶性血清蛋白的沉淀(辛兹等。，2002).0.5–9小时后，以2000 rpm反向离心平板10分钟(900 ×克)剩余细胞的数量由结晶紫染色(威尔金斯et（等）其他。，1991). 在初步实验系列中，900×克被确定为无需破坏强附着细胞；超过此值的力会导致细胞核和细胞断裂。评估α-SMA纤维束形成，细胞被镀在六孔板上（50000个细胞/孔）并固定直接离心或倒置离心后再进行α-SMA和F-actin免疫染色（见下文）。

为了测试长时间培养后的成纤维细胞粘附性，REF-52在F12培养基中预培养5天，含2、5、10和20%FCS，2%FCS plusTGFβ-RII和10%FCS加TGFβ，然后接种到涂层的96孔上板（5000个细胞/孔）。2天后，对电镀细胞进行简单清洗和处理用FPs（5μg/ml）培养60分钟，用0.02%EDTA/PBS加FPs培养再60分钟，以2000 rpm（900×克)10分钟后，FP处理的细胞与未处理的细胞在同样的盘子。要在二维培养后分离成纤维细胞，关键是螯合二价阳离子非特异性降低整合素结合强度在含有EDTA的培养基中；在早期情况下，不需要执行此步骤扩散成纤维细胞（见上文）。

柔性聚丙烯酰胺基板

厚度为70μm的柔性聚丙烯酰胺基板基本上按照Pelham和王(1997). 首先，我们确定最佳基底刚度以获得α-SMA表达式，通过改变BIS，FA过饱和度和可检测变形浓度。凝胶硬度按所述进行宏观测定(Pelham和Wang，1997年)和计算的杨氏模量范围为4.8 N/m20.025%BIS（柔性）至38.2 N/m20.15%BIS（刚性）。所有基质均为用0.1%聚物共价涂覆-我-赖氨酸溶液（Sigma）使用磺化SANPAH(佩勒姆和王，1997)并用20%FCS后涂层4小时5天，固定并染色α-SMA、F-actin和细胞核（见下文）；这个测定α-SMA表达细胞的平均百分比显微镜下（20倍物镜），每个基底的五个区域中有三个实验。

为了同时显示细胞收缩活动和FA顺应性聚丙烯酰胺凝胶（0.075%BIS，杨氏模量18.8N/m（牛顿/米）2)使用硅晶片作为模具，提供了一个微图案(巴拉班等。，2001). 硅片（苏黎世联邦理工学院J.a.Hubbell博士的一份实物礼物，瑞士）采用标准光刻工艺生产用5×5-μm表面图案和20 nm的模具深度描述，由原子力显微镜测定(米歇尔等。，2002). 观察室是用硅胶粘合而成的在含有聚丙烯酰胺的盖玻片上加环（内径25 mm）。

抗体、免疫荧光、共焦显微镜和FA形态测量学

用0.2%的Triton X-100（TX-100）在3%的溶液中渗透细胞5分钟多聚甲醛（PFA）并用3%PFA/PBS固定10分钟整合素检测-此程序之后，用甲醇（-20°C）。我们使用了抗帕西林抗体（IgG1 mAb）和张力蛋白（IgG2b单抗，转导实验室，肯塔基州列克星敦），β3整合素（生物素缀合的IgG hamAb 2C9.G2，PharMingen，Rockford，IL），α5β1整合素（rbAb，V.Belkin的一种礼物，血液学俄罗斯莫斯科科学中心；杜吉纳等。，2001)，vinculin（hVin-1，IgG1单克隆抗体，Sigma），α-SMA（αSM-1，IgG2a单克隆抗体；斯卡利等。，1986),β-细胞质肌动蛋白（β74，rbAb；姚明等人。，1995)和EGFP（rbAb和IgG1 mAb，分子探针，尤金，俄勒冈州）。作为次要我们使用TRITC-和FITC-结合山羊抗鼠亚类IgG1的抗体和IgG2a（美国阿拉巴马州伯明翰市南方生物技术联合公司），氨基甲基香豆素醋酸酯结合山羊抗兔抗体（AMCA，Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA），Alexa 488-、Alexa 568-、，和Cy5-结合IgG抗体，以及山羊抗兔抗体（分子探头）。用链霉亲和素Alexa检测生物素化抗β3整合素488和F-actin与Phalloid-Alexa 488（分子探针）。图像是使用Axiophot显微镜上的油浸物镜采集（Plan Neofluar 63×/1.3 Ph3，德国耶拿卡尔蔡司公司）配备使用数字彩色相机和相应的软件（Axiocam、Zeiss）或使用共焦显微镜（LSM510，蔡司），具有1.5×缩放。共焦图像由三个光学截面用深度0.2μm。使用Adobe Photoshop处理图像。对于FAs的形态计量学、REF-52对vinculin和α-SMA进行双重染色在共焦图像上使用KS400软件（蔡司）如前所述(杜吉纳等。，2001)；从至少10个细胞中计算平均值（～1.500 FAs），根据每种条件进行五次独立实验。

EGFP建筑

我们用β3整合素EGFP转染REF-52(巴勒施特雷姆等。，2001)，全长Paxillin-EGFP（B.Geiger博士的一份礼物，以色列魏茨曼科学研究所，扎莫等。，2000),和α5整合素EGFP（美国大学a.F.Horwitz博士的礼物弗吉尼亚州弗吉尼亚州；劳凯提斯等人。，2001)，根据制造商协议。选择群体进行稳定表达在含有2 mg/ml G418（Life Technologies）的培养基中定期使用FACS分拣机（FACStar+、Becton）对中等EGFP表达进行分批分拣Dickinson AG，Allschwil，瑞士）。

时间间隔、视频显微镜、强度测量和FRAP

对于所有活细胞研究，细胞在DMEM/10%FCS中培养5天（±TGFβ）在20%FCS涂层的观察室（见上文）和在无血清培养基中记录；在初步实验中，血清耗竭在记录的4小时内，对FA动力学没有影响。观察到细胞配备Axiovert 100电视倒置显微镜（蔡司），配备加热装置阶段和CO2培养箱，标准EGFP过滤器组（OmegaOptical Inc.，Brattleboro，VT）和数字CCD相机（C4742-95-10，哈马松光电，Massy Cedex，法国）。用Openlab记录细胞3.0.6软件（Improvision，Basel，CH），帧间隔为2.5分钟，持续30分钟然后用FPs（5μg/ml）处理并观察再持续120分钟。为了量化FA中蛋白质密度的变化EGFP-荧光强度在FA和纤维粘附中测量使用滴管每秒（5分钟）反转8位灰度TIF-图像Adobe Photoshop 5.5的工具。具体来说，黑色比例为3×针对膜荧光和与从第一帧获得的强度相关。对于每个EGFP结构，平均值由5到10个细胞和20个FA计算连续24帧上的单元格（120分钟）。

