临床投资杂志。2003年9月15日；112(6): 843–852.
JunD通过调节旁分泌有丝分裂原预防慢性肾脏疾病
,1 ,2 ,1 ,1 ,1 ,2 ,1和1
Evangéline Pillebout公司
1法国巴黎泽维尔·比查特医学院生理学系国立圣母医学研究所U4262法国巴黎巴斯德研究所发育生物学系基因表达与疾病研究中心URA1644
乔纳森·魏茨曼
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马丁·伯廷
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卡拉·马蒂诺
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皮埃尔·费德里奇
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莫舍·亚尼夫
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杰拉德·弗里德兰德
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Fabiola Terzi公司
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通信地址：Fabiola Terzi，Institute National de la Santéet de la Recherche Médicale U426，Facultéde Médecine，Xavier Bichat，BP416，16，Rue Henri Huchard，75870 Paris，Cedex 18，France。电话：33-144856270；传真：33-142281564；电子邮件：rf.mresni.tahcib@izret公司. 收稿日期：2002年12月17日；2003年7月15日接受。
摘要
由Jun和Fos蛋白组成的AP-1转录因子在细胞增殖的微调中起着关键作用。我们之前表明，AP-1复合物在增殖反应期间被激活，与肾单位减少后肾损害的发展相平行，但关于单个Jun/Fos成分在恶化过程中的具体作用，我们知之甚少。这里我们使用了JunD淘汰赛(6月–/–)并建立小鼠慢性肾损伤实验模型（肾单位减少75%），探讨JunD的作用。肾单位减少导致不需要JunD的初始代偿生长阶段。然而，JunD对于抑制第二波细胞增殖和阻止严重肾小球硬化、肾小管扩张和间质纤维化的发展至关重要。我们表明6月D日失活不是细胞自主的，并且涉及旁分泌有丝分裂原TGF-α的上调。转化生长因子-α受体EGFR显性阴性亚型的转基因（REM）的表达阻止了双转基因中第二波细胞增殖和肾损伤的发展6月–/–/REM（快速眼动）老鼠。我们认为JunD是控制增殖以防止慢性肾脏疾病病理进展的调节网络的一部分。
介绍
肾质量的减少触发分子和细胞事件，促进剩余肾单位的代偿性生长。在某些情况下，随着肾脏病变和终末期肾功能衰竭的发展，这种代偿过程会变成病理性的(1). 虽然代偿和进展的病理生理学很复杂，但肾小球、肾小管和间质细胞的不受控制的增殖可能会促进进行性肾小球硬化、肾小管囊肿和间质纤维化的发展(2–5). 事实上，使用药物生长因子抑制剂减少肾细胞增殖(6)，中和抗体(7)，反义寡核苷酸(8)或转基因策略(9)，在一些肾损伤实验模型中阻止肾损伤的进展。肾单位减少后肾增生的分子机制和介质在很大程度上仍不清楚。
