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EMBO J。2007年7月11日；26(13): 3144–3156.
2007年6月7日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7601745
预防性维修识别码：项目经理1914093
PMID：17557079

果蝇属线粒体定位IAP拮抗剂和促凋亡丝氨酸蛋白酶Omi

马达维·查拉,1,2,* 斯里尼瓦斯·马拉迪,1,2,* 布雷特·佩洛克,3 道格拉斯·德雷斯内克,3 Shankar Varadarajan公司,1,2 Y惠特尼·尹,2,4 克里斯汀·怀特,3和肖恩·布拉顿1,2,一
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补充资料

摘要

尽管线粒体外膜通透性对哺乳动物至关重要，但对苍蝇来说，线粒体外膜渗透性对细胞凋亡的重要性仍存在很大争议。在此，我们证明果蝇属Omi（dOmi）是丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2的一种苍蝇同源物，是一种发育调控的线粒体膜间空间蛋白，经过过程性切割，就地产生两种不同的凋亡抑制因子（IAP）结合基序。根据促凋亡刺激，成熟的dOmi随后被差异释放到胞质溶胶中，在胞质溶胶中它选择性地与杆状病毒IAP重复序列2（BIR2）结构域结合果蝇属IAP1（DIAP1）并取代引发剂caspase DRONC。然而，这种相互作用本身不足以促进细胞凋亡，因为dOmi无法从DIAP1的BIR1结构域中取代效应器caspase DrICE。相反，dOmi通过蛋白水解降解DIAP1减轻所有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶对DIAP1的抑制，并诱导培养细胞和发育中的苍蝇眼的凋亡。总之，我们首次在苍蝇中证明线粒体通透性不仅发生在凋亡过程中，还导致真正的促凋亡蛋白的释放。

关键词：凋亡，DIAP1，dOmi，DRONC，果蝇属

介绍

细胞凋亡或程序性细胞死亡是进化上保守的过程，是大多数（如果不是所有的话）后生动物正常发育和体内平衡所必需的(Danial和Korsmeyer，2004年;Kornbluth and White，2005年). 半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）通常在细胞凋亡过程中被激活，并负责与这种形式的细胞死亡相关的生化和形态学特征。因此，介导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活和/或调节其活性的机制非常有趣(Fuentes-Prior和Salvesen，2004年). 在哺乳动物中，细胞应激通常导致线粒体外膜通透性（MOMP），这有助于细胞色素的释放c（c）从膜间间隙进入胞浆。细胞色素c（c）然后与适配器蛋白、凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合，在dATP或ATP的存在下，刺激Apaf-1寡聚化为大的～700–1400 kDa凋亡小体复合物，从而招募并激活启动子caspase-9和效应子caspase-3(凯恩等, 2002).

鉴于MOMP对凋亡的重要性，促凋亡（例如Bim、Bid、Bax和Bak）和抗凋亡（例如Bcl-2、Bcl-xL（左）和Mcl-1）Bcl-2家族成员已经进化到严格控制这一过程(Danial和Korsmeyer，2004年). 然而，如果半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶被激活，第二层保护层也存在，包括凋亡抑制蛋白（IAP）(Salvesen和Duckett，2002年). IAP最初是在杆状病毒中发现的，在病毒复制期间用于抑制宿主细胞死亡，其特征是存在一个或多个杆状病毒IAP重复（BIR）结构域，在某些情况下，还存在一个C末端RING结构域，该结构域起E3泛素连接酶的作用。X-linked IAP（XIAP）是哺乳动物中的原型IAP，分别通过其BIR3和linker-BIR2结构域与caspases-9和-3结合并有效抑制其活性，进而可能通过26S蛋白酶体催化caspases的泛素化和周转(Salvesen和Duckett，2002年).