对于FRAP，细胞被安装在配备有带有加热段和CO2培养箱（LSM510，蔡司）。在记录前1 h以1μg/ml添加FPs；在这种低浓度下FAs的解离被延缓。用open记录图像序列使用63倍物镜（蔡司）和1.5倍0.2%变焦的针孔激光传输功率（λ=488nm）。12的EGFP荧光每个前池边缘的外围FA被漂白，传输率为35%（λ=458/488/514 nm），七次迭代分别持续1s。整个细胞的控制漂白实验证明完全由于新合成的EGFP在3小时内未激活EGFP，因此没有FRAP背景后定量（LSM510图像分析软件，蔡司）通过将12个漂白样品的荧光强度标准化进行减法如前所述，每个电池有12个未漂白的相邻触点(巴勒施特雷姆等。，2001). 获得的值与荧光强度有关漂白后（部分回收），计算平均值每个单元（12个单元）。

细胞分离和Western Blot分析

评估蛋白质与TX-100不溶物的相关性细胞骨架，用冰镇萃取缓冲液（0.5%TX-100，60 mM管道，25 mM HEPES，10 mM EGTA，2 mM氯化镁2，1 mM钒酸钠，pH 6.9），补充蛋白酶抑制剂（Complete-EDTA，Boehringer Mannheim，德国曼海姆）as之前描述过(杜吉纳等。，2001). 剩余的TX-100–不溶性细胞骨架蛋白从培养皿中彻底刮下并悬浮在相同体积的提取缓冲区。这些级分和总细胞裂解物在10%的条件下运行SDS-minigels（瑞士格拉特布鲁格生物实验室股份有限公司）和印迹，用与免疫荧光。HRP结合二级抗体山羊抗鼠IgG以及山羊抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories）和ECL检测到链霉亲和素HRP（DAKO，Glostrup，丹麦）化学发光（Amersham，Rahn AG，瑞士苏黎世）；乐队是使用扫描仪进行数字化（Arcus II，Agfa，Köln，德国）和比率通过计算机软件计算一个印迹的所有条带密度之间的关系（ImageQuant V3.3，分子动力学，加州桑尼维尔）；正确的加载是通过检测vimentin表达（克隆V9，DAKO）进行测试。

统计分析

平均值为±SD，并通过双尾模型进行测试异方差学生的t吨测试。差异被认为是p≤0.05时具有统计学意义，以星号表示(*)并标有双星(**)对于p≤0.001. 我们测试了细胞骨架蛋白之间的线性相关性皮尔逊平方的计算与成纤维细胞粘附相关乘积(第页2值）。

结果

早期扩张肌成纤维细胞的纤维束仅含细胞质肌动蛋白

研究α-SMA与纤维束的结合与FA成熟相关，我们对α-SMA的扩散REF-52进行染色，β-细胞质肌动蛋白和各种FA蛋白。在的前2小时内细胞扩散，圆形REF-52的片层含有小的β-细胞质肌动蛋白束(图1安培)；α-SMA染色弥漫于细胞质(图1B). 初始附着力位点垂直于细胞边缘排列，阳性paxillin、β3-整合素（我们未发表的结果）和vinculin(图1C). α-SMA电镀后3小时开始出现在纤维束中(图1E)，一个时间点与细胞极化和第一显著应力的形成相关纤维(图1D). 在那个时候时间细胞极化和最初粘附位点外FA的形成是几乎完全与α-SMA阳性相关应力纤维(图1F);然而，与细胞相比，这种细胞表现出相似的扩散区域无α-SMA阳性纤维。Inα-SMA–阴性成纤维细胞，在4小时后开始出现与应激纤维有关的FA电镀。使用原代大鼠LF和SCF（我们的未发布的结果）。western blot的密度测定TX-100–铺展的可溶和不可溶部分肌成纤维细胞显示，电镀后1h，55%的β细胞质肌动蛋白和90%的波形蛋白在TX-100——不溶性细胞骨架；这些百分比没有随着时间。相比之下，TX-100不溶性α-SMA在3h后1h至70%，与TX-100不溶解度相关帕西林(图2B). 因此，TX-100不溶性β-细胞质肌动蛋白丝束的形成明显先于α-SMA并入细胞骨架分数。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0632251001.jpg

早期扩张的肌成纤维细胞的纤维束仅含有β-细胞质肌动蛋白。对REF-52成纤维细胞进行胰蛋白酶化处理，并对其进行2h（A–C）和3 h（D–F），然后固定和三重免疫对抗β-细胞质肌动蛋白（A和D）、α-SMA（B和E），以及vinculin（C和F）。插图以高倍显示扩散组织α-SMA存在β-细胞质肌动蛋白纤维束。电镀后3小时开始将α-SMA并入应力纤维，与FA成熟和细胞极化相关。棒材，50μm。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为mk0632251002.jpg

FA蛋白和α-SMA在TX-100中的共分布-不溶性扩张肌成纤维细胞的细胞骨架部分。（A） TX-100细胞骨架在电镀1-4小时后制备REF-52成纤维细胞并进行研究用免疫印迹法。（B） 两者中的蛋白质含量，TX-100–可溶通过密度测定法和比率对不溶性部分进行量化TX-100–不溶性蛋白质/总蛋白质的平均值为独立实验。TX-100中FA蛋白的增加——不溶性分数与不溶性α-SMA的增加相关。