在生理和病理条件下，阳性和阴性分泌因子以及细胞-细胞和细胞-基质相互作用的复杂平衡调节肾细胞的增殖。这些因子刺激信号通路，这些信号通路汇聚起来激活转录因子并诱导细胞周期控制基因。AP-1转录因子作用于有丝分裂原激活途径的下游，通常与细胞增殖有关(10). AP-1由Jun蛋白（JunB、cJun和JunD）组成，可与Fos/ATF伙伴形成同二聚体或异二聚体(10). 体外对AP-1功能的研究已经证明了每个Jun蛋白的不同作用，并表明不同的二聚体组合决定了AP-1介导的细胞反应的性质。JunD广泛表达，其调控与c-jun公司和6月B日，这两种基因在有丝分裂刺激时都表现为即时早期基因(11,12). JunD的过度表达抑制成纤维细胞增殖并拮抗Ras诱导的转化，表明JunD是细胞生长的负调控因子(13). 相反，c-jun诱导细胞增殖和转化(13). 因此，Jun蛋白的差异调节可能协调对细胞外有丝分裂刺激的不同反应。
AP-1在损伤后肾脏病变演变中的作用是复杂的。在急性缺血性或毒性肾小管损伤中，c-Fos蛋白的过度表达可能通过促进细胞增殖而促进受损肾小管的再生(14). 相反，在慢性肾脏疾病中，AP-1的激活与恶化过程有关。在糖尿病、高血压、多囊肾病和肾小球肾炎等几种慢性病理条件下，AP-1 DNA结合活性在肾小球和/或肾小管间质病变的发展过程中增加(15–18). 肾次全切除术诱导c-fos公司和c-jun公司基因、细胞增殖与肾脏病变(三). 在几种慢性肾损伤实验模型中，干预肾损伤的发展（通过饮食或药物调节）会降低AP-1活性和细胞增殖(5,18–20). 综上所述，这些结果表明AP-1可能是肾损害发展的主要决定因素。
转基因小鼠为探索体内特定AP-1复合物的功能提供了强有力的工具(21). 然而，这些模型在生理病理学研究中的使用受到了限制。事实上c-jun公司或6月B日基因导致胚胎死亡，以及福斯敲除小鼠表现出不同的表型，即骨骼发育、生长、精子发生和动物行为缺陷(21). 相比之下，缺乏6月D日存活，表现出轻微的精子发生缺陷表型(22). 分析6月–/–成纤维细胞证实，JunD是Ras信号传导和细胞增殖的负调节因子，并表明，缺少JunD会使细胞和小鼠容易受到应激诱导的凋亡(23). JunD在体内调节细胞增殖的作用尚不明确。
这里，我们使用了6月敲除小鼠以检测JunD/AP-1在肾单位减少后肾脏疾病发展中的作用。我们表明，初始补偿性增长阶段不需要JunD。然而，JunD对于抑制第二波细胞增殖和防止肾损伤的发展至关重要。此外，我们还证明了6月D日失活涉及旁分泌丝裂原TGF-α的上调。
方法
动物。
6月–/–老鼠，其中6月D日基因被细菌取代NLS-β-加仑磁带，和REM（快速眼动）先前描述了在肾特异性1型γ-谷氨酰转肽酶启动子控制下表达截断EGFR的小鼠(9,22). 纯合子6月–/–用纯合子繁殖小鼠REM（快速眼动）小鼠获得双纯合转基因6月–/–/REM（快速眼动）老鼠。小鼠来自129SV×C57Bl6的混合遗传背景。所有实验都是在同一窝动物身上进行的。动物被随意喂食，并在12小时的光周期内被安置在恒定的环境温度下。动物程序是根据法国政府政策（西班牙农业部生产动画服务公司）进行的。
实验方案。
成人（3-4个月）6月+/+和6月–/–如前所述，室友接受肾次全切除术(24). 简单地说，右肾被切除，左肾的两极被切除，以达到总肾质量减少75%。手术后，给小鼠喂食含有30%酪蛋白和0.5%钠的规定饮食。在手术后7、14、30和60天处死小鼠。在每个时间点，四到六6月+/+和6月–/–对小鼠进行了研究。此外，双转基因6月–/–/REM（快速眼动）对同龄小鼠进行肾次全切除(n个=10），术后60天处死。每组6只非手术小鼠作为对照。
在第30天，在处死前连续3天，使用截尾容积描记法和PowerLab/4SP软件（法国巴黎AD Instruments）记录每个实验组的5只清醒小鼠的血压。在牺牲前24小时，使用Marty Technologie（法国巴黎）代谢笼从相同的动物身上采集尿液样本。
肾功能。
使用奥林巴斯多参数自动分析仪（法国巴黎仪器实验室）测量尿肌酐和蛋白质浓度。
肾脏形态学。
肾脏固定在4%甲醛中，石蜡包埋，4μm切片用周期性酸希夫（PAS）、马森三色、H&E或微硅红染色。一位病理学家对该组的性质一无所知，对所有切片进行了检查和评估。
