虽然皮肤癌通常发生在50-70岁的患者中，流行病学证据表明，大部分关键的阳光18岁之前接触(1,2). 早期的角色太阳光引发的基因突变的发现支持了阳光光化性角化病、癌前病变中的p53抑癌基因皮肤鳞状细胞癌的病变。此外，p53突变细胞存在于人类肿瘤的皮肤侧翼和紫外线照射的小鼠皮肤(三,4,5,6,7,8). 特定p53密码子的突变是在阳光照射下的正常人类皮肤中出现的频率为10−6到10−2(5,9). 其他人类肿瘤p53的哪种突变似乎是早期事件包括头部和颈部癌与肝细胞癌(10,11).
因为角质形成细胞在鳞状细胞中不断丢失分化和脱皮，似乎细胞肿瘤出现前几十年阳光照射的目标是干细胞单元格。如果是的话，含有突变的角质形成细胞正常皮肤不会随机分散，而是会驻留在由突变干细胞产生的克隆斑块。p53的频率正常皮肤活检中检测到的突变取决于活检是否包括克隆。The spatial arrangement of the克隆中的细胞可能为早期的几何结构提供线索致癌作用，包括皮肤干细胞的位置肿瘤起源于人类。
因此，我们为人类设计了一种整体制备方法表皮允许免疫组织化学分析p53蛋白。p53突变通常导致核免疫阳性(12). 足够大的皮肤样本可能含有罕见的斑点染色对p53表达强烈。我们在此报告，这些补丁不仅存在并包含突变，但也经常发生，表明正常皮肤中存在大量细胞可能容易患皮肤癌。此外，我们提供了证据阳光既能引发肿瘤，又能促进肿瘤p53突变细胞。
材料和方法
表皮全支架。
新鲜皮肤样本来自丢弃的整容手术用纸巾或志愿者的纸巾。没有个人患有皮肤癌。协议由机构人员批准学科委员会；在以下情况下获得了志愿者的知情同意解释研究的性质和可能的后果。整体支架是通过修改以前的程序准备的(13,14).刮去组织中多余的脂肪，在55°C中浸泡30–60秒磷酸盐缓冲盐水（PBS）/20 mM EDTA，并立即转移到4°C PBS中至少2分钟。然后放置样品表皮侧朝上放置在4°C的培养皿上，切口穿过表皮是在一个角落做的。使用7号弯曲镊子从切口处轻轻抓住表皮与真皮分离。分离的表皮在10%中性缓冲福尔马林并在PBS中冲洗。
免疫组织化学。
内源性过氧化物酶活性用0.15%H淬火2哦2/PBS、，然后进行PBS冲洗。用0.05%皂苷（Sigma）揭开表位单位H2O、 然后是PBS。非特异性抗体结合用3%BSA（Sigma）/PBS中的正常山羊血清（Vector）封闭。吸干多余的封闭溶液，将样品培养1小时室温下用兔多克隆抗体CM-1（NovoCastra，英国纽卡斯尔）1:5000稀释，然后PBS洗涤。样品为用5μl生物素化山羊抗兔药孵育45分钟1000μl PBS/3%牛血清白蛋白和在PBS中洗涤。使用ABC和二氨基联苯胺染色（DAB）试剂（载体）30分钟。样品通过乙醇，二甲苯清除，并用Cytoseal非水安装中等（新泽西州Riverdale，Stephens Scientific）。荧光免疫染色除ABC和DAB反应为替换为用Cy-3亲和素培养（PBS中1:500稀释/3%BSA；耶鲁大学D.Ward的慷慨礼物），在PBS中洗涤，以及用Vectashield水性安装介质（Vector）安装。样品为保存在4°C的黑暗中，直到成像。
