美国国家科学院院刊。2007年7月31日；104（31）：12913–12918。
轴突中的氨酰化触发RNA结合蛋白La的逆行转运
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埃娜·范·尼克尔
*特拉华大学生物科学系，纽瓦克，DE 19713；
黛安娜·E·威利斯
†Nemours生物医学研究，阿尔弗雷德·杜邦儿童医院，威明顿，DE 19803；
周杰伦·H·张
‡马里兰州贝塞斯达国家儿童健康和人类发展研究所细胞和突触神经生理学实验室神经发育和可塑性科，马里兰州20892；
科尔斯汀·鲁曼
§汉堡大学Heinrich Pette实验病毒学和免疫学研究所，德国汉堡D-20251；和
蒂尔曼·海斯
§德国汉堡大学海因里希·佩特实验病毒学和免疫学研究所，D-20251；和
¶南卡罗来纳医科大学生物化学和分子生物学系，查尔斯顿，南卡罗莱纳州29425
杰弗瑞·L·特维斯
*特拉华大学生物科学系，纽瓦克，DE 19713；
†Nemours生物医学研究，阿尔弗雷德·杜邦儿童医院，威明顿，DE 19803；
*特拉华大学生物科学系，纽瓦克，DE 19713；
†Nemours生物医学研究，阿尔弗雷德·杜邦儿童医院，威明顿，DE 19803；
‡马里兰州贝塞斯达国家儿童健康和人类发展研究所细胞和突触神经生理学实验室神经发育和可塑性科，马里兰州20892；
§德国汉堡大学海因里希·佩特实验病毒学和免疫学研究所，D-20251；和
¶南卡罗来纳医科大学生物化学和分子生物学系，查尔斯顿，南卡罗莱纳州29425
Eric M.Shooter编辑，加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学医学院，2007年6月14日批准
作者贡献：J.L.T.设计研究；E.A.v.N.、D.E.W.、J.H.C.和K.R.进行了研究；K.R.和T.H.贡献了新的试剂/分析工具；E.A.v.N.、D.E.W.和J.L.T.分析数据；E.A.v.N.、T.H.和J.L.T.撰写了这篇论文。
摘要
令人惊讶的是，大量的mRNA已被证明定位于感觉轴突，但在这些轴突中检测到的RNA-结合蛋白很少。这些轴突mRNA包括La RNA伴侣蛋白的几个潜在结合靶点。在培养物和周围神经中，镧被运输到轴突过程中。有趣的是，La通过sumoylation在感觉神经元中进行翻译后修饰。在轴突中，小的泛素样修饰多肽（SUMO）-La与动力蛋白相互作用，而天然La与驱动蛋白相互作用。赖氨酸41需要用于磺酰化，磺酰化酶不合格LaK41R公司仅显示顺行运输，而WT-La在轴突中显示顺行和逆行运输。因此，La的sumoylation决定了其在轴突室中运输的方向性，SUMO-La可能再循环至细胞体。
关键词：轴突运输，La/SSB，RNA定位，小泛素样修饰多肽
神经元过程中的局部蛋白质合成需要适当靶向mRNA、核糖体和翻译因子到轴突和树突(1). mRNA靶向可以是高度选择性的，并且特定的机制已经进化为包装mRNA进行转运。神经元mRNA以含有RNA结合蛋白和翻译机制成分的颗粒形式运输(2). 尽管来自这些颗粒的mRNA明显被用作神经元过程中翻译机制的模板，但顺行运输的RNA-结合蛋白的命运仍基本未知。