使用尼康数码相机Dx/m/1200和Lucia软件（实验室成像有限公司，捷克共和国布拉格）在PAS染色切片上测量肾小球和肾小管肥大。随机选择20个皮层显微视野进行研究（×200）。每只动物至少分析20个非硬化性肾小球。对近端小管进行小管形态测量。分析横截面轮廓，排除位于瘢痕区附近的小管，以及含有铸型或显示明显扩张的小管。测量外轮廓面积和管腔面积，并计算上皮表面作为这两个区域之间的差异。每只动物至少分析了35个管状横截面。通过计算细胞核数量，在相同的肾小管横截面上评估肾小管细胞增生。肾小管细胞肥大是根据肾小管切片中上皮表面与细胞核数量的比值计算的。
使用已建立的半定量评分方法量化肾脏病变程度(25)稍作修改。随机选择20个微观区域进行评分。在PAS染色切片上评估肾小球病变，并根据系膜细胞增殖、玻璃样变和硬化的程度从0到2+分级。在PAS染色切片上对肾小管病变进行评估，并根据肾小管扩张的严重程度从0分到3+分。间质纤维化程度用0–2+损伤量表在微硅红染色切片上测定；0、1和2对应于微观场的0%、1-25%和25-50%。在H&E染色切片上，使用0–2+损伤量表测定间质单核细胞浸润的程度；0、1和2对应于微观场的0%、1-10%和10-20%。
免疫组织化学。
如前所述进行增殖细胞核抗原（PCNA）免疫染色(26). 对于β-半乳糖检测，4μm切片与小鼠抗-β-半乳糖抗体（Sigma-Aldrich，St.Quentin-Fallavier，France）混合培养，稀释比例为1:100，然后是生物素化绵羊抗体（Amersham Pharmacia Biotech，Les Ulis，Frances）和3-3′-二氨基苯扎定四氢氯化物（DAB）。在10个随机选择的皮层区域（×200）测定PCNA和β-半乳糖标记的管状核的数量，并根据管状切片的数量进行校正。在20个随机选择的连续切片区域中评估PCNA和β-半乳糖标记的管状核的克隆化。
对于Tamm-Horsfall共定位实验，4μm切片与绵羊抗人Tamm-Hoursfall糖蛋白Ab（法国巴黎Valbiotech公司）1:50稀释，小鼠抗PCNA Ab 1:50稀释或小鼠抗β-半乳糖抗体1:50稀释培养。然后如上所述检测PCNA和β-gal。使用兔抗羊抗体（AbCys Biology，Paris，France）结合1:150稀释的碱性磷酸酶，然后使用载体蓝碱性磷酸酶底物（AbCysBiology）检测Tamm-Horsfall蛋白。对于莲花凝集素（LTL）共定位实验，4μm切片用1:50稀释的生物素化LTL（AbCys生物学）培养，或者用1:50的小鼠抗PCNA抗体或1:50的鼠抗β-gal抗体培养。然后如上所述检测PCNA和β-gal。使用StreptABComplex/AP（DAKO，Trappes，法国）检测LTL，然后使用矢量蓝碱性磷酸酶底物。然后用载体甲基绿（AbCys生物学）对所有切片进行复染。
为了检测TGF-α和EGF，用山羊抗-TGF-α抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cru z，California，USA）稀释1:200或兔抗-EGF抗体（Sigma-Aldrich）稀释1:500培养切片，然后用生物素化驴次级抗体（Santa-Cruz Biotechnology Inc）、亲和素/生物素/过氧化物酶系统（LSAB2试剂盒；DAKO）、，和DAB。TGF-α染色的特异性通过五倍过量的阻断肽来证实，阻断肽消除了所有染色。用尼康数码相机Dx/m/1200和Lucia软件在10个选定的皮层显微区域（×200）定量EGF和TGF-α染色的平均密度。
蛋白质印迹分析。
如前所述进行免疫印迹(26)使用兔多克隆抗-JunD抗体(13)1:1000稀释或山羊多克隆抗TGF-α抗体（圣克鲁斯生物技术公司）1:100稀释。我们使用驴辣根过氧化物酶连接的次级抗体和增强化学发光（Amersham Pharmacia Biotech）。使用小鼠单克隆抗α-微管蛋白抗体（Sigma-Aldrich）作为对照。肾脏蛋白质提取物6月–/–和转化生长因子-α−/−小鼠（由美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学D.C.Lee善意提供）用于确认抗体特异性。