在扩散过程中，成纤维细胞粘附性随着α-SMA束

为了测试α-SMA在应力纤维中的表达是否改变扩张肌成纤维细胞的粘附强度，我们调节α-SMATGFβ及其拮抗剂TGFβ-RII的表达。处于控制中条件下，70±5%REF-52表达α-SMA；这个分数是TGFβ增加至94±6%，TGFβ-RII减少至3%±2，我们定义为α-SMA阴性(图3A，插图）。这些然后对不同人群进行胰蛋白酶消化，电镀0.5–9小时反向离心，以选择粘附力强的细胞。倒置离心法显示只有一个阶段的弱附着α-SMA–阴性成纤维细胞群体（第1阶段，图3A，TGFβ-RII），但在含有α-SMA表达细胞（2期，对照，TGFβ）。第1阶段与β-细胞质肌动蛋白束形成相关，而第2相电镀后3小时开始，并与α-SMA掺入相关应力纤维。评估α-SMA是否组织成纤维我们固定并免疫染色的细胞有助于形成第二阶段的强粘附正常铺展和反向离心后。在通常的控制中19±2%的成纤维细胞将α-SMA掺入电镀后3小时的纤维束。基本上选择了离心具有α-SMA纤维束的成纤维细胞（78±7%，图3B). 类似的选择当我们使用的原代成纤维细胞培养物中α-SMA表达细胞，如SCF（20%，我们未发表的结果）或LF，含有70%α-SMA阳性细胞条件。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为mk0632251003.jpg

α-SMA在扩散相关物期间在纤维束中的出现细胞粘附增加。（A） 低（TGFβ-RII）、中等的REF-52（对照组）和高α-SMA表达（TGFβ）在含血清培养基中0.5–9小时。选择高度粘附的细胞通过反向离心，用结晶紫染色，并通过光度测定。在低附着力的第一阶段（阶段1）之后，α-SMA阳性成纤维细胞表现出第二阶段的强粘附（第2阶段），在α-SMA阴性细胞中不存在。（B）电镀后，将REF-52离心(♦）或直接固定（⋄），并对α-SMA和肌动蛋白-球蛋白进行染色，以确定含有α-SMA纤维束的成纤维细胞百分比。之后3-4小时电镀，离心基本上选择含有α-SMA的细胞灯丝束。（C和D）REF-52在无血清条件下电镀，30分钟后任选地用FPs处理（箭头所示），并离心和用结晶紫评价粘附性。SMA-FP对α-SMA–阴性REF-52（C），但抑制α-SMA阳性成纤维细胞群（D）；SKA-FP没有效果。显示了五个独立实验中的一个代表性结果在A、C和D中；三个独立实验的平均值±SD为在B中呈现。

进一步研究α-SMA表达对细胞的贡献在REF-52的涂布过程中，我们添加了SMA-FP。SMA-FP没有影响α-SMA–负REF-52(图3C)但没有影响α-SMA阳性细胞在1期的粘附(图3D)；然而，它第2阶段完全抑制粘附(图3D). SKA-FP用作对照组在所有测试条件下均无效。这些数据表明将α-SMA加入应力纤维中可显著改善FA成熟。两组具有不同粘附特性的成纤维细胞可以区分为：粘附性强的α-SMA阳性成纤维细胞和弱粘附的成纤维细胞，表达no或低水平的α-SMA。

α-SMA在长期培养中的表达水平与与FA超饱和度和成纤维细胞粘附程度有关

测试α-SMA表达、FA成熟度与细胞之间的关系发育良好的成纤维细胞与已建立的FAs和应力纤维，我们在不同血清条件下电镀REF-52 5 d(图4，A–C). 低于20%FCS，细胞仅显示出薄的应力纤维α-SMA，类似于2%FCS中TGFβ-RII处理的细胞(图4A). 在10%FCS下，较大应力纤维共同表达显著水平的α-SMAβ-细胞质肌动蛋白(图4B类). 应力纤维的厚度及其含量通过将FCS浓度降低至2%，α-SMA进一步增强；这在10%FCS中的效果与TGFβ治疗相似(图4C). 密度测定法蛋白质印迹显示α-SMA显著增加FCS浓度降低(图第四版)在20%FCS和2%的培养基之间最大约2.5倍未来作战系统。波形蛋白和β-细胞质肌动蛋白的表达与不同血清水平。在这些条件下，我们研究了FA是否成分和形态受到影响。REF-52在展出的2%FCS中增长约1.5倍的vinculin、β3整合素和paxillin水平与20%FCS中的相应蛋白表达进行比较。有趣的是，α5β1整合素的表达降低到0.5倍。在20%的FCS中，α-SMA阴性REF-52表现出较小的FA（2.3±0.3微米2)限制在应力纤维末端，如通过免疫染色发现(图4A). 在10%的FCS中，FA含α-SMA的应力纤维末端较大（3.1±0.5微米2,图4B)并在2%FCS中进一步扩大至9.2±0.5μm2; 在这个条件vinculin沿应力纤维分布(图4C). 超级FA已经在10%的FCS中形成，并通过与张力蛋白和β3整合素(图4D（四维）)；α-SMA阴性细胞（20%FCS）的经典FAβ-RII）缺乏紧张素（我们未发表的结果）。超纯FAs不含α5β1整合素，因此与来自含张力蛋白和α5β1整合素的纤维粘连(图4D)；α5β1整合素与应激纤维无关，但与较薄的肌动蛋白束有关（我们未公布的结果）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0632251004.jpg

成纤维细胞在长期培养中的粘附能力与α-SMA表达水平和FA过饱和度。REF-52在含有20%FCS（A）、10%FCS（B）的培养基中生长5天和D），以及2%FCS（C）。（A–C）细胞进行α-SMA免疫染色（蓝色）、vinculin（绿色）和β-细胞质肌动蛋白（红色），通过共焦显微镜；从红色变为紫色表示α-SMA表达。（D） 对细胞进行α5β1整合素染色（绿色）、张力蛋白（蓝色）和β3整合素（红色）；张力蛋白与超天然FAs中的β3整合素（粉红色）和α5β1整合素纤维粘连（绿松石）。棒材，25μm。（E） REF-52电镀用于在不同血清条件下5天，通过蛋白质印迹。α-SMA、paxillin、vinculin的表达水平，β3整合素随着血药浓度的降低而升高。要测试它们的粘附能力，REF-52与不同水平的α-SMA在FPs和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）60分钟，通过离心去除弱粘附细胞。随着α-SMA表达的增加，细胞粘附性增加。SMA-FP减少α-SMA表达的成纤维细胞的粘附水平α-SMA阴性成纤维细胞；SKA-FP无效。