RNA-结合蛋白La最初被鉴定为Sjögren综合征和系统性红斑狼疮的自身抗原(三). 这种丰富的蛋白质有一个保守的N末端，包含“La基序”和RNA识别基序（RRM1）(4). 哺乳动物La含有第二个RRM，即RRM2。大部分细胞La位于细胞核内，与RNA聚合酶III转录物相互作用，协助RNA加工(三). La可以在细胞核和细胞质之间穿梭(5)细胞核La在细胞应激时移向细胞质(6,7). 细胞质La可以通过内部核糖体进入位点（IRES）增强病毒RNA的翻译，并且在细胞mRNA的IRES依赖性翻译中发挥作用(8–10). La还与含有5′-UTR末端寡嘧啶（TOP）元件的其他mRNA结合并促进其翻译(11). 虽然La被认为无处不在，但神经元的表达和定位尚未得到解决。我们最近发现成年大鼠的感觉轴突含有许多不同的mRNA，包括La靶基因grp78/BiP(12). 在这里，我们表明感觉轴突包含几个已知的La靶向的TOP mRNA。La被转运到轴突中，在其顺行转运过程中与驱动蛋白相关。轴索酸镧通过添加小的泛素样修饰多肽（SUMO）进行共价修饰。Sumoylated La（SUMO-La）与动力蛋白结合，K41处的sumoylation是逆行转运所必需的。
结果
La和La的细胞mRNA靶点延伸至再生轴突。
编码含有5′末端寡嘧啶元件的核糖体蛋白（RP）的几个mRNA延伸到背根神经节（DRG）神经元的轴突突[支持信息（SI）图6]. 因为已知La在其他细胞系统中与RP mRNA结合(13)，我们测试了La是否在感觉神经元中表达，以及它是否像RP信使核糖核酸一样定位于远端神经元过程。在DRG神经元中，用小鼠抗La抗体（克隆44）观察到细胞核和细胞质La(A类)和人La抗血清(SI图6A类). 在DRG神经元延伸的轴突过程中体外(14)，La信号呈颗粒状(B类和SI图7B类). 在坐骨神经损伤的轴突中可以看到类似的颗粒信号( C类和D类). 这些培养物中的雪旺细胞对La也呈免疫反应，主要显示核信号(A类).
La自身抗原延伸至再生的感觉轴突。(A类)损伤条件下的DRG培养物与小鼠抗La（绿色）和鸡抗神经丝（NF）抗体（红色）共标记。La见于细胞体，包括细胞核和轴突突（箭头所示）。(B类)在一个单独的xy公司远端轴突、小鼠抗-La（红色）与DIC融合的图像显示粒状La免疫反应。(C类和D类)将挤压部位近端约1 cm处（损伤后7天）的坐骨神经切片进行小鼠抗La（绿色）和鸡抗NF（红色）的比较。C类显示单个xy公司穿过轴突中心的平面。D类显示单个x轴显示轴突内La的平面，周围雪旺细胞细胞质中的信号较少聚集。（比例尺：A类，40微米；B类，20微米；C类和D类，5微米）
La在感觉轴中被酰化。
免疫印迹法检测轴突La抗原性是否与大鼠La的预期分子量相符(15). 小鼠抗La抗体在DRG裂解物中检测到75kDa处迁移的显著带(A类). 尽管存在与大鼠La的预期分子量相对应的条带，尤其是对于整个DRG裂解物与轴突，但这总体上是一个次要成分。人类抗La的DRG重配印迹显示只有47kDa条带(A类). 小鼠抗La抗体在非神经元细胞制备的裂解液中识别出47-kDa条带，该裂解液使用相同的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液，并添加标准蛋白酶抑制剂混合物(B类).
神经细胞La被酰化。(A类)在来自DRG培养物的细胞体和轴突裂解物的免疫印迹中，用小鼠抗-La免疫印迹显示在≈75 kDa（双箭头）处有一条强条带迁移，在≈47 kDa处有一个弱条带（单箭头），而用人抗-La印迹只检测到较低条带。(B类)在由HepG2、SKN、HeLa、NIH 3T3和标准RIPA缓冲液中裂解的非分化PC12细胞制备的印迹中，小鼠抗-La仅检测到47-kDa带（箭头所示）。(C类)在非变性缓冲液补充NEM中制备的来自粉碎坐骨神经的轴浆用于免疫印迹。小鼠抗-La抗体检测到随着NEM浓度的增加，75-kDa-La含量增加，47-kDa-La含量减少。人类抗-La的47-kDa La也表现出类似的下降。抗-SUMO1（GMP1）显示随着NEM浓度的增加，75-kDa带的水平增加。随着NEM浓度的增加，对应于游离SUMO1的17 kDa略有下降。(D类)如图所示，在10 mM NEM存在下分离的轴浆体用于小鼠和人类抗La或GMP1的免疫沉淀。