核糖核酸酶保护试验。
如前所述，用RNA酶保护试验量化mRNA水平(27). 利用EGF引物、5′-GACACATGCATTTGATG和5′-TCAGTAGATTCCG寡核苷酸通过逆转录酶和PCR生成EGF和TGF-α探针；TGF-α引物，5′-GCCAGATCCACACACACTCAG和5′-CACGGCACACACAGTG。周期蛋白D1、周期蛋白D2、周期素D3和对照GAPDH cRNA探针由B.Lardeux（法国巴黎国立医学研究院U327）提供。
数据分析和统计。
数据以平均值加或减SEM表示。使用ANOVA评估实验组之间的差异，如果显著，则使用Tukey-Kramer检验或Mann-Whitney检验（仅对两组进行比较）进行评估。
结果
在没有JunD的情况下加速肾脏病变的发展。
我们在6月+/+和6月–/–并在手术后7、14、30和60天研究了残余肾脏。在野生型和6月–/–我们观察到动物在术后30天内处于早期代偿性生长阶段，导致残余湿肾重量显著且渐进性增加。肾小球和肾小管肥大引起的代偿性生长6月+/+和6月–/–老鼠（表). 无论时间点或基因型如何，小管的肥大程度都高于肾小球。为了对肾小管肥大进行详细评估，我们计算了细胞核的数量，并计算了每个肾小管段的细胞数量和细胞大小。如表所示，肾小管肥大是由两种疾病的细胞肥大（细胞大小增加）和细胞增生（细胞数量增加）引起的6月+/+和6月–/–老鼠。两组间残余肾单位肥大无差异6月+/+和6月–/–第一个月的老鼠。在野生型动物中，补偿生长在第30天几乎完成。相比之下，肾小球和肾小管表面在第60天持续急剧上升6月–/–动物。在6月–/–仅小鼠在代偿生长期后60天出现严重损伤。病变主要包括肾小球硬化和/或玻璃样变以及严重的肾小管扩张和微囊形成。我们还观察到间质纤维化和单核细胞浸润的稀疏区域（图). 病变的量化显示6月–/–与野生型小鼠相比，小鼠的肾小管、肾小球和间质损伤分数明显更高（图). 综上所述，这些结果表明，肾脏生长的后期可能有利于突变小鼠肾脏病变的发展。
在没有JunD的情况下加速肾脏病变的发展。残肾的形态学和病变评分6月+/+（白条）和6月–/–（黑条）小鼠肾单位减少60天后（Nx）。在随机选择的皮质显微区域中，根据既定方法对肾损伤进行分级。(一)肾小球病变，×400。(b条)管状病变，×200。(c（c）)间质纤维化，×200。(d日)间质单核细胞浸润，×200。结果代表平均值±SEM；n个= 6.#P（P）< 0.05,##P（P）< 0.01,6月–/–与6月+/+通过Mann-Whitney测试。
高血压和蛋白尿是肾单位减少后的早期事件，先于肾脏病变的发展。为了评估JunD的缺失是否影响这些参数，我们测量了对照组和肾切除组的尿蛋白排泄量和血压6月+/+和6月–/–小鼠术后30天。不出所料，在肾单位减少后，清醒动物通过尾部剪断法记录的平均动脉血压升高。增长幅度与6月+/+（147±5毫米汞柱）和6月–/–（145±6mm Hg）小鼠与对照非手术动物（121±2mm Hg；P（P）< 0.05). 相反，肾单位减少后第30天，无论基因型如何，尿蛋白排泄量均无显著变化（对照组每24小时3.50±0.6、6.47±0.9和5.51±1.0 mg，肾切除组6月+/+，并切除了肾脏6月–/–小鼠）。
接下来我们分析了肾单位减少后JunD的表达水平。Western blot分析表明，残余物中JunD水平显著增加6月+/+肾脏与非手术对照组的比较（图). 从手术后第7天开始检测到增加，并在整个实验过程中保持不变。在变异动物中6月D日轨迹已被替换为β-gal-LacZ合金盒式磁带(22)，允许我们监视6月残肾中的基因激活。β-半乳糖阳性细胞核的数量在6月–/–肾单位减少后第7天与未手术小鼠的肾脏比较（图). 术后第一个月内保持染色，到第60天时显著增加。