检查α-SMA和主要FA表达的变化成分影响细胞粘附，REF-52在不同血清中生长5d将条件用胰蛋白酶消化并电镀2天。类似于粘附测试在铺展细胞上进行，长时间电镀REF-52反向离心。成纤维细胞粘附性通常随着减少而增加血清水平(图4),与α-SMA表达水平高度相关(第页2=0.89），维库林(第页2= 0.75),帕西林(第页2=0.73）和β3整合素(第页2=0.65），与波形蛋白无关(第页2=0.38），β-细胞质肌动蛋白(第页2=0.01）和α5β1整合素(第页2= -0.05). 这些数据表明细胞粘附、α-SMA表达与分子水平的相关性FA的组成。

抑制α-SMA功能影响超成熟FAs和减少已建立的肌成纤维细胞的粘附

进一步研究低血清中是否实现高粘附条件与α-SMA功能有关，我们处理了不同的SMA-FP不影响α-SMA阴性成纤维细胞和肌成纤维细胞粘附减少α-SMA阴性细胞水平的所有条件(图4F). SKA-FP是总是没有效果。通过以下方法检查SMA-FP对FA的影响视频显微镜下，我们用β3的EGFP结构转染了REF-52整合素(图5A)，帕西林(图5B)和α5整合素(图5C).不同成分的转染并没有改变α-SMA表达；此外，所有与内源性蛋白（我们未发表的结果）。在控制条件下，β3含有整合素和蛋白EGFP的FAs表现出极低的水平动力学。添加SMA-FP后，它们开始向心滑动30分钟内分散(图5、A和B类). 伴随着FAs、paxillin（但不是）的减少β3整合素在细胞中心重新分布到纤维粘附位点(图5B，箭头）。添加SMA-FP后90分钟开始，FA消失，细胞缩回他们的板层。有趣的是，SMA-FP并没有改变α5整合素在纤维粘连中的定位(图5C). SKA-FP是总是没有效果。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0632251005.jpg

SMA-FP的应用导致FA的离解。参考-52肌成纤维细胞，转染β3整合素（A）EGFP结构，用SMA-FP治疗帕罗西林（B）和α5整合素（C），并观察其疗效视频显微镜；记录次数显示在右下角角落。SMA-FP的应用导致向心滑动和拆卸β3整合素和含paxillin的FAs。然而，纤维粘连其表现出蛋白（B，箭头）的痕迹和α5整合素（C）保持稳定。棒材，20μm。

为了量化SMA-FP对β3整合素分布的影响，paxillin-和α5整合素EGFP，我们评估了荧光强度粘附位点中这些结构的密度(图6A). 未经处理的FA肌成纤维细胞（-30-0分钟）和SKA-FP治疗的细胞（对照，仅显示β3整合素）保持恒定强度所有测试EGFP结构的水平。SMA-FP处理细胞的FA30分钟后，paxillin-EGFP荧光降低至初始值的70%强度。随后β3显著下降整合素EGFP强度（40分钟后88%）；α5整合素-EGFP强度未受影响。有趣的是，帕罗西林-EGFP荧光在SMA-FP治疗后约50分钟出现纤维粘连。在控制单元中，这些中央黏附位点的vinculin和β3整合素为阴性（我们未发表的结果），并且对紧张素呈强阳性帕西林痕迹(图6B).施用SMA-FP后90分钟内，帕西林显著富集(图6C). 平行地，单元格形成了新的lamellipodia，展示了一系列新生的焦点复合体帕西林阳性(图6摄氏度、箭头）、vinculin和β3整合素（我们的未出版结果）。当细胞在用SMA-FP（3μg/ml）、张力蛋白和α5β1整合素局限于纤维粘连，而paxillin和β3整合素仅存在于经典FA中；超大型FA完全消失了（我们的未发布的结果）。SMA-FP后90分钟FA组分的分散治疗伴随着TX-100可溶性蛋白的增加TX-100减少费用的部分-不溶性细胞骨架分数(图6天)；α-SMA仅表现出向可溶性分数，而α5β1整合素和波形蛋白没有改变与对照组相比。这些数据表明α-SMA在固定超天然脂肪酸结构成分的作用。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0632251006.jpg

SMA-FP的应用导致FA部件失稳。（A）从REF-52记录荧光图像序列，转染β3整合素-、帕西林-和α5整合素-EGFP。荧光从开始每5分钟测量一次FA和纤维粘连的强度SMA-FP和SKA-FP使用前30分钟和使用后90分钟结束（对照，显示为β3整合素EGFP）。每个数据点表示平均5-10个细胞，每个细胞20个FA±SD；填充符号与对照组相比，p≤0.01。REF-52治疗90分钟SKA-FP（B）或SMA-FP张力蛋白（红色）。注意帕西林从超天然脂肪酸转变为原纤维粘连和焦点复合体的从头形成（箭头）。棒材，50μm。（D） TX 100–SMA-FP后90分钟制备不溶性细胞骨架应用并处理为Western blotting。与对照组相比，SMA-FP治疗导致TX中FA蛋白减少100–不溶性细胞骨架部分；纤维粘附蛋白α5β1整合素不受影响。

为了验证这个假设，我们检测了β3整合素在通过测量β3整合素EGFP的FRAP测定FAs。β3整合素EGFP高表达α-SMA的成纤维细胞（TGFβ，我们未发表的结果）与～10分钟相比，FRAP的半最大时间为～18分钟在对照细胞中，表达中等水平的α-SMA(图7). 在这些单元格中SMA-FP将半最大FRAP时间显著降低至5分钟。这些结果表明α-SMA在降低超天然脂肪酸中蛋白质的周转，因此可能有助于建立稳定的粘附位点。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0632251007.jpg

应用SMA-FP后，FA中β3整合素的周转增加。（A） 光漂白β3整合素EGFP转染REF-52的FA将对照条件下的（箭头）和FRAP与经SMA-FP处理的细胞（b.b.，a.b.：漂白前后）。箱体宽度，50μm。（B）每分钟测量一次荧光强度，并与在第一个视频帧中测量的强度。每个数据点表示每个细胞12个FA的平均分数FRAP；每个条件下分析12个细胞。注意应用SMA-FP后β3整合素周转增加。