小鼠抗-La抗体检测到GMP1沉淀的75-kDa带。GMP1在La沉淀中识别出以75kDa迁移的sumoylated蛋白，但在47kDa时未检测到任何蛋白。人类抗-La抗体不能识别小鼠抗-La或GMP1沉淀中的条带。用抗eIF5检测沉淀的上清液显示，这些样品的输入蛋白水平大致相当。(E类)在DRG培养物中表达SUMO-GFPs，然后用兔抗GFP沉淀，当用小鼠抗La探针探测时，表达SUMO1-和SUMO2-GFP的细胞显示≈100-kDa的条带。抗La在表达SUMO3-GFP-的细胞中检测到≈100kDa处的微弱条带。用抗GFP探针检测这些印迹显示，游离SUMO-GFP的表达相对等效。(F类)使用或不使用裂解物处理小鼠抗-La免疫沉淀，以测试用于G和H的True印迹试剂对天然与变性小鼠IgG的特异性。后者在两种制剂中都存在，但抗原只存在于加溶物样品中。即使长时间暴露，也只在IP加裂解物样品中检测到与La对应的条带。(G公司)DRG培养物在添加10 mM NEM的RIPA缓冲液中进行裂解，并与小鼠抗La、GMP1、抗KHC-H2（驱动蛋白）和抗IC74（动力蛋白）进行免疫沉淀，然后免疫印迹小鼠抗La.75千道尔顿La活性条带（双箭头）在SUMO1和动力蛋白沉淀中可见，但在驱动蛋白沉淀中不存在。用抗eIF5检测沉淀的上清液显示，这些样品的输入蛋白水平大致相当。(H（H）)在没有NEM的情况下制备轴浆，并用KHC2-H2抗体进行沉淀处理。通过免疫印迹，只有47-kDa-La与驱动蛋白重链共沉淀；用抗KHC2-H2重组表明驱动蛋白重链成功沉淀。在10 mM NEM存在下进行的实验显示了相同的结果（未显示数据）。
镧在DRG裂解物中的流动性较慢可能是翻译后修饰的结果。镧可以磷酸化(16)，但20-kDa转变所需的磷酸盐数量将显著改变La的pI，这一点尚未见报道(SI图8). 据报道，在SDS/PAGE上，SUMO的共价加成可以将底物的分子量改变20–30 kDa(17). SUMO修饰通常通过Ulp半胱氨酸蛋白酶的组成活性在细胞裂解液中丢失(17). 因此，与其他细胞制剂相比，SUMO-La在培养的DRG中必须特别稳定，才能解释La的分子质量转移。为了测试这种可能性，我们询问在具有47和75 kDa La条带的细胞制剂中，是否可以通过用Ulp蛋白酶抑制剂处理来改变47和75 kDa La的比例，N个-乙基马来酰亚胺（NEM）。来自坐骨神经的轴浆细胞显示含有标准蛋白酶抑制剂的47和75 kDa La(C类). 随着NEM数量的增加，47-kDa-La的患病率降低，75-kDa La的患病率增加。用抗SUMO1（GMP1）抗体探测NEM处理的轴浆体，显示17至150kDa的多条带（数据未显示）。在75 kDa处有一个显著的GMP1反应带，其流行率随着NEM浓度的增加而增加(C类). 为了确定75-kDa GMP1反应带是否包括SUMO-La，使用小鼠抗La和GMP1抗体从10 mM NEM存在下制备的轴浆中进行免疫沉淀。小鼠抗La沉淀的75-kDa带被GMP1识别，在GMP1沉淀中检测到小鼠抗-La的75-kDa带免疫反应性(D类). 此外，小鼠抗-La抗体也在转染SUMO-GFP构建物的PC12细胞的抗GFP沉淀物中识别出一条带(E类). 该≈100-kDa带近似于SUMO-La加GFP的分子质量。这些数据表明，SUMO1的共价加成解释了神经元制剂中La分子量增加的原因。
如所示A类，人类抗-La似乎不识别75-kDa形式的La。为了测试这种抗血清对天然La具有选择性的可能性，在20μM NEM中裂解PC12细胞，以产生大约等量的47-kDa-La和75-kDa-La(SI图7C类). 用人类抗La抗体探测这些PC12裂解物时，仅显示47-kDa带。类似地，小鼠抗-La抗体只识别人类抗-La沉淀中的47-kDa带。最后，人类抗La抗体也不能识别GMP1免疫沉淀物中的任何条带(D类). 总之，这些数据表明，这种人类抗La抗体对天然La具有选择性。