肾单位减少后，JunD表达增加。(一)免疫印迹分析JunD在对照组非手术组（指定为0）和残肾中的表达6月+/+老鼠。在手术前（第0天）和肾单位减少后7、14、30和60天分析蛋白质表达。的摘录6月–/–肾脏作为阴性对照（C-）。(b条)免疫组织化学分析JunD–β-加仑对照组非手术（0）和残肾中报告基因的表达6月–/–老鼠。术前（第0天）和肾单位缩小后7、14、30和60天分别进行β-gal染色。在第60天（×200），顶部面板显示对照组和残余肾脏染色。底部面板显示每个实验时间点每个肾小管段的β-半乳糖阳性细胞数。数据为平均值±SEM；n个=每个点4-6。方差分析，然后进行Tukey-Kramer检验：**P（P）< 0.005, ***P（P）<0.001，残肾与对照肾。
在没有JunD的情况下，肾小管细胞增殖增加。
我们使用PCNA免疫染色作为细胞周期进展的标记物，分析了整个实验过程中的细胞增殖（图). 在对照组非手术肾脏中，我们记录到肾小管细胞增殖水平较低（图a） ●●●●。在第7天和第14天，两组残余肾脏中PCNA阳性管状细胞的数量均显著增加6月+/+和6月–/–老鼠。到第30天，两组的水平都已降至基线水平。细胞增殖的模式在6月+/+和6月–/–小鼠在肾切除后的第一个月内。然而，到了第60天6月–/–仅限动物。PCNA阳性细胞的数量急剧增加（超过三倍），而野生型同卵双胞胎的水平保持不变。如表所示，细胞增殖导致两种细胞每管横截面的细胞数增加6月+/+和6月–/–术后第7天残留肾脏。肾切除术后第7天到第30天，肾小管细胞核的数量没有变化。然而，在60天时显著增加，但仅在6月–/–小鼠，证实了突变动物的第二波细胞增殖。肾切除动物第60天的肾小管细胞增殖与肾小球病变、肾小管病变、间质纤维化和单核细胞浸润评分呈正相关（线性回归：r2= 0.453, 0.546, 0.603, 0.720;P（P）=0.016、0.006、0.003、0.0005，分别用于肾小球或肾小管病变、间质纤维化和单核细胞浸润）。与肾小管细胞增殖显著增加相反，无论基因型如何，肾小球中检测到的PCNA阳性细胞很少。
在没有JunD的情况下，肾小管细胞增殖增加。(一)在对照肾（灰色条）和肾组织中测量每个肾小管切片的PCNA阳性细胞数6月+/+（白色条）和6月–/–肾单位减少后7、14、30和60天（黑色条）残留肾脏。数据为平均值±SEM；n个=每个时间点4-6***P（P）<0.001，残肾与对照肾；###P（P）< 0.001,6月–/–与6月+/+方差分析，然后进行Tukey-Kramer检验。(b条)前列腺癌连续4μm切片中的PCNA和β-半乳糖免疫染色6月–/–第60天残余肾脏（×200）。(c（c）)连续切片的彩色化实验6月–/–第60天时残留肾脏。上面板：覆盖β-gal染色和LTL染色（左）或Tamm-Horsfall染色（右）。下面板：覆盖PCNA染色和LTL染色（左）或Tamm-Horsfall染色（右）。(×200).
接下来我们研究了JunD在肾单位减少后调节细胞增殖的机制。已知AP-1通过调节蛋白如细胞周期蛋白D1调节细胞周期进程(28). 放射性核糖核酸酶保护试验（RPA）未能检测到细胞周期蛋白D1、D2和D3 mRNA水平的任何变化，无论时间点或基因型如何（未显示）。然后我们分析了增殖与6月D日通过监测连续切片中PCNA和β-gal蛋白的共表达在细胞水平上的表达。表达PCNA和β-半乳糖酸的细胞数量在6月–/–小鼠，与实验时间点无关（图b） ；这两种蛋白要么由同一管段的不同细胞表达，要么在不同的管段表达。PCNA染色主要在近端小管细胞中，而β-gal在远端小管中特异表达。为了提供有利于这种定位的额外信息，我们对每个管状段使用适当的标记物进行了共定位实验。如图所示c、 我们观察到PCNA阳性核主要位于表达LTL的小管中，LTL是一种凝集素，能与近端小管刷状缘碳水化合物特异结合(29). 相反，β-gal阳性染色与Tamm-Horsfall共定位，Tamm-Harsfall是一种在Henle氏环和远端小管的上升翼表达的著名糖蛋白(30). 因此，增殖细胞不同于那些表达JunD-β-加仑报告基因，表明6月D日基因失活不是细胞自主的。