光和共焦显微镜。
DAB可视区域贴片是用校准为微米的玻璃分划板测量的放大100倍，四舍五入至最接近的0.005毫米2。只有具有清晰可识别边界和浓缩形态评分，浓缩形态定义为免疫阳性细胞间隔不超过一个无污染单元。为了最大限度地减少季节变化，对样品进行了测量是从春末秋初采集的。的共焦图像使用Bio-Read MRC 600采集荧光染色样品20倍物镜激光扫描共聚焦显微镜。图像是使用重新组装体视图成像软件（重要图像，费尔菲尔德，IA）在Silicon Graphics IRIS 4D/240 GTX上运行工作站。
DNA扩增和测序。
DAB染色补丁用30号钢针进行显微解剖。总基因组DNA为通过引用方法的变化而放大。15复制到副本编号足以用于多个p53特异性PCR。半随机非聚合物序列5′-NNNNN（G/C）Haven，CT）作为引物，反应混合物为2.5μl 10×Tag-It缓冲液[500 mM KCl/100 mM Tris·HCl，pH 8.425°C/15 mM氯化镁2/0.1%（wt/vol）明胶/1%Triton®声波风廓线仪X-100]，5μl H2O、 4μl 1.25 mM dNTPs，2.5μl Tag It引物，1μl塔克（罗氏）和10μl模板DNA（2 ng），覆盖50μl矿物油。自行车在Perkin–Elmer/Cetus热循环机中进行，如下所示：步进式循环（60°C持续3分钟/94°C持续5分钟）；30热电偶循环（2.75分钟斜坡至94°C/94°C 10秒/2分钟斜坡至24°C/24°C持续10秒）。p53基因外显子的再扩增用引物、扩增条件和对照进行如前所述的直接污染和多态性未连接PCR产物的DNA测序和序列确认(5,16,17).
统计分析。
使用以患者为分析单位。贴片频率和使用Wilcoxon秩和检验；剂量反应测试使用Jonckheere–Terpstra测试(18). 全部P（P）值为双面。
结果
p53突变克隆。
来自化妆品的临床正常皮肤手术患者和志愿者中含有许多p53免疫阳性通过光学显微镜可以看到斑块。这两种都有滤泡间表皮（图。A类)以及毛囊（图。B类). 补丁的频率平均每厘米3块2带遮阳板皮肤每厘米33块2长期暴露在阳光下的皮肤（表和图。).间歇性接触皮肤的贴片频率居中。这个贴片频率的剂量反应具有统计学意义(P（P）<0.0001），以及每对之间的差异共个类别(P（P）=0.0001至0.01）。补丁频率为与年龄无关。两个斑块形态明显，致密弥散型，后者的非染色细胞散布着免疫阳性细胞。夏季采集的样品中还含有背景水平广泛分布的免疫阳性单细胞。这些细胞类似于其他人在紫外线照射下观察到的细胞野生型p53短暂紫外线诱导小鼠皮肤蛋白质(19,20).
全山p53免疫阳性克隆人类表皮的制备。克隆产生于(A类)的真皮-表皮交界处和(B类)毛囊。在两者中例，视图是从基底面显示卵泡。(×100.)