Sumoylated La结合Dynein，但不结合Kinesin。
Sumoyalization已被证明可以靶向细胞质蛋白进行核定位(18). 为了测试轴突SUMO-La是否是逆行运输的靶点，我们询问La是否直接或间接地与运动蛋白结合。为此，用小鼠抗-La抗体对DRG裂解物中的抗-La、GMP1、抗KHC-H2（驱动蛋白）和抗IC74（动力蛋白）免疫沉淀物进行免疫印迹。由于这需要使用小鼠抗体进行沉淀和印迹，Trueblot检测试剂（eBioscience，加州圣地亚哥）用于避免来自IgG重链的任何重叠信号。使用免疫沉淀法（添加或不添加任何裂解物）测试该二级抗体系统对天然小鼠IgG的特异性。Trueblot始终未检测到变性小鼠IgG(F类). 对于共免疫沉淀，小鼠抗-La在动力蛋白和SUMO1沉淀中检测到75-kDa带，但在驱动蛋白沉淀中未检测到(G公司). 另一方面，人类抗La抗体在驱动蛋白沉淀物中检测到47-kDa-La带(H（H）). 通过免疫荧光，SUMO1延伸到培养的DRG轴突(SI图9). 轴索SUMO1和La也显示出与运动蛋白的差异共定位。小鼠抗La信号与动力蛋白轴突内信号重叠(). 虽然小鼠抗-La信号与驱动蛋白信号的共定位不太明显，但人类抗-La没有表现出动力蛋白共定位，而是与驱动素重叠。SUMO1免疫反应与动力蛋白重叠，但与驱动蛋白无关。轴突SUMO1也与小鼠抗-La信号共定位，但与人类抗-La的信号没有共定位。综上所述，这些数据表明SUMO-La与动力蛋白结合但不与之结合，而天然La与动力素结合但不结合。
再生轴突含有与La和动力蛋白共定位的SUMO。如图所示，DRG培养物与氙标记的GMP1、小鼠抗La、抗KHC-H2和抗IC74共标记。间接免疫荧光法检测人抗La信号。单个xy公司显示了24小时损伤条件下DRG培养的中轴轴平面。注意，小鼠抗-La抗体检测到的信号显示与动力蛋白和SUMO1的焦点共定位（箭头）。相反，识别SUMO-La的人类抗-La检测到的信号显示出与驱动蛋白（箭头）的局灶共定位，但与SUMO1或动力蛋白没有重叠。SUMO1的信号显示与动力蛋白（箭头）的焦点共定位，但与驱动蛋白没有重叠。（比例尺：10μm）
La的Sumoylation是逆行而非顺行运输所必需的。
人类和大鼠的La蛋白同源性>80%，在包含La基序和RRM1的N末端半部分同源性最高。La的SUMO图分析(www.expasy.org/tools网站)在La基序（K41）、RRM1（K185）以及RRM1和RRM2（K208）之间显示出高概率的sumoylation位点（ΨKXE）。在人La-GFP融合构建物（huLa-GFPs）中生成赖氨酸-精氨酸突变体重量)位于K41、K185和K208（huLa-GFPK41R公司，huLa-GFPK185R型，huLa-GFPK208R系列，huLa-GFPk185转/k208转和huLa-GFPK41R/K185R/K208R)以确定人类La是否也被磺化，以及磺化是否影响其贩运。只有K41残基完整的huLa-GFP显示出任何可识别的sumoylation(A类). huLa绿色荧光蛋白K41R公司或huLa-GFPK41R/K185R/K208R突变体被抗SUMO1识别。胡拉-GFPK185R型和huLa-GFPK185R/K208R与huLa-GFP相比，sumoylation降低重量和huLa-GFPK208R系列在huLa-GFP中未检测到可辨别的动力蛋白信号K41R公司或huLaGFPK41R/K185R/K208R免疫沉淀。huLa绿色荧光蛋白K185R型和huLa-GFPK185R/K208R与huLa-GFP相比，共沉淀动力蛋白水平降低重量和huLa-GFPK208R系列(A类). 抗La印迹证实，K41完整的huLa-GFP在≈100-kDa带上的信号高于≈75-kDa带，分别对应于SUMO-huLa-GFP和huLa-GFF的近似分子质量。这些数据表明，K41是La的sumoylation和与动力蛋白相互作用所必需的。K185也能促进速殖能力和动力蛋白相互作用，但比K41少。