无JunD时TGF-α表达升高。
旁分泌机制可能解释了肾单位减少60天后细胞增殖的重新激活6月–/–老鼠。EGF途径在肾脏中充当自分泌/旁分泌系统；远端肾小管细胞分泌配体（主要是EGF和TGF-α），而受体（EGFR）在近端肾小管中大量表达(31,32). 我们之前已经证明了这一途径在肾脏恶化中的核心作用(5,9). 因此，我们在肾单位减少60天后监测EGF和TGF-α的表达6月–/–使用RPA的小鼠和野生型同窝伙伴。在非手术肾脏中的表达水平与6月+/+和6月–/–小鼠，但肾单位减少后发生变化（图a） ●●●●。无论基因型如何，肾切除小鼠残肾中EGF mRNA水平均降低。相反，TGF-αmRNA在大鼠残肾中显著增加6月–/–小鼠，而野生型小鼠的水平下降。
无JunD时TGF-α表达升高。(一)对照组非手术（C）和残肾（Nx）中EGF和TGF-αmRNA的表达6月+/+（白色条）和6月–/–（黑条）老鼠在第60天。数据为平均值±SEM；n个=每个点6*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，残肾与对照肾；###P（P）< 0.001,6月–/–与6月+/+肾脏进行方差分析，然后进行Tukey-Kramer试验。(b条)EGF（上部）和TGF-α（下部）在非手术对照肾和残肾中表达的免疫组织化学6月+/+和6月–/–小鼠60天（×200）。(c（c）)TGF-α在非手术对照组（C）和残肾（Nx）中表达的免疫印迹分析6月+/+和6月–/–小鼠在第60天。的摘录转化生长因子-α–/–肾脏作为阴性对照。
接下来，我们进行了免疫组织化学分析，并在对照组（非手术组）的皮质远端小管中显示了细胞质EGF和TGF-α染色6月+/+和6月–/–鼠标（图b） ●●●●。EGF染色不受肾单位减少或6月灭活。肾单位减少60天后，TGF-α水平在6月–/–肾脏染色的程度和强度。相反，TGF-α染色模式在肾单位减少后没有改变6月+/+老鼠。每管段的平均染色密度在6月–/–肾脏（0.532±0.008），而非手术肾脏（0.437±0.025）或野生型残肾（0.427±0.038）(P（P）= 0.02). Western blot分析检测到一个特异的免疫反应性37-kDa条带（在转化生长因子-α–/–小鼠）在肾单位减少后60天6月D日–/–仅限小鼠（图c） ●●●●。在整个实验时间过程中，免疫组织化学和蛋白质印迹分析显示，在肾单位减少后的第一个月内，TGF-α染色没有变化，无论基因型如何（未显示）。
抑制EGFR信号抑制JunD病变发展和细胞增殖–/–老鼠。
为了证实TGF-α在肾脏病变发展中的作用6月–/–小鼠，我们用转基因小鼠繁殖这些小鼠(REM（快速眼动）) (9)在肾近端小管细胞中选择性过度表达EGFR显性阴性突变亚型。EGFR信号的抑制显著减少了双转基因病变的发展6月–/–/REM（快速眼动）老鼠。肾单位减少两个月后，大多数肾小球和肾小管都正常，在肾单位减少的两个月内，很少观察到间质纤维化和单核细胞浸润6月–/–/REM（快速眼动）残留肾脏。与对照组相比，双转基因小鼠的肾小球和肾小管损伤评分均显著降低6月–/–小鼠（0.431±0.052对0.685±0.115，P（P）<0.02，0.155±0.030对1.516±0.213，P（P）肾小球和肾小管分别<0.001）。
免疫染色（图b） 表明在双转基因中，管状PCNA阳性细胞的数量显著降低6月–/–/REM（快速眼动）老鼠比在6月D日–/–小鼠（0.126±0.009对0.806±0.090，P（P）<0.001），并且与未手术的对照组没有显著差异。
显性阴性EGFR的过度表达可阻止肿瘤的病变发展和细胞增殖6月–/–老鼠。(一)对照组和残余（Nx）肾脏的形态学6月–/–和6月–/–/REM（快速眼动）小鼠在第60天。PAS染色，×200。(b条)正常对照肾和肾组织残留（Nx）PCNA的免疫组织化学分析6月–/–和6月–/–/REM（快速眼动）小鼠60天（×200）。
