普林斯顿蛋白质整形数据库（P-POD）：生物学家的比较基因组分析工具

手动控制信息

P-POD还包括数据库中包含酵母蛋白相关信息的精选文献。文献的来源是酵母菌属基因组数据库（SGD）。SGD提供了一个文献指南工具，将酵母文献分类为不同的主题，其中两个主题，“跨谱表达”和“与疾病基因相关”，与P-POD中的数据特别相关；我们相信，这组不断更新和整理的论文包含了大多数（如果不是全部）测试酵母和其他生物体之间功能保守性的实验数据。与这些主题相关的所有论文都从SGD FTP站点下载并加载到数据库中（请参阅材料和方法). 然后，它们会显示在web界面上，并带有PubMed的链接，以便用户可以比较实验确定的功能保守性和计算预测的正畸学。当然，这组论文不涉及没有酵母同系物的蛋白质。目前正在研究一种处理这种局限性的方法；一个可能的进展是纳入了其他模式生物的文献。对于疾病相关基因，我们提供OMIM链接，至少部分填补了人类的这一空白。

此外，我们手动整理了“跨谱表达”论文，以明确指出何时实验确定了功能保守性。这些跨物种表达实验测试从一个生物体表达假定的同源基因是否会恢复另一个生物体中相应失活基因的野生型功能（几乎总是如此酿酒酵母).表5总结了仅针对疾病相关家族中酵母蛋白的这一精选信息，以说明如何将这一信息与计算结果进行比较，但P-POD包含了所有可用精选信息的酵母蛋白的实验结果。OrthoMCL预测的直向同源物通常表现出保守的功能。在643个酵母基因与其来自其他生物体的假定同源序列之间的精心策划的互补实验中，395个显示出功能保守性，并且被OrthoMCL鉴定为同源序列；OrthoMCL没有补充50个，也没有预测为正交。因此，在大多数情况下（445/643），正畸学的计算测定与功能守恒的实验结果一致。然而，在153个实验中观察到互补，但这些蛋白质不属于同一OrthoMCL家族，在45个实验中，没有发生互补，但OrthoMCL预测了这两个蛋白质之间的同源关系。这些实验结果可以作为计算预测的初步评估，但必须注意的是，正形学的定义不需要功能守恒[10]，有实际案例(例如肌动蛋白），其中体内互补因生物原因而失败，即使是真正能发挥作用的直系亲属在体外 [11].

P-POD用户界面：矫形、家庭和疾病

我们设计了一个简单的web界面，允许用户以多种方式搜索和浏览数据(图2). 可以通过各种肽标识符或基因名称查询结果，从八种模式生物中选择任意一种查询蛋白和特定分析方法，也可以通过在线孟德尔人类遗传（OMIM）ID搜索或浏览结果。

搜索生成包含以下内容的结果页面：

• 由OrthoMCL生成的预测同源基因或由Jaccard聚类生成的更为远缘相关的蛋白质组成的超链接系统发育树，
• OMIM中记录的与人类直系亲属相关的疾病和基因列表，
• 手动整理的论文列表，其中包含涉及酵母同源物的交叉互补实验，以及
• 家庭成员的ClustalW队列可下载。

使用P-POD比较方法：Jaccard和OrthoMCL

为了说明能够在单个数据库中存储多个分析的有用性，我们进一步比较了OrthoMCL和Jaccard聚类方法之间的结果。酵母查询管1仅使用OrthoMCL可揭示来自酵母和其他生物体的α-微管蛋白(图3)而不是与β和γ微管蛋白的重要共生关系[12] [13]，在管1Jaccard集群（未显示）。这三类主要的微管蛋白与细菌FtsZ蛋白有关，在真核生物分化之前就发生了分化[12]许多这样的例子被发现，特别是在远古基因家族中，这些基因家族可以追溯到所有真核生物的共同祖先。Jaccard集群提供了这种更大的进化背景。

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图3

α-微管蛋白的OrthoMCL家族。

该OrthoMCL家族仅包含α-微管蛋白，而由Jaccard家族产生的微管蛋白家族（此处显示太大）包含α、β和γ微管蛋白。

虽然OrthoMCL识别预测的直系图，但Jaccard聚类算法应该构建更广泛的家族，这些家族之间的距离更近。因此，人们最初可能会期望每个OrthoMCL家族都是相应Jaccard集群的子集。当然，由于每种算法对同系物的定义都大不相同，因此在实践中，可以合理地预期OrthoMCL和Jaccard聚类结果之间存在一定程度的分歧。在25271个OrthoMCL家族中，17340个（69%）是Jaccard集群的子集。家庭成员的某些“损失”是由于随机效应造成的；22216个OrthoMCL家族中有72%的成员少于或等于10个，作为Jaccard集群的子集保持完整，而3055个较大家族中只有49%保持完整。分配给OrthoMCL家族的全部91%的肽也位于Jaccard簇中。82%的OrthoMCL家族在单个Jaccard簇中具有80%或更多的肽；93%的人拥有50%或更多。

OrthoMCL和Jaccard结果之间不一致的另一个可能原因是，这些分析是在不同的参数设置下进行的。特别是，对齐约束仅用于Jaccard集群，因为OrthoMCL的默认和建议设置不包括对齐约束（请参见http://ortomcl.cbil.upenn.edu/orthomcl/). Jaccard聚类软件被配置为忽略未对齐两个肽长度50%以上的BLAST点击。例如，酵母MET3型和MET14型分别编码ATP硫酰化酶和腺苷酸硫酸激酶，对硫酸盐同化途径的前两步进行催化。拟南芥保留了这一区别，但秀丽线虫,D.黑腹果蝇,斑马鱼、人类和小鼠都有含有这两种活性的双功能蛋白质。OrthoMCL家族包含所有这些肽(图4B)，但是MET14型和四个拟南芥腺苷酸硫酸激酶形成自己的Jaccard簇(图4A). 在202个氨基酸中，Met14p的长度不到其他OrthoMCL家族成员的一半，因此无法满足Jaccard聚类算法中使用的50%对齐约束。