赖氨酸41对镧的酰化和逆行运输至关重要(A类和B类)如图所示，用WT和突变型huLa-GFP转染了天真的DRG培养物。使用抗-GFP免疫沉淀物进行免疫印迹。小鼠抗La抗体检测到的Sumoylated和native huLa-GFP可以通过不同的迁移（分别为双箭头和单箭头）进行识别。GMP1印迹显示huLa-GFP中有一条显著的带重量和huLa GFPK208R系列在huLa-GFP中检测到较微弱的条带K185R型和huLa-GFPk185转/k208转当用抗La探针探测时，这些样品还显示SUMO-huLaGFP（≈100 kDa）比天然huLa-GFP（≈75 kDaK41R公司和huLa-GFPK41R/K185R/K208R突变体对SUMO1没有检测到信号，从分子量来看，其天然huLa-GFP比SUMO-huLa-GFP.与IC74抗体检测到的共沉淀动力蛋白（即huLa-GFF）也有类似的模式重量，huLa-GFPK208R系列>胡拉-GFPK185R型，huLa-GFPK185R/K208R>胡拉-GFPK41R公司和huLa-GFPK41R/K185R/K208R). (B类和C类)转染huLa-GFP的DRG神经元重量(B类)和huLa GFPK41R公司(C类)用于活细胞成像。在60分钟内收集图像i–iv显示单个GFP聚集物在此过程中的运动（顺行，绿色；逆行，红色）。注意huLa-GFP重量显示顺行和逆行运动，但huLa-GFPK41R公司突变体只显示食人魔的能动性（另请参阅SI电影1和2). (D类和E类)huLa-GFP在0和60分钟时取样的生长锥的曝光匹配图像重量(D类)和huLa-GFPK41R公司(E类)如图所示。注意，只有huLa-GFPk41转突变体在生长锥中积累。（比例尺：B类和C类，10微米；D类和E类，5微米）
我们使用活细胞成像来更直接地测试sumoylation在La运输中的作用。huLa GFP重量延伸至轴突，呈颗粒状双向运动(B类和SI电影1). 顺行huLa-GFP重量聚集体的平均运动速度为0.21±0.04μm/sec，而逆行运动的平均速度为0.39±0.08μm/sec(P（P）≤0.05（顺行vs.逆行）。另一方面，huLa-GFPK41R公司仅显示轴突的顺行运动，平均速度为0.28±0.02μm/sec(C类和SI电影2). 总之，这些研究认为镧的sumoylation是其逆行运输所必需的。许多huLa-GFP重量粒子在观测期间周期性地停止运动，但这似乎仅限于顺行运动的粒子。23%（SD 5.8）的顺行huLa-GFP重量粒子沿轴突轴表现出一定的失速，失速期延长了观察期的36%（SD 5.6）。未观察到huLa-GFP停转K41R公司有趣的是，huLa GFPK41R公司集中在DRG神经元的远端突起，但huLa-GFP重量没有( D类和E类).
Sumoylated La在坐骨神经轴中逆行转运。
神经结扎用于确定SUMO和La是否逆行运输体内结扎成功地阻碍了轴突顺行和逆行运输，结扎近端的驱动蛋白积聚( A类和D类). La在结扎远端的神经段更强烈(B类); 高倍镜下，La集中在结扎远端的轴突中(E类). 结扎远端的GMP1信号也较强(C类); 高倍镜下，在轴突和雪旺细胞中可见SUMO1，但轴突内信号始终局限于结扎远端的节段(F类).