表1
| 样品 | 年龄 | 位置 | 补丁频率，厘米−2 | 正常序列 | 基本更改 | 密码子 | 氨基酸的改变 |
|---|
| 遮阳板 |
| YC19A型 | 24 | 内部臂 | 1 |
| YC17A型 | 28 | 腹部 | 4 |
| YC7A型 | 29 | 乳房 | 1 |
| YC8A型 | 32 | 乳房 | 4 |
| YC4A系列 | 40 | 下部腹部 | 三 |
| YC13A型 | 41 | 乳房 | 7 |
| YC18A型 | 44 | 内部臂 | 2 |
| YC14A型 | 47 | 下部腹部 | 0 |
| YC6A系列 | 50 | 乳房 | 8 |
| 间歇的 |
| YC19B.1型 | 24 | 上部后面 | 11 | tCC克 | CC→TT/wt | 248 | Arg→Gln |
| YC19B.2型 | | | | tCCg公司 | CC→TT/wt | 248 | Arg→Gln |
| | | | tcCca公司 | C→T/wt | 279 | 甘氨酸→谷氨酸 |
| YC19B.3型 | | | | | 重量 |
| YC9A系列 | 31 | 左侧大腿 | 6 |
| YC18B型 | 44 | 上部后面 | 7 |
| YC5A型 | 47 | 耳后 | 8 |
| YC2A型 | 48 | 耳后 | 9 |
| YC2B.1型 | 48 | 耳后 | 38 | 全球技术合作委员会 | C→T/wt | 266 | 甘氨酸→谷氨酸 |
| YC10A系列 | 70 | 赖特大腿 | 6 |
| 慢性暴露 |
| YC12A型 | 9 | 嘴唇 | 46 | | 重量 |
| YC24A型 | 43 | 耳前 | 23 |
| YC5B.1型 | 47 | 耳廓前（左） | 29 | gcTcc公司 | ΔT/wt | 362 | …停止 |
| YC5B.2型 | | | | | 重量 |
| YC5C型 | 47 | 耳前（右） | 45 |
| YC2C.1型 | 48 | 下部眼睑 | 32 | | 重量 |
| YC2D.1型 | 48 | 耳前 | 23 | | 重量 |
| YC2D.2型 | | | | | 重量 |
| 第2季度第3季度 | | | | | 重量 |
| YC2E型 | 48 | 耳前 | 33 |
| YC23A型 | 51 | 上部眼睑（右） | 24 |
| YC23B型 | 51 | 上眼睑（左） | 25 |
| YC15A型 | 53 | 下部眼睑 | 44 |
| YC15B.1型 | 53 | 下部眼睑 | 41 | taCac公司 | C→T/wt | 81 | Thr→Ile |
| YC15B.2型 | | | | aCg公司 | C→T/wt | 273 | Arg→他的 |
| YC1A型 | 65 | 下部眼睑（右） | 36 |
| YC1B.1型 | 65 | 下眼睑（左） | 37 | tCC克 | CC→TT/wt | 248 | Arg→Gln |
| YC1B.2型 | | | | | 重量 |
| YC1B.3型 | | | | | 重量 |
| YC1B.4型 | | | | | 重量 |
| YC22A型 | 66 | 上部眼睑（右） | 33 |
| YC22B型 | 66 | 上眼睑（左） | 25 |
| YC11A型 | 74 | 耳前 | 39 |
| YC3A型 | 79 | 上部眼睑 | 27 | | 重量 |
克隆频率随阳光照射而增加。直方图显示了来自防晒、间歇性暴露和长期暴露于阳光下的皮肤。间歇性暴露皮肤的平均贴片频率不包括异常值。条形图代表SEM。
确定补丁是否实际上由p53突变组成细胞，我们显微解剖了阳光照射下的16个染色致密斑块皮肤，随机扩增整个基因组以增加可用的模板，然后扩增p53基因的特异外显子。于未连接PCR产物的直接DNA测序，50%的补丁发现p53结构基因有突变（表).重复随机和特定放大得到相同的结果突变，以及对相反的DNA链进行测序。非染色皮肤斑块两侧为野生型，表明每个p53突变仅限于补丁。突变型和野生型DNA的强度测序带大致相等，表明整个斑块被杂合突变占据；也就是说，每个补丁都是克隆。50%的数字可能反映了相关的技术限制通过显微解剖，如污染使信号模糊正常细胞。
阳光诱变。
克隆中发现的突变为相邻嘧啶位点主要为C→T取代；几个是CC→TT（表). 此模式表明诱变剂是紫外线辐射(16,21). 几个突变位点与之前在光化性角化病、鳞状上皮病中看到的相同细胞癌或基底细胞癌(5,16,17,22). 全部克隆中的突变改变了氨基酸，也改变了氨基酸为选择了。因此，很可能观察到的突变是克隆。对于干细胞，即使是无声的突变，如C→T密码子第三位的改变将由女儿继承细胞，即使没有选择压力。然而，没有沉默突变都被看到了。
三维几何。
在三维空间中，>1200检测到的p53突变克隆显示出形态的分级。修补程序环绕的毛囊经常向下延伸到毛囊。胞间无性系通常直径变小当焦平面接近真皮-表皮交界处时。关于三分之二较小的无性系呈圆锥形，顶端位于真皮-表皮交界处。大型克隆体更呈圆柱形圆形底座小于表面贴片，表明显著所有水平的横向膨胀。许多克隆的方向是垂直角度。为了更清晰地可视化小的、可能是早期阶段的三维结构p53突变克隆，几种用用荧光亲和素观察一级和二级抗体。共焦显微镜证实了起源于真皮-表皮交界处，具有宽的顶点（图。). 真皮-表皮交界处和头发毛囊是皮肤中假定干细胞的位置(23)和似乎是实验动物肿瘤的来源(24).