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图4

这个MET3/MET14家庭。

（A）表14Jaccard家族和（B）MET3/MET14OrthoMCL家族。

同样，将两组结果放在同一个数据库中，可以比较两种方法并检测可能的问题。我们希望这将是数据库开发人员和/或生物信息学家的一个有用功能，他们可以下载整个P-POD系统进行本地安装，作为他们选择的算法的开发基础。

WU-BLAST公司

相同的WU-BLAST结果被用作以下描述的OrthoMCL和Jaccard算法的输入。WU-BLAST（2.0MP-WashU版本）是使用默认BLASTP设置运行的：矩阵=BLOSUM62，期望阈值=10，ctxfactor=1.0，无过滤。

OrthoMCL和Jaccard算法

OrthoMCL（第1.2节，2005年3月14日）[4])比较一组基因组中的全对全BLASTP得分，首先确定假定的同源序列是两对基因组之间的相互最佳匹配，然后确定候选的最近同源序列是同一物种中彼此更相似的蛋白质，而不是其他物种中的任何序列。然后将所有的直系图和最近的平行图转换成一个图，其中节点表示蛋白质，边缘表示它们的关系。然后，在比较成对基因组时，使用归一化步骤纠正系统偏差。最后，应用马尔可夫聚类算法求解正交族（MCL v.1.005，05-118）。由于该过程在一个家族中最大限度地只包括那些至少与物种间相互最佳点击密切相关的蛋白质，因此由此产生的OrthoMCL群可以被视为一组假定的同源群，因为该群中的每个蛋白质都可能与至少一个其他群成员同源。然而，有些群体仅由来自单个物种的蛋白质组成；显然，这些群体只包含最近的Paralog，但这些信息对实验生物学家来说往往非常重要。

我们使用了以下OrthoMCL参数。P值截止：1e⁻⁵，标识百分比和匹配百分比截止值：0，最大权重：100。

OrthoMCL家族规模可以通过改变通货膨胀指数（本研究中为1.5）进行调整，但这并没有放松算法以假定的正交和Paralog列表开始的基本限制。为了让更大的家族显示出更遥远的关系，我们想去掉这种限制，并包括在很大一部分长度上表现出显著序列相似性的蛋白质。我们选择执行Jaccard聚类，并应用一组更广泛定义的标准，即同一家族的成员应在其长度的至少一半上具有显著的BLAST分数。最后一点对于减少基于短混杂域的存在将两个序列分组在一起的机会非常重要。

在Jaccard聚类分析中，如果两个蛋白质共享大量同源物，则将其归为同一家族，计算如下。首先，每个序列的同源序列列表，包括相对BLASTP得分小于1e的序列⁻⁵每个蛋白质产生的总长度至少为每个蛋白质长度的50%。然后计算每对的雅卡指数；这是它们的同调集的交集与并的大小之比，或| AB |/| AкB |。最终的簇是通过连接相互Jaccard指数高于预定阈值的蛋白质而生成的。我们评估了在0.3至0.8的范围内改变截断值对几个特征良好的蛋白质家族的影响，如肌动蛋白、微管蛋白、RNA聚合酶和几个含有RING finger或SH3结构域的蛋白质。我们选择Jaccard指数为0.4，因为它最广泛地允许包含家庭的预期成员，同时排除明显的非成员。例如，在临界值为0.5时，含有酵母肌动蛋白的家族(行动1)不适当地忽略了人和小鼠肌动蛋白相关蛋白ACTR8（行动8）和执行器8而截断值0.3显然太低，导致许多家庭有数百名外来成员。

系统发育树的生成

P-POD使用CLUSTAL W生成OrthoMCL和Jaccard家族的系统发育树[5]和PHYLIP（Felsenstein，J.2005）。PHYLIP（系统发育推断包）3.6版。由作者分发。华盛顿大学西雅图分校基因组科学系），使用ProML并打开全局重排。CLUSTAL W以默认设置运行：matrix=BLOSUM，Gaopen=10，Gaext=0.2，Gapdist=8，Max div.=40，ENDGAPS，NOPGAPS和NOHGAPS关闭，PWMATRIX=BLOSUM，PWGAPOPEN=10，PWGAPEXT=0.1，距离=Kimura，TOSSGAPS=ON，输出=PHYLIP。

文学类

在SGD“文献指南”资源的文献管理期间，论文可能与酵母基因和描述论文内容的各种主题相关。从SGD FTP网站下载了与主题“交叉特异性表达”或“疾病相关”相关的所有论文列表，并将其加载到P-POD数据库中，以及SGD馆长制作的酵母基因链接。每当查看包含相关酵母基因的家族时，这些论文就会显示在P-POD界面上；显示的每篇论文都超链接到PubMed数据库。对于与“跨谱表达”主题相关的论文，我们手动阅读每篇论文，以提取测试生物体的哪些基因，以及是否证明了功能互补。这些结果存储在数据库中，并显示在P-POD界面上。

我们感谢约翰·威金斯（John Wiggins）和马克·施罗德（Mark Schroeder）提供了出色的技术支持，感谢迈克·切里（Mike Cherry）（SGD）、帅翁（Shuai Weng）（SGD）、尤里·洪（Eurie Hong）（新加坡元）、劳里·克莱默（Laurie Kramer）（普林斯顿）和约翰·马特塞（John Matese）。