相比之下，在苍蝇中，先前的研究表明MOMP不会发生，细胞色素c（c）不会因压力而释放到胞浆中(瓦尔基等, 1999;齐默尔曼等, 2002;多斯汀等, 2004)尽管存在促凋亡（Debcl/dBorg-1/Drob-1/dBok）和抗凋亡（Buffy/dBorg-2）Bcl-2家族成员(Igaki和Miura，2004年). 此外，Apaf-1同源物，果蝇属据报道，Apaf-1相关杀手（DARK/Hac-1/dApaf）不需要细胞色素c（c）并在细胞中构成活性，在细胞中结合并持续处理启动子caspase DRONC(穆罗等, 2002;齐默尔曼等, 2002;多斯汀等, 2004). 然而，其他报告表明，细胞色素c（c）能够与DARK结合，并且至少在苍蝇的精子细胞个体化和发育凋亡过程中，它是DARK依赖性半胱氨酸蛋白酶激活所必需的(卡努库山等, 1999;阿拉马等2003年,2006;门德斯等, 2006). 因此，在苍蝇中，线粒体蛋白在细胞凋亡中的具体作用仍然存在很大争议(手段等, 2006). 不管怎样，一旦形成，黑暗·DRONC凋亡小体复合体由果蝇属IAP1（DIAP1），通过其BIR2结构域与分离DRONC前体蛋白和大亚基（蛋白酶结构域）的连接子区域结合(迈尔等, 2000;柴等2003年). 有趣的是，DIAP1显然不直接抑制DRONC活性，而是通过泛素化促进其在细胞内的转换(威尔逊等, 2002;柴等2003年).

与其在调节细胞凋亡中的中心作用一致，DIAP1中的突变减少了其与胱天蛋白酶的相互作用，从而增强或诱导细胞凋亡(海伊等, 1995;戈亚尔等, 2000;利斯等, 2000). 此外，一些果蝇属IAP（DIAP）拮抗剂已被发现，包括Reaper（Rpr）、head involution defective（Hid）、Grim和Sickle，它们在转录上上调或翻译后修饰以响应特定的发展线索或应激刺激(Kornbluth和White，2005年). 每一种IAP拮抗剂都具有一个N末端IAP结合基序（IBM），该基序取代DIAP1的活性半胱天冬酶和/或诱导DIAP1自动泛素化，从而诱导细胞凋亡(Kornbluth and White，2005年). 与之形成鲜明对比的是，哺乳动物IAP拮抗剂Smac/DIABLO和Omi/HtrA2在应激诱导的MOMP之前组成性表达并隔离到线粒体膜间空间(杜等, 2000;维尔哈根等, 2000,2001;对冲等, 2001;马丁斯等, 2001;铃木等, 2001). 因此，有理由认为，MOMP可能不需要用于苍蝇的凋亡，因为它们的IAP拮抗剂没有与线粒体隔离。

然而，最近的研究表明，Rpr和Grim含有第二个保守的基序，称为Trp-block或GH3结构域，它介导它们重新定位到线粒体，是高效细胞杀伤所必需的(机翼等, 2001;克拉维利亚等, 2002;奥尔森等2003年). 此外，由于Jafrac2最初定位于内质网（ER），然后在内质网应激期间释放，因此在苍蝇中隔离IAP拮抗剂具有优先性(特内夫等, 2002). 因此，我们试图进一步研究线粒体蛋白在苍蝇细胞凋亡中的假定作用，并在此报告线粒体蛋白的鉴定和表征果蝇属Omi（dOmi）是第一个线粒体隔离的双重IAP拮抗剂和促凋亡丝氨酸蛋白酶。

结果

dOmi是果蝇Omi/HtrA2同源物

的TBLASTN搜索果蝇属序列数据库（FlyBase）使用人类Omi/HtrA2（hOmi；氨基酸1-458）执行。这导致识别出一个假定的奥米-类同源物（基因CG8464），定位于染色体臂3R上的88C3区，包含三个外显子，跨度约1.8 kb，包括一个286-bp 5′-UTR、一个1270-bp编码区和一个92-bp 3′-UTR(图1A). 随后获得全长EST（AT14262），并将整个开放阅读框克隆到昆虫和细菌表达质粒中。的表达式域名证实其编码一个422氨基酸蛋白，分子量约46 kDa（见下文）。dOmi与HtrA家族几个成员的比对显示出显著的同源性，特别是在丝氨酸蛋白酶和PDZ结构域内，其中dOmi-与hOmi的同源性分别为～57和～45%(图1B). 此外，将dOmi序列连接到hOmi结构上，表明整体结构具有显著相似性(图1C; PDB代码1LCY）(锂等, 2002).