SMA-FP后肌成纤维细胞收缩活性降低FA拆卸前的应用

α-SMA的一个主要功能是增加应力纤维(辛兹等。，2001年a)，它被SMA-FP特别抑制(辛兹等。，2002).可以想象，高α-SMA介导的细胞内张力对维持超大型FA至关重要。同时分析肌成纤维细胞收缩活性和FA动力学，我们生长了帕罗西林-和β3整合素EGFP转染REF-52微图案聚丙烯酰胺底物。成纤维细胞百分比α-SMA和超天然FAs随着减少而逐渐减少培养5d后聚丙烯酰胺底物的硬度；α-SMA在杨氏模量12.9 N/m以下，表达完全消失2（0.05%BIS）。我们使用的基板弹性为18.8 N/m2（0.075%BIS），其收缩力在靠近FA的印迹微图案(图8、A、D和G)并且是仅限于α-SMA阳性细胞。SMA-FP后20分钟应用后，肌成纤维细胞强烈松弛，导致规则表面图案(图8B类)；松弛时巴西林的密度保持不变(图8D). 然而，帕西林细胞松弛后约5分钟密度下降(图8F)，然后是5分钟后β3整合素密度下降（我们未发表结果）。当FA在初始细胞松弛30分钟后开始滑动时，规则的表面图案完全恢复。这一系列事件(图8G)表明α-SMA发挥的高收缩活性对维持超大型FA。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0632251008.jpg

在SMA-FP应用中，肌成纤维细胞首先失去收缩活性其次是FA失稳。转染Paxillin-EGFP的REF-52生长在微图形柔性聚丙烯酰胺基板及其视频观察显微镜。（A–C）基板变形可通过相位对比中的5×5-μm图案（用白色方块突出显示）同时观察帕罗西林-EGFP阳性FAs免疫荧光（D–F）。视频帧显示在（0）之前SMA-FP治疗后20分钟（B和E）和40分钟（C和F）。棒材，50μm。（G） 前（黑色）和后20分钟的方形图案位置SMA-FP（灰色）叠加以突出细胞松弛。时间进程细胞松弛和FA变化在H。

讨论

培养的肌成纤维细胞以α-SMA的表达为特征应力纤维和特殊粘附结构的形成，最近被称为超大型FA(杜吉纳等。，2001;托马塞克等。，2002). 本研究的主要目的是研究α-SMA在FAs成熟和调节中的作用肌成纤维细胞的粘附强度。我们表明α-SMA进入应力纤维加速FA在扩张过程中的成熟，在后期培养阶段，可能通过保持较高的细胞内收缩活性和减少FA蛋白周转。这个总的结果是增加了粘合强度。这种影响可能会皮肤成纤维细胞在伤口愈合过程中的重要作用迁移到临时血栓基质并开始肉芽组织构造（有关审查，请参见马丁，1997). 这包括结构ECM分泌增加胶原蛋白等蛋白质和FN剪接变异体ED-A的从头表达FN公司(塞里尼等。，1998). 随后，它们获得收缩表型(韦尔奇等人。，1990;辛兹等。，2001亿),即表示α-SMA(达比et（等）其他。，1990)形成一种特殊的粘附复合物，称为纤维连接(歌手，1979年).

纤维连接的特征是细胞内的牢固结合肌动蛋白纤维与细胞外FN原纤维，后者又与伤口基质中的胶原蛋白(歌手等。，1984). 我们最近提出了超大型FA培养的肌成纤维细胞作为纤维连接的合适体外模型(杜吉纳等。，2001). 与经典FA相比，它们表现出与FN相关，并含有显著水平的紧张素，但很明显与FN相关、张力蛋白阳性的纤维粘连不同的是表达高水平的vinculin、paxillin和β3整合素。在REF-52中，超天然脂肪酸与纤维粘连的区别在于没有α5β1整合素；这与TGF-β处理的人皮下和Dupuytren成纤维细胞(杜吉纳等。，2001)，表达类似水平的α-SMA招募不同的FN受体，针对ED-A FN(廖等。，2002).超天然脂肪酸的生理意义进一步得到了体外培养成纤维细胞“三维基质粘附”的研究进展小鼠胚胎组织切片(小丑等。，2001). 与超大型FA类似，这些3D基质粘连呈现典型的纤维和经典FA标记蛋白，显著地与paxillin和具有紧张素和纤连蛋白原纤维的长春花蛋白。有趣的是，胚胎间质类似伤口肉芽组织，含有高水平的ED-A FN公司(法语-常量等。，1989)；用创面肉芽组织切片作进一步研究3D底物将进一步深入了解纤维连接。纤维连接的形成加剧了肌成纤维细胞的粘附伤口基质(歌手et（等）其他。，1984). 粘附力增加可能有助于a）固定伤口床中的细胞和b），以便有效转导细胞内对底物的收缩力，以便重组基质和收缩伤口（查看托马塞克等。，2002).

成纤维细胞粘附强度与α-SMA在所有研究情况下的表达。使用5-d成纤维细胞在低血清培养中，我们可以诱导重要的α-SMA表达和应力纤维形成，因此不同于传统的血清饥饿2–24小时，减少成纤维细胞应激纤维形成。α-SMA的表达可能增加成纤维细胞的粘附通过促进脂肪酸的过饱和度。超大型FA规模的增加单独使用可能足以促进高附着力，因为FA力最近的研究表明，传输率与它们的大小成线性比例(巴拉班等。，2001). 细胞内和细胞外应激已被证明是小焦点复合体成熟为经典复合体的主要诱导剂FA及其进一步扩大（有关审查，请参阅Geiger和Bershadsky，2001年).通过激活Rho激酶增加细胞内收缩活性研究表明，该途径可增加FA大小(雷德利和霍尔，1992年;巴勒施特雷姆等。，2001). 相反，广泛的肌动球蛋白抑制剂收缩活动可分解脂肪酸或使其保持未成熟状态作为小焦点复合体的状态(沃尔伯格等。，1994;克尔扎诺夫斯卡·沃德尼卡和伯里奇，1996;赫尔夫曼等。，1999;卡韦利纳et（等）其他。，1999). 细胞外应激增强接触当基质涂层珠被限制在培养细胞(肖凯等。，1997;苏特等。，1998)甚至可以绕过细胞内收缩的需要使用微针拉动细胞边缘时的活性(里弗利纳等。，2001). 松弛预拉伸的有机硅基材，减少成纤维细胞FA大小(Sawada和Sheetz，2002)以及在柔性聚丙烯酰胺基质上生长细胞抑制FA成熟(佩勒姆和王，1997).