Sumoylated La积聚在坐骨神经结扎的远端。将结扎的坐骨神经压碎切片（损伤和结扎后3d）进行免疫染色，并用共焦显微镜进行分析。结扎近端的神经段显示在左侧，结扎远端的节段显示在赖特; 挤压部位为赖特。四个自由最大投影的蒙太奇在A–D（每个投影都是从0.9μm的10个光学平面生成的）。E类和F类代表单个光学平面穿过对应区域的一个代表性轴突的中心区域。所有图像对都匹配激光功率、光电倍增管电压、偏移和处理。A类显示NF信号。用小鼠抗-La抗体染色的神经切片显示结扎部位远端更显著的信号[B类; 另请参见中合并的NF（红色）和anti-La（绿色）E类]. 用GMP1抗体染色显示，结扎远端SUMO1的积累类似[C类; 另请参见中合并的NF（红色）和GMP1（绿色）F类]. 激酶，通过抗KHC-H2抗体检测，积聚在病变部位附近(D类). （比例尺：A–D500微米；E类和F类，10微米）
讨论
已知只有少数RNA-结合蛋白定位于轴突。我们的研究表明，La RNA伴侣在感觉轴突中同时显示顺行和逆行运输。La的mRNA靶点也被转运到这些神经元过程中，包括grp78/BiP和RP mRNA(9,12). 我们在这里展示的La的sumoylation可能提供了一种从远端细胞质位置靶向La进行核转运的方法，因为只有SUMO-La与动力蛋白相互作用。由于mRNAs和RNA-binding蛋白必须在神经元中传播很长的距离，sumoylation可能通过靶向这些蛋白质进行逆行运输，提供了一种将一些蛋白质再循环到细胞核的方法。
最近已经证明一些RNA-结合蛋白的氨酰化(19–22). hnRNP C的酰化降低其核酸结合(21). K41的氨酰化可能影响La与靶mRNA的相互作用，因为该残基位于La基序内，而La基模的缺失会改变La对靶RNA的亲和力(三). 除了中断其与mRNA的相互作用外，K41的sumoylation还可以改变La与小的非编码RNAs的相互作用。La识别RNA聚合酶III转录物中的一般3′UUU-OH基序，包括tRNAs、信号识别肽（SRP）的7S RNA和Y RNA。包含UUU-OH基元（例如端粒酶mRNA）的RNA聚合素II转录物也是La识别的靶点(4). 尽管迄今尚未证实，但轴突必须含有tRNA才能进行翻译。考虑到局部合成的EphB2被插入正在发育的轴突膜中(23)DRG轴突中合成了一些常驻ER蛋白(12)SRP的7S RNA也可能被转运到轴突中。有趣的是，最近在周围神经病中的发现表明，一些tRNA合成酶定位于轴突(24,25).
SUMO修饰通常未被检测到，因为SUMO离合酶Ulps被认为在细胞裂解过程中可以快速地去甲酰化结合物。此外，在任何时候，只有一小部分特定蛋白质被认为是酰化的(17). 与非神经元细胞培养相比，在DRG培养中，SUMO-La占优势，而天然La占优势。SUMO-La在坐骨神经轴浆细胞中也比在非神经元细胞中更为丰富。SUMO蛋白酶活性降低可能是这些制剂中SUMO-La丰富的原因。将SUMO连接酶和SUMO蛋白酶维持在神经元的不同隔室中（例如，远端轴突与细胞体）是限制这些高度极化细胞中SUMO酶活性的一种方法。虽然我们不能直接比较DRG培养和轴浆制剂的结果，但奇怪的是SUMO-La在DRG培养中如此普遍。顺向转运huLa GFP的选择性停滞重量与不能胜任sumoylation的huLa-GFP相比K41R公司和逆向运输huLa-GFP重量可能表明培养神经元中SUMO连接酶和蛋白酶的平衡有利于sumoylation。与此一致的是，Ubc9连接酶和SUMO在PC12和U2-OS细胞中的过度表达增加了SUMO-La的总体患病率（数据未显示）。
许多已知的sumoylated蛋白定位于细胞核或核孔(26). 在哺乳动物中，核SUMO底物经常参与转录调控，sumoylation抑制其转录激活活性(17,27). 例如，MEF2A转录因子在小脑颗粒细胞发育过程中以活性依赖的方式被合成(28). 虽然La在DRG神经元中显示细胞质和细胞核定位，但SUMO1和La在细胞核中没有共定位，认为神经元La的sumoylation主要位于细胞质中。在其他细胞系统中，一些细胞质蛋白需要进行sumoylation以通过核孔(18). 因此，轴突SUMO-La可能会被输送到细胞核。
神经元在将蛋白质从细胞质运输到细胞核方面具有独特的地位，因为远端细胞质成分之间的距离远大于任何其他类型的细胞。基于微管的离散机制已经进化为在神经元中长距离输送大分子和囊泡。对于大多数显示双向转运的蛋白质，改变其方向性的信号是什么尚不清楚(29). 镧的氨酰化证明小蛋白的共价加成可以决定微管运输的方向性。这将是有趣的，以确定是否sumoylation目的地为逆行运输其他蛋白质。