p53突变角质形成细胞的锥形克隆。展示是三维重建的侧视图整个表皮的免疫荧光锥。不透明度周围的背景表皮已经调整好，可以完全所有免疫染色细胞的假彩色显示z（z）-扫描。圆锥体的顶点位于视图的底部，沿基面平面。共聚焦图像被捕获使用Bio-Rad MRC 600激光扫描共聚焦显微镜，×20目标。
为了估计这些克隆中的细胞数量，我们从基底表面和计数≈6400个突变细胞/毫米2假设大约六个单元格中有三个层数可以无障碍计算，克隆大小从≈60至3000个电池。虽然表皮干细胞的几何形状不同部位的隔间不同(23)，规模感便于比较。在小鼠背部皮肤中，表皮增殖单元由约15个细胞组成：基底层单个干细胞被≈10个传递放大细胞包围，加上上覆角质形成细胞进行鳞状分化(25).由于我们观察到的p53突变克隆要大得多，它们似乎已经逃离了干细胞室的边界。在人体内表皮、假定的干细胞和传递放大细胞通过升高的β确定1整合素表达；然而，这些约占基底层的40%，因此人类皮肤中的表皮增殖单位尚不清楚(26).
阳光促进肿瘤生长。
肿瘤促进剂增加肿瘤只有在遵循肿瘤起始步骤时才会发生。除了作为一种诱变剂，UVB辐射被认为是小鼠的肿瘤促进剂皮肤(27,28). 如果含有UVB和UVA辐射的阳光发挥作用作为人类肿瘤促进剂，如果促进已经涉及到细胞如果含有p53突变，那么p53突变克隆应该是最大的暴露在阳光下的皮肤。因此，我们使用十字线来量化贴片区域，表示整个克隆的体积，但与身体部位之间皮肤厚度的变化无关。十从暴露在阳光下的皮肤中对每个贴片进行定量样品，尽管在防晒的样品中可以找到很多地区。
同一个体的斑块大小通常为20倍与年龄无关。每个测量贴片的面积绘制在图的直方图。.每次接触防晒、间歇性暴露和长期暴露暴露控制了斑块大小的分布。平均补丁数长期暴露在阳光下的皮肤比防晒的皮肤更大皮肤(P（P）= 0.02). 在生物学上比平均行为可能是这样一个事实，尽管小补丁存在于所有类别中，上限范围扩展到更大的尺寸随着接触的增加。例如，补丁的频率超过0.05 mm2是慢性病患者的5倍暴露皮肤（25%）比防晒皮肤（5%）(P（P）=0.04（通过费希尔精确测试）。因此，阳光似乎促进了p53突变细胞的克隆扩增。
克隆大小随阳光照射而增加。点直方图以毫米为单位显示面积2个体p53突变防晒、间歇性暴露和长期暴露的补丁暴露在阳光下的皮肤。每个点代表一个单独的克隆。
正常皮肤中的p53突变频率。
总面积p53——皮肤样本中的免疫阳性克隆构成p53的测量突变频率。任何导致过度表达p53蛋白表达。该频率由平均每个样本中测得的克隆面积，然后乘以按每厘米克隆数2在同一个样本中。p53基因突变频率为10−4到10−3防晒，10岁以上−3至4×10−2暴露在阳光下的皮肤。因此，高达4%的阳光照射下的正常表皮含有p53突变的角质形成细胞。它应该记住，即使是防晒的皮肤也能接受阳光暴露。