同样，经典FA进一步分化为超自然FA需要机械张力；它在这里被生长所阻止肌成纤维细胞粘附在柔顺的基质上，并被肌动球蛋白收缩抑制剂(杜吉纳等。，2001). 一些结果支持以下建议：肌成纤维细胞形成超天然脂肪酸所需的张力由α-SMA，与α-SMA阴性成纤维细胞(Arora和McCulloch，1994年;辛兹等。， 2001年a,2001亿).

1.α-SMA介导的收缩抑制SMA-FP对肌成纤维细胞活性的影响(辛兹等人。，2002)在FA分散之前使用微图形柔性聚丙烯酰胺进行演示基底。张力无关的震源复合体的随后积累片层尖端进一步表明了机械应力的损失。不是这样的明确为什么超大型FA首先被完全拆卸，而不是直接转化为后来改良的经典脂肪酸，因为肌成纤维细胞应用SMA-FP后保持低收缩活性(辛兹等。，2002).一种可能是AcEEED肽对α-SMA的影响聚合(沙波尼耶等人。，1995)；因此，SMA-FP可能影响FA蛋白的分布与α-SMA物理连接的全日空航空公司2-终点站。

2.β3整合素和paxillin-EGFP的荧光强度经SMA-FP治疗后，超天然脂肪酸减少，类似于BDM抑制肌动球蛋白后的vinculin-EGFP(巴拉班等。，2001)Y27632抑制Rho激酶后β3整合素EGFP的表达(巴勒施特雷姆等。，2001). 相反，LPA或显性活性RhoA转染可增加β3FA中的整合素密度。当通过FRAP分析评估时，β3整合素稳定FA的营业额较低，滑动FA的营业额较高(巴勒施特雷姆等。，2001). 因此，SMA-FP之后，超大型FA的FRAP更快表示FA稳定性降低。

3.SMA-FP对不受以下因素影响的纤维粘连无影响肌动球蛋白收缩活性的抑制(卡茨等。，2000).有趣的是，我们观察到帕西林从FA到原纤维的交换SMA-FP松弛肌成纤维细胞后的粘连FA蛋白对α-SMA介导的张力损失的反应总结于图8G。它是相比之下，最近显示机械牵引粘着部位增加其他FA蛋白，如vinculin(里弗利纳等。，2001)并特别累积在拉伸TX-100中细胞骨架(Sawada和Sheetz，2002). 需要进一步研究来阐明帕西林是否可能在传递生物力学信号方面起着关键作用作为生长因子相关信号的重要介质的作用(特纳，2000).

4.在扩散、成熟FAs和增加肌成纤维细胞的过程中与α-SMA掺入应力纤维相关的粘附力并被SMA-FP抑制扩张型肌成纤维细胞只含有β-细胞质肌动蛋白随后α-SMA并入应力纤维中～60分钟稍后。肌动蛋白亚型在其N端有本质上的不同(范德克霍夫和韦伯，1978)，将此域作为细胞内靶向。我们最近表明，SMA-FP定位于肌成纤维细胞的应力纤维(辛兹等人。，2002)，表明存在特定这些结构中的AcEEED再认识位点。因此，这种位置可能是α-SMA掺入的限制因素存在β-细胞质肌动蛋白束。我们建议肌成纤维细胞粘附位点最初由β-细胞质肌动蛋白束和随后由α-SMA介导的收缩活性增强；这与细胞骨架之间的密切关系是一致的α-SMA和FA蛋白蛋白的稳定化——蛋白酯蛋白和长春新碱。

我们得出结论，α-SMA的表达增加了通过增加应力纤维收缩活性增强FAs的强度。产生的结果FA的扩大和过饱和使部队更有效率变速器，从而增加ECM中的张力。反过来，增加了矩阵张力增加α-SMA的表达，如所示胶原蛋白凝胶(阿罗拉等。，1999)和机械应激伤口(辛兹等。，2001年b).了解这个机械反馈回路中的分子关键因素可能有助于防止其失调变成恶性循环的情况，比如增生性瘢痕的形成和各种纤维压缩性疾病。

补充材料

MBC视频：

致谢

我们衷心感谢G.Gabbiani博士的宝贵和坚持不懈科学帮助和提供实验室设施。我们感谢G。塞莱塔、J.卢西、P.卢佐、M.巴切塔、A.莫雷尔·希尔布伦纳（M.C.Maurer-Hiltbrunner）。Jacquier、J.C.Rumbeli和Sophie Clément博士在Alexander Verkhovsky博士对手稿。B.Geiger博士和A.Bershadsky，A.F.Horwitz，J.A.Hubbell，V。感谢Koteliansky和V.Belkin提供paxillin EGFP、α5整合素EGFP、TGFβ-RII、图案化硅片，以及α5β1整合素抗体。这项工作得到了瑞士国家科学基金会（31-6136.00、31-68313.02和31-54048.98）和UCB生物制品。

笔记

使用的缩写：α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；FA，焦点粘附；纤维连接蛋白；FP，融合肽；LF，肺成纤维细胞；PFA，多聚甲醛；SKA，骨骼肌动蛋白；SM，平滑肌；转化生长因子β-RII，转化生长因子β可溶性受体Ⅱ型；Triton®声波风廓线仪X-100，TX-100。

V⃞本文的在线版本包含视频材料。在线版本为可在网址：www.molbiolcell.org.