材料和方法
神经挤压和DRG文化。
所有动物实验都得到了动物保护和使用委员会的批准。从成年Sprague-Dawley大鼠的L4-6 DRG培养神经元。为了进行损伤调理，在培养前7天，在中高水平压碎坐骨神经(30). 如前所述进行DRG分离和培养(12). 对于损伤条件下的DRG培养物，使用80μM 5，6-二氯苯咪唑核糖抑制RNA合成(30). 坐骨神经用于分离轴浆或固定在4%多聚甲醛中并进行冷冻切片。对于坐骨神经结扎，神经在中高处被压碎两次，近端用4.0缝线从压碎处约1cm处结扎。72h后，将结扎的神经固定在4%多聚甲醛中，进行冷冻切片。
为了转染感觉神经元，将分离的原始DRG重新悬浮在电穿孔缓冲液中[123 mM NaCl/20 mM Hepes（pH 7.05）/5 mM KCl/0.7 mM Na2高性能操作4/6 mM葡萄糖）。加入一微克质粒DNA，然后立即将细胞放在冰上。使用ECM 830设备（BTX，Holliston，MA）在“LV模式”下设置为450 V下一个200 ms脉冲进行电穿孔。然后将细胞转移到DMEM/F12、10%HS、1%N1和3 mM EGTA，并放置在37°C、5%CO下2在160×克5分钟后，重新悬浮在标准介质中，并按上述方法进行电镀。电镀后4小时更换培养基，之后每天更换两次。按照制造商的说明，使用Amaxa（马里兰州盖瑟斯堡）Nucleofector用3μg质粒DNA电穿孔PC12细胞。
cDNA表达结构。
已描述huLa-GFP表达式构造(31). SUMO-GFP构件由Ronald Hay（英国邓迪大学）提供。使用Quickchange试剂盒对huLa-GFP构建物进行定点突变（德克萨斯州斯特拉赫纳市锡达河）。通过顺序诱变产生双突变体和三突变体。所有克隆均经DNA测序验证。
轴的隔离。
按说明分离轴突和细胞体制剂(12). 通过RT-PCR测试轴突制剂的纯度（见下文）。
信使核糖核酸分析。
使用RNAqueous Micro Kit（Ambion，Austin，TX）从DRG培养物的轴突和细胞体制剂中提取RNA。用RiboGreen荧光法（分子探针，尤金，OR）对所有RNA制剂进行定量。按照说明进行RT-PCR(12)，但iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA）用于逆转录（RT）。RT反应被稀释10倍，并使用AmpliTaq DNA聚合酶进行转录特异性PCR（加州福斯特市应用生物系统公司）。β-肌动蛋白mRNA扩增作为阳性对照。γ-肌动蛋白和MAP2 mRNA扩增用于检查轴突制剂是否受到细胞体或非神经元内容物的污染(12).
免疫荧光。
除非另有说明，否则所有步骤均在室温下进行。对于培养物，盖玻片在温暖的PBS中冲洗，然后在−20°C的甲醇中固定5分钟。固定盖玻片和冰冻切片在PBS中冲洗，在含有0.2%Triton X-100的PBS中渗透15分钟，然后在含有5%驴血清和5%兔血清的PBS内封闭1小时。对于标准免疫标记，样品在4°C下与在封闭缓冲液中稀释的初级抗体孵育过夜。使用了以下抗体：鸡抗NFH（1:2000；Chemicon，Temecula，CA）、人抗La（1:100；Immunovision，Springdale，AR；批号4170）、克隆44小鼠抗La的抗体（1:100，肯塔基州列克星敦转导实验室）、GMP1小鼠抗SUMO1的抗体（1:00；Zymed，San Francisco，CA；Chemicon）和小鼠抗KHC-H2（1:100）(32). 在PBS中冲洗培养物，并在封闭缓冲液中稀释的二级抗体中培养1小时。使用了以下二级抗体：FITC-结合驴抗鸡、TR-结合驴抗人、Cy5-结合驴抗兔、FITC-连接驴抗兔和TR-结合驴抗鼠（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch）。
为了与多个小鼠抗体混合，Zenon标记试剂盒用于直接将Alexafluor 488、555或647偶联到小鼠IgG（分子探针）。将标记的IgG合并到单一染色溶液中，并用于1小时标记（最终浓度，1μg/ml）。然后用PBS冲洗样品，并在4%多聚甲醛中固定15分钟。所有样品均使用带有DAPI的Vectashield（Vector Laboratories，Burlingame，CA）进行安装。使用配备检流计台的徕卡（Exton，PA）TCS/SP2显微镜对图像进行分析。
蛋白质分离和免疫沉淀。