讨论
致瘤突变。
多重基因命中模型致癌作用(29,30)要求普通人有很多等待进一步基因攻击的致癌突变细胞。非常高的我们在皮肤中观察到的变异角质形成细胞克隆的频率具有典型阳光照射水平的个体表明形势不是理论上的可能性，而是现实。这些单元格通常在空间上排列成锥形无性系干细胞隔室，支持干细胞是原始单元格。稳定的p53突变干细胞群体提供了儿童阳光暴露能力的解释影响成人癌症发生率(1,2). 克隆人的年龄独立性频率与儿童期的大量突变相一致以及大多数人类皮肤癌前病变的事实(31)和紫外线诱导小鼠皮肤中p53过度表达细胞簇(7)在没有持续暴露的情况下退化。
肿瘤促进。
阳光使单细胞p53基因的一些细节(22). 在相比之下，这个单一突变细胞的扩展方式其干细胞隔室尚未得到证实。克隆大小这里的数据证实了来自阳光有利于p53突变细胞，即使克隆没有癌症或癌前样表型。可以获得较小的克隆大小即使防晒皮肤接触的阳光最少，但长期日晒似乎是克隆体尺寸超过的必要条件≈0.05毫米2。由于克隆的平均大小与年龄无关，出现的正常皮肤的图片是一个p53突变克隆阳光照射抵消了不同阶段的增减回归。Sunlight的促销活动实际上似乎与皮肤相比，皮肤中的突变细胞数量更多最初的诱变效应，因为在长期暴露的皮肤中克隆的总粒径>0.05 mm2（尺寸明显exposure-dependent）超过了数量更多的较小克隆。
如果p53基因突变，则有利于p53突变细胞的克隆扩增突变导致对以下疾病产生耐药性：(我)鳞状的分化，包括凋亡和脱落(32);(ii（ii）)转化生长因子β，一种生长抑制物角质形成细胞(33)；(三)细胞凋亡细胞与基质相互作用的丧失(34)；或(iv（四）)紫外线辐射引起的细胞凋亡(5). 我们觉得后一种模型很可能是正确的，因为紫外线诱导细胞凋亡与阳光有明显的关系，并且与p53相关(5)虽然一个p53点突变保留了凋亡能力(35). 相比之下，其他影响是中等或p53依赖性的(5,36).
p53突变细胞的抗凋亡性意味着阳光可以通过杀死正常细胞和保护变种人(5). 正常角质形成细胞恰好位于UVB照射后细胞周期的S期发育致密细胞核和嗜酸性细胞质。双标记实验（未显示）证明这些细胞具有DNA双链破坏典型的细胞凋亡死亡。这个组织保护机制被称为“细胞校对”(22). 然而，大约一半的损坏第53页+/−细胞和90%受损的p53−/−细胞对紫外线诱导的凋亡死亡具有抵抗力。之后在照射后，这些突变细胞可以克隆性扩增进入空出的隔间。这些活动是一种肿瘤促进因为凋亡选择只能在最初的p53之后起作用突变。p53突变细胞较大克隆的观察暴露在阳光下的皮肤证实了这一模型在人类身上的一个关键预测。在其他系统中开发的肿瘤促进模型是可行的，但不要求p53通路中有缺陷的细胞是克隆性的优先于他们的邻居扩张。肿瘤促进可能是结果，而不是单一机制。