工具书类

  • Adams，J.C.（2001年）。细胞矩阵接触结构。细胞分子生命科学。 58,371-392. [公共医学][谷歌学者]
  • Arora，P.D.和McCulloch，C.A.（1994年）。的依赖项成纤维细胞对α-平滑肌肌动蛋白表达的胶原重塑。J.细胞。生理学。 159,161-175. [公共医学][谷歌学者]
  • Arora，P.D.、Narani，N.和McCulloch，C.A.（1999年）。胶原蛋白凝胶的顺应性调节转化生长因子-β成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白的诱导。美国J。病态。 154,871-882.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 新泽西州巴拉班。等。(2001). 力和焦点粘附装配：利用弹性微图形研究的密切关系基底。自然细胞生物学。 三,466-472中。[公共医学][谷歌学者]
  • 巴列斯特姆（C.Ballestrem）、欣兹（B.Hinz）、伊姆霍夫（B.A.Imhof）和韦勒·霍勒（B.Wehrle-Heller）。(2001).前进在前面，落后在后面：差异αVβ3-整合素周转率调节焦点粘附行为。《细胞生物学杂志》。 155,1319-1332.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Calderwood，D.A.，Shattil，S.J.和Ginsberg，M.H。(2000). 整合素和肌动蛋白丝：对细胞粘附和信号传导。生物学杂志。化学。 275,22607-22610. [公共医学][谷歌学者]
  • Chaponnier，C.，Goethals，M.，Janmey，P.A.，Gabbiani，F.，Gabbani，G.和Vanderckhove，J.（1995年）。特定NH2端子α-平滑肌肌动蛋白的序列Ac-EEED在聚合中起作用在体外和体内。《细胞生物学杂志》。 130,887-895.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Choquet，D.、Felsenfeld，D.P.和Sheetz，M.P。(1997). 细胞外基质刚性导致整合素-细胞骨架连接基因。单元格 88,39-48. [公共医学][谷歌学者]
  • Chrzanowska Wodnicka，M.和Burridge，K.（1996）。Rho刺激的收缩力驱动应力纤维和焦点的形成粘连。《细胞生物学杂志》。 133,1403-1415.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 克拉克，E.A.，金，W.G.，布鲁日，J.S.，西蒙斯，M.和海恩斯，R.O。(1998). 整合素介导的信号受rho成员调节GTPases家族。《细胞生物学杂志》。 142,573-586.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cukierman，E.、Pankov，R.、Stevens，D.R.和Yamada，K.M。(2001). 将细胞-基质粘附到三维。科学类 294,1708-1712. [公共医学][谷歌学者]
  • Darby，I.、Skalli，O.和Gabbiani，G.（1990年）。α-平滑肌肌动蛋白在实验性伤口愈合。实验室投资。 63,21-29. [公共医学][谷歌学者]
  • Derossi，D.、Joliot，A.H.、Chassaing，G.和Prochiantz，A。(1994). 触角类同源结构域的第三螺旋通过生物膜移位。生物学杂志。化学。 269,10444-10450. [公共医学][谷歌学者]
  • Desmoulière，A.、Geinoz，A.、Gabbiani，F.和Gabbiani，G。（1993年）。转化生长因子-beta 1诱导α-光滑肉芽组织肌成纤维细胞和静止状态下肌肌动蛋白的表达培养成纤维细胞。《细胞生物学杂志》。 122,103-111.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 杜吉纳（Dugina，V.）、丰涛（Fontao，L.）、查波尼耶（Chaponnier，C.）、瓦西里耶夫（Vasiliev，J.）和加比亚尼（Gabbiani，G.（2001）。肌纤维母细胞增生过程中的局灶性粘连特征分化受细胞内外因素控制。细胞科学杂志。 114,3285-3296. [公共医学][谷歌学者]
  • Ffrench Constant，C.、Van de Water，L.、Dvorak，H.F.和Hynes，R.O.（1989）。纤维连接蛋白胚胎模式的再现成年大鼠伤口愈合过程中的剪接。《细胞生物学杂志》。 109,903-914.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gabbiani，G.、Ryan，G.B.和Majno，G.（1971年）。肉芽组织中改性成纤维细胞的存在及其可能的作用伤口收缩。Experientia公司 27,549-550. [公共医学][谷歌学者]
  • Geiger，B.和Bershadsky，A.（2001年）。装配和焦点触点的机械传感功能。货币。操作。单元格生物学。 13,584-592. [公共医学][谷歌学者]
  • Geiger，B.、Bershadsky，A.、Pankov，R.和Yamada，K.M。(2001). 细胞外基质之间的跨膜串扰和细胞骨架。自然反相摩尔电池。生物。 2,793-805. [公共医学][谷歌学者]
  • Helfman，D.M.、Levy，E.T.、Berthier，C.、Shtutman，M.、Riveline、，D.、Grosheva，I.、Lachish-Zalait，A.、Elbaum，M.和Bershadsky，A.D。(1999). Caldesmon抑制非肌肉细胞收缩力和干扰焦点粘连的形成。分子生物学。单元格 10,3097-3112.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hinz，B.，Celetta，G.，Tomasek，J.J.，Gabbiani，G.和Chaponnier，C.（2001a）。α平滑肌肌动蛋白表达上调成纤维细胞收缩活性。分子生物学。单元格 12,2730-2741.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hinz，B.、Gabbiani，G.和Chaponnier，C.（2002年）。这个α-平滑肌肌动蛋白的NH2-末端肽通过体外和体内的肌成纤维细胞。《细胞生物学杂志》。 157,657-663.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hinz，B.、Mastrangelo，D.、Iselin，C.E.、Chaponnier，C.和Gabbiani，G.（2001b）。机械张力控制造粒组织收缩活性和肌成纤维细胞分化。美国J。病态。 159,1009-1020.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hynes，R.O.（1999）。细胞粘附：新旧问题。趋势细胞生物学。 9,M33-37。[公共医学][谷歌学者]
  • Katz，B.Z.，Zamir，E.，Bershadsky，A.，Kam，Z.，Yamada，K.M.和Geiger，B.（2000年）。细胞外基质的物理状态调节细胞基质粘附的结构和分子组成。分子生物学。单元格 11,1047-1060.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kaverina，I.、Krylyshkina，O.和Small，J.V.（1999）。基板接触的微管靶向促进其松弛和解离。《细胞生物学杂志》。 146,1033-1044.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Komesli，S.、Vivien，D.和Dutartre，P.（1998年）。嵌合细胞外区域II型转化生长因子（TGF）-β作为TGF-β融合到人免疫球蛋白Fc区的受体敌手。欧洲生物化学杂志。 254,505-513. [公共医学][谷歌学者]