通过在添加蛋白酶抑制剂混合物（西格玛，圣路易斯，密苏里州）的RIPA缓冲液（0.1%SDS/50 mM Tris·Cl，pH 6.8/150 mM NaCl/0.5%Nonide P-40/2 mM EDTA）中在4°C下裂解20分钟，从培养物中制备蛋白裂解物。对于用NEM处理的样品，细胞在PBS+NEM中清洗，然后在RIPA+NEM内裂解。在16000×克持续15分钟，4°C。如所述，通过挤压冷冻NTB中未固定的神经段制备轴浆(33). 蛋白质含量通过Bradford分析（Bio-Rad）标准化。对于免疫沉淀，将500μg蛋白质与1μg一级抗体混合，并在4°C下培养过夜，如图所示。使用35μl蛋白质A/G沉淀免疫复合物+琼脂糖（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。在4°C下1.5小时后，通过1000×离心收集免疫复合物克将颗粒用RIPA缓冲液（±NEM）洗涤五次，再悬浮在Laemmli样品缓冲液（Bio-Read）中，然后煮沸8分钟。
蛋白质电泳和免疫印迹。
对于标准电泳，变性裂解物或免疫沉淀物通过1D SDS/PAGE进行解析。对于2D凝胶，免疫沉淀物在−20°C下用丙酮沉淀过夜，然后再悬浮在8 M尿素/2%CHAPS/50 mM DTT中。通过通宵复水，蛋白质被被动吸收到固定化pH梯度凝胶条（pH 7-10；Amersham，Piscataway，NJ）中。通过6到10小时的线性斜坡将板条聚焦到30000 V/h。对于第二个维度，板条在6 M尿素/0.375 M Tris·Cl（pH 8.8）/2%SDS/20%甘油/2%DTT中平衡，然后使用相同的缓冲液加2.5%碘乙酰胺。然后通过SDS/PAGE解析条带。通过电泳转移将所有凝胶固定在PVDF膜（Millipore，Billerica，WA）上。
对于免疫印迹，用0.1%吐温20（TBST）在TBS中冲洗膜，然后用TBST/5%脱脂奶粉封闭膜。在4°C的温度下将印迹培养在以下抗体中过夜：小鼠抗La抗体（1:500；转导实验室）、人抗La（1:500）、小鼠GMP1抗SUMO1抗体（1:50；Zymed）、兔抗SUMO抗体（1:250；马萨诸塞州坎布里奇Abcam）、小鼠抗IC74抗体（1:五百；Chemicon）、小鼠KHC-H2抗体（1:500m）、小鼠GFP抗体（1:2000；纽约州罗氏）、，和兔抗GFP（1:1000；Abcam）。在TBS中冲洗印迹数次，然后与在阻断缓冲液中稀释的抗鼠IgG Trueblot（1:1000，eBioscience）、HRP结合的抗鼠抗体（1:5000；Cell Signaling Technology，Boston，MA）或HRP结合抗人IgG（1:400；Jackson ImmunoResearch）孵育1小时。在TBS中清洗印迹30分钟，并用ECL显影加（阿默沙姆）。
时间间隔成像。
转染huLa-GFP cDNA的DRG培养物在转染后3d用于延时成像。在37°C的TCS/SP2共焦显微镜环境室中进行成像。每隔5分钟记录Z叠加，以避免GFP信号漂白。使用Volocity分类软件包（Improvision，Lexington，MA）追踪GFP荧光颗粒。通过三个三维体的图像序列跟踪对象xy公司在z轴。在三个独立的活细胞成像实验中，每一个实验都追踪了中轴轴中至少10个移动物体的质心位置。然后使用每个被跟踪对象的归一化质心位置来确定随时间和失速时间移动的距离。
致谢
我们感谢Kirk Czymmek博士在活细胞成像方面的帮助，感谢Ronald T.Hay博士提供GFP-SUMO表达质粒。这项工作得到了美国国立卫生研究院NS041596（授予J.L.T.）、美国-以色列两国科学基金会2003-2008（授予J.L.T.）、克里斯托弗·里夫基金会TB2-0602-2（授予J.L.T.）、米里亚姆博士和谢尔登·阿德尔森医学研究基金会、，和Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant DFG HE 2814/3-2。
缩写
| DRG公司 | 背根神经节 |
| 胡拉-GFP | 人La-GFP |
| 法国试验标准 | 神经丝 |
| RP公司 | 核糖体蛋白 |
| 注册风险管理 | RNA识别基序 |
| SUMO公司 | 小泛素样修饰多肽 |
| SUMO-La公司 | sumoylated La蛋白 |
| RIPA公司 | 放射免疫沉淀分析 |
| 美国电气制造商协会 | N个-乙基马来酰亚胺。 |
工具书类
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