讨论
转基因小鼠提供了一种强有力的方法来确定各种因素在肾脏恶化复杂发病机制中的特定作用。我们结合了遗传方法(6月–/–小鼠）和肾损伤实验模型（总肾质量减少75%），以揭示JunD/AP-1在调节肾损伤发展中的关键作用。JunD是由肾单位减少引起的，与薄壁组织恶化时抑制第二波细胞增殖有关。在这个阶段，JunD可以防止TGF-α的过度表达，这是肾细胞的一种强大的有丝分裂原。显性阴性EGFR亚型的表达阻止了细胞的过度增殖和病变的发展6月–/–老鼠。因此，一旦实现代偿性生长，JunD就充当一个重要的开关，在肾单位减少后关闭细胞增殖，这可能是通过抑制参与肾细胞间串话的旁分泌因子实现的。
肾单位减少2个月后细胞增殖的显著增加可能解释了6月–/–突变小鼠。这一发现得到了支持，即选择性抑制近端小管增殖可防止双转基因肾损害的发生6月–/–/REM（快速眼动）老鼠。此外，一些实验和临床观察表明，细胞增殖在慢性疾病期间肾脏的破坏中起着关键作用。首先，在许多肾脏疾病中，系膜细胞、肾小管细胞和间质细胞的增殖增加，并与肾脏病变的严重程度相关(2–5). 其次，我们已经证明肾损伤的发展与两种小鼠品系（FVB/N和C57Bl6×DBA2/F1）和两种对肾单位丢失反应不同的实验模型（单侧和次全肾切除）中的细胞增殖程度平行(三,26). 第三，延缓肾脏病变进展的治疗（如药物抑制剂或饮食）可降低受损肾脏的细胞增殖率(5,7,24). 值得注意的是，JunD的缺失既不影响高血压的发展，也不影响蛋白尿的出现，这两个因素被认为是肾单位减少后肾损害发展的原因。
对培养的成纤维细胞的研究表明，JunD可以作为细胞增殖的负调节因子(13,23). 在这里，我们首次证明了体内的类似作用，并证明了JunD通过抑制旁分泌因子的表达间接防止肾细胞增殖。事实上，我们发现表达JunD-β-加仑报告基因不同于那些表达PCNA的基因。PCNA阳性细胞主要位于近端肾小管中，肾小管在恶化过程中发生扩张，而β-半乳糖染色则出现在生长因子产生的远端肾小管。这支持了早期的报道，即缺血后肾脏中过度表达Jun/Fos蛋白的远端肾小管细胞与进行DNA合成的近端肾小管上皮细胞不同(33). 此外，我们发现编码G1/S转换关键调节因子的细胞周期蛋白D1 mRNA的表达在6月–/–肾脏。在病理条件下，其他细胞周期调节因子可能参与肾脏增殖(34). 最后，我们观察到（i）TGF-α在肾单位减少后远端小管中的表达增加6月–/–小鼠和（ii）通过显性负转基因策略使近曲小管中的TGF-α受体功能失活，阻止双转基因中细胞增殖的增加6月–/–/REM（快速眼动）老鼠。TGF-α的增加是特异性的，因为EGF的表达不受6月灭活。有趣的是，TGF-α蛋白水平的增加高于转录水平的增加，这表明在我们的实验条件下，转化生长因子-α的表达可能受到翻译和转录控制的调节。先前的体外研究表明，TGF-α表达的调节是一种复杂的现象，涉及几个步骤，包括控制mRNA转录、mRNA稳定性、蛋白质翻译和促TGF-α加工(35). 根据细胞类型和/或病理状况，这些事件中的每一个都可能成为主要的检查点。JunD调节TGF-α表达的机制尚不清楚，值得进一步研究。
EGFR通路的激活与肾脏疾病的演变有关。活性EGFR形式c-erb-B2受体的过度表达诱导转基因小鼠肾小管增生和肾囊肿的形成(36). 相反，近端小管中显性阴性EGFR亚型的表达抑制肾小管细胞增殖和间质胶原积聚，导致肾单位减少后肾小球和肾小管间质病变减少(9). 其他遗传方法（将小鼠品系与奥普克囊性和波-2EGFR突变）已证实EGFR在肾小管囊肿形成和细胞增殖中的作用(37). 此外，EGF和TGF-α是肾脏中两种主要的EGFR配体，它们在几种肾脏疾病中的发病率都有所增加，但尚未研究每种因素的作用(38). 我们的结果表明，TGF-α而非EGF参与肾实质的破坏。转基因小鼠研究证实了这一点，在转基因小鼠中TGF-α的过度表达导致了严重的肾损伤(39)而广泛过度表达EGF的转基因小鼠并没有形成肾脏表型(40).