  • C.M.Laukaitis、D.J.Webb、K.Donais和A.F.Horwitz。(2001). α5整合素、帕西林和α-肌动蛋白在迁移粘连形成和拆卸中的作用细胞。《细胞生物学杂志》。 153,1427-1440.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Liao，Y.F.，Gotwals，P.J.，Koteliansky，V.E.，Sheppard，D.和VanDe Water，L.（2002）。纤维连接蛋白的EIIIA段是一种配体整合素α9beta 1和α4beta 1为通过选择性剪接调节细胞粘附。生物学杂志。化学。 277,14467-14474. [公共医学][谷歌学者]
  • Martin，P.（1997）。伤口愈合计划完美的皮肤再生。科学类 276,75-81. [公共医学][谷歌学者]
  • Michel，R.，Lussi，J.W.，Csucs，G.，Reviakine，I.，Danuser，G。，Ketterer，B.、Hubbell，J.A.、Textor，M.和Spencer，N.D。(2002). 选择性分子组装图案化：一种新方法涉及用于生物应用的表面的微化学和纳米化学图案化。朗缪尔 18,3281-3287.[谷歌学者]
  • Nobes，C.D.和Hall，A.（1995年）。Rho、rac和cdc42GTPases调节相关多分子焦点复合物的组装肌动蛋白应激纤维、跛足和丝状足。单元格 81,53-62. [公共医学][谷歌学者]
  • Pelham，R.J.，Jr.和Wang，Y.（1997年）。单元格运动和焦点粘连受基底柔韧性的调节。程序。国家。阿卡德。科学。美国 94,13661-13665.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • A.J.Ridley和A.Hall（1992年）。小型GTP-结合蛋白rho调节局部粘连和肌动蛋白的组装应力纤维对生长因子的反应。单元格 70,389-399. [公共医学][谷歌学者]
  • Riveline，D.，Zamir，E.，Balaban，N.Q.，Schwarz，美国，石崎，T.、Narumiya S.、Kam Z.、Geiger B.和Bershadsky A.D。(2001). 作为机械传感器的焦点触点：外部应用局部机械力诱导mDia1依赖的焦点接触生长和岩石相关机制。《细胞生物学杂志》。 153,1175-1186.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rönnov-Jessen，L.和Petersen，O.W.（1996）。A类丝状α-平滑肌肌动蛋白的功能：运动迟缓成纤维细胞。《细胞生物学杂志》。 134,67-80.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rönnov-Jessen，L.和Petersen，O.W.（1993）。转化生长因子β1诱导α-平滑肌肌动蛋白静止的人乳腺成纤维细胞。对肌成纤维细胞的影响乳腺肿瘤的发生。实验室投资。 68,696-707. [公共医学][谷歌学者]
  • Rottner，K.、Hall，A.和Small，J.V.（1999）。Rac和Rho在基板接触动力学控制中的相互作用。货币。生物。 9,640-648. [公共医学][谷歌学者]
  • Sawada，Y.和Sheetz，M.P.（2002年）。武力Triton细胞骨架转导。《细胞生物学杂志》。 156,609-615.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Serini，G.、Bochaton Piallat，M.L.、Ropraz，P.、Geinoz，A.、Borsi、，L.、Zardi，L.和Gabbiani，G.（1998年）。纤维连接蛋白结构域ED-A对转化生长诱导肌纤维母细胞表型至关重要系数-β1。《细胞生物学杂志》。 142,873-881.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Serini，G.和Gabbiani，G.（1999年）。的机制肌成纤维细胞活性和表型调节。Exp.单元格物件。 250,273-283. [公共医学][谷歌学者]
  • 辛格，I.I.（1979）。纤维连接：跨膜含有纤连蛋白的纤维和5nm的纤维束的结合仓鼠和人成纤维细胞中的微丝。单元格 16,675-685. [公共医学][谷歌学者]
  • I.I.Singer、D.W.Kawka、D.M.Kazazis和R.A.Clark。(1984). 纤维连接蛋白和肌动蛋白纤维的体内共分布肉芽组织中的免疫荧光和电镜研究肌成纤维细胞表面的纤维连接。《细胞生物学杂志》。 98,2091-2106.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 斯科利，O.，罗普拉斯，P.，特泽西亚克，G.，安佐纳纳，D。，和Gabbiani，G.（1986年）。一种针对α-平滑肌肌动蛋白：一种新的平滑肌分化探针。《细胞生物学杂志》。 103,2787-2796.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Suter，D.M.、Errante，L.M.、Belotserkovsky，V.和Forscher，P。(1998). Ig超家族细胞粘附分子ApCAM，通过基质-细胞骨架耦合调节生长锥转向。J。细胞生物学。 141,227-240.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 托马塞克·J.J.、加比亚尼·G.、辛兹·B.、查波尼耶·C.和布朗，R.A.（2002）。肌成纤维细胞与结缔组织的机械调节组织重塑。自然反相摩尔电池。生物。 三,349-363. [公共医学][谷歌学者]
  • 特纳，C.E.（2000）。帕罗西汀与局灶性粘连发出信号。自然细胞生物学。 2,E231-236。[公共医学][谷歌学者]
  • Vandekerckhove，J.和Weber，K.（1978年）。至少6个不同肌动蛋白在高等哺乳动物中表达：基于氨基末端胰蛋白酶肽的氨基酸序列。J.摩尔。生物。 126,783-802. [公共医学][谷歌学者]
  • Volberg，T.、Geiger，B.、Citi，S.和Bershadsky，A.D。(1994). 蛋白激酶抑制剂H-7对微丝系统的收缩性、完整性和膜锚固。细胞运动。细胞骨架。 29,321-338. [公共医学][谷歌学者]
  • Welch，M.P.、Odland，G.F.和Clark，R.A.（1990年）。肌动蛋白束形成、胶原和纤维连接蛋白的时间关系基质组装和纤维连接蛋白受体表达对伤口收缩的影响。《细胞生物学杂志》。 110,133-145.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wilkins，J.A.、Stupack，D.、Stewart，S.和Caixia，S。(1991). β1整合素介导的淋巴细胞粘附佛波酯处理可增强细胞外基质。欧洲药典。免疫学。 21,517-522. [公共医学][谷歌学者]
  • Yao，X.、Chaponnier，C.、Gabbiani，G.和Forte，J.G。(1995). 胃肌动蛋白亚型的极化分布顶叶细胞。分子生物学。单元格 6,541-557.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zamir，E.、Katz，B.Z.、Aota，S.、Yamada，K.M.、Geiger，B.和Kam，Z.（1999）。细胞基质粘附的分子多样性。细胞科学杂志。 112（第11部分），1655-1669. [公共医学][谷歌学者]
  • 扎米尔，E。等。(2000). 动力学和培养的成纤维细胞中细胞基质粘连的分离。自然细胞生物。 2,191-196. [公共医学][谷歌学者]
文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会