在肾切除术后的第一个月内，根据肾脏重量、肾小球和肾小管肥大、PCNA染色和细胞核计数判断，初始代偿性肾脏生长不受JunD缺失的影响。需要指出的是，早期代偿反应阶段在强度、性质（细胞大小和数量的增加）和区室（肾小球和肾小管过度生长）方面是相似的6月+/+和6月–/–残留肾脏。与早期相比，突变小鼠在第60天仅每个小管的细胞数增加，而细胞大小没有改变，这一观察结果表明小管增生而不是肥大在病变发展中起着主导作用。此外，不同的分子事件可能调节与肾脏病变发展相关的初始代偿生长期和晚期增殖。值得注意的是，在包括本研究中使用的几种抗病变小鼠菌株中，在肾单位减少至少6个月后才能检测到细胞增殖增加或病变发展（未公布的数据）。本研究首次证明了在没有JunD的情况下存在第二波细胞增殖。我们认为，在代偿期后抑制细胞增殖对预防病理损伤至关重要。JunD代表了基因在这个关键转折点发挥作用的第一个例子。可能直接或间接涉及6月基因失活尚待阐明。
对不同鼠种的研究强调了肾脏病变发展的遗传因素。先前的数据表明，肾单位减少会导致FVB/N或破烂的少趾短尾（ROP）小鼠的病理损伤，而其他菌株（如C57Bl6和C57Bl 6×DBA2/F1）对早期肾功能恶化具有抵抗力(26,41,42). 然而，在肾单位减少8个月后，在一些耐药菌株中出现轻微病变(9). 遗传背景影响其他肾脏疾病实验模型中肾脏表型的严重性，如多囊肾病或阿尔波特肾病(43,44). 我们研究中使用的小鼠具有来自两种抗早期肾脏恶化菌株的混合129/Sv×C57Bl6背景。Megyesi等人报告称，129/Sv小鼠在肾单位减少后出现肾损害，但肾小管间质损害较轻，仅在手术后14-16周才明显，远迟于目前的方案(45). AP-1组分可能直接或间接参与肾脏疾病的易感性；也就是说，JunD缺失可以将耐药小鼠转化为致病动物。尽管我们知道小鼠的混合遗传背景可能会影响肾脏病变的发展，但一致使用匹配的同窝出生的小鼠和EGFR转基因小鼠的完全拯救表明，遗传背景并不能解释这种显著的表型。值得注意的是，肾脏疾病的演变在患者中差异很大，从进展缓慢到快速(46)，但遗传因素仍然未知。
总之，以前的体外研究支持JunD作为增殖和细胞周期进程的负调控因子的作用。在这里，我们提供了我们认为是体内类似作用的第一个证据，并证明了JunD介导的增殖抑制可能防止与病理条件相关的增生。此外，我们的研究强调了AP-1调节细胞增殖的一种新的旁分泌机制，扩展了AP-1细胞控制的复杂网络。最后，我们确定了一个实验模型，该模型可能有助于我们（i）确定与人类患者不同临床时间进程的肾脏疾病易感性相关的信号成分，以及（ii）设计治疗策略，以治疗越来越多的慢性肾衰竭患者。
致谢
我们感谢斯蒂芬妮·勒科尔（Stephanie Lecorre）、马蒂娜·穆法特·乔利（Martine Muffat-Joly）和艾格妮斯·罗格朗（Agnes Legrand）在法国理工学院第二研究所（Institute Fédératif de Recherche 2）的探索与研究中心（Centre d’Explorations Fonctionelles Int gr es）提供技术援助。我们感谢D.C.Lee转化生长因子α-/-肾脏，B.Lardeux用于RPA探针，P.Briand用于批判性建议，P.Verpillat用于统计建议。这项工作得到了国立圣母医学研究所、笛卡尔大学、生理学研究实验室、癌症研究协会（9896号拨款）、工业与技术研究中心、欧洲共同体研究人员培训与流动计划、，和国际癌症研究协会。
脚注
利益冲突：提交人声明不存在利益冲突。
使用的非标准缩写：增殖细胞核抗原（PCNA）；周期酸希夫（PAS）；莲花凝集素（LTL）。
工具书类
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