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dOmi是HtrA家族成员。(A类)住所包含三个外显子，跨度约1.8 kb，包括一个286-bp 5′-UTR（灰色）、一个1270-bp编码区和一个92-bp 3′-UTR（灰色）。蛋白质序列包含一个N末端MTS、一个丝氨酸蛋白酶域、一个铰链区域和一个PDZ蛋白质相互作用域。(B)将dOmi的编码序列（ClustalW）与人类HtrA1、Omi/HtrA2、HtrA3和细菌DegS进行比对。红色条表示dOmi的两个IBM；红色方框表示HtrA家族所有成员中存在的保守活性位点丝氨酸。(C类)通过将dOmi的一级氨基酸序列连接到人类Omi已解决的晶体结构上，创建了dOmi-的结构模型。dOmi及其丝氨酸蛋白酶（粉红色）和PDZ（灰色）结构域显示为单独的（左侧结构）或与人Omi螺纹连接（绿色，右侧结构）。

dOmi包含一个N末端靶向序列，该序列在线粒体导入过程中被蛋白质分解去除

hOmi是一种I类膜间空间蛋白，它含有一个线粒体靶向序列（MTS），通过线粒体外膜调节其输入，并插入线粒体内膜(图2A). 使用PSORTII程序对dOmi序列的分析表明，dO mi也具有假定的N末端MTS。因此，我们瞬时转染果蝇属S2细胞带有一个C末端，myc标记的dOmi，并通过免疫荧光显微镜检查细胞。正如预测的那样，dOmi-myc和细胞色素c（c）（阳性对照）仅在线粒体中发现，如与线粒体共定位所示®红色(图2B). dOmi-myc转染细胞的免疫印迹显示，dOmi导入线粒体后，在两个位点经历了N末端处理，产生了两个不同的dOmi-片段（～37和～35 kDa）(图2C，车道2）。dOmi的N末端的疏水性图表明存在一个假定的跨膜结构域（氨基酸63–82），可能用于插入线粒体内膜(图2A)-以及与之前描述的hOmi三聚化域高度同源的第二个疏水性补丁（氨基酸100–120）(图1B和​和2D）二维) (锂等, 2002). 因此，我们推测dOmi的裂解可能发生在这两个疏水基序的分离区域。使用SignalP程序预测A处解理的进一步分析79↓AIIQ，我们注意到a的第二个双平面图案92↓ASKM公司(图2D). 由于在这两个位点的切割将分别产生约37和约35 kDa的dOmi片段，我们将每对丙氨酸突变为天冬氨酸，以抑制蛋白水解过程。

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dOmi是一种线粒体蛋白，在膜间隙内的两个位置输入和加工。(A类)dOmi跨线粒体外膜输入和膜间空间（IMS）处理的模型。TOM/TIM23复合物分别位于线粒体外膜和内膜上。(B)将全长Δ79或Δ92-dOmi-myc瞬时转染S2细胞24小时，并用初级抗myc或抗细胞色素染色c（c）（阳性对照）抗体，然后是二级FITC-标记的抗鼠抗体。线粒体定位是通过用Mitotracker染色细胞来确定的®红色(C类)将全长野生型dOmi-myc或各种切割位点突变体转染S2细胞24小时，然后使用抗myc抗体进行免疫印迹。(D类)使用TMHMM Server v.2.0（CBS；丹麦）生成了dOmi的N末端（残基1-150）的疏水性图。内部/外部概率测定表明，残留物82–140位于膜间的同一侧，面向IMS。

正如预期的那样，Ala92和Ala93突变为天冬氨酸几乎完全阻止了35 kDa dOmi片段的形成(图2C，车道4）。类似地，将Ala79和Ala80突变为天冬氨酸可以阻止37kDa dOmi片段的形成；然而，带负电荷的天冬氨酸残基破坏了相邻的跨膜结构域，并在另一个位点引起dOmi的非自然加工（数据未显示）。因此，我们产生了一个A79W/A80W突变体，该突变体保留了假定切割位点的整体疏水性，但由于色氨酸残基的尺寸增加，完全阻止了37kDa-dOmi片段的加工和形成(图2C，车道3）。有趣的是，A79W/A80W突变株在A92↓ASKM位点，这表明dOmi最初被加工成37kDa片段，然后被二次加工成35kDa碎片。由于活性位点丝氨酸突变体S266A未能抑制酶的加工，dOmi似乎没有在任何一个位点发生自催化裂解（数据未显示）。无论如何，所有四个丙氨酸残基（A79W/A80W/A92D/A93D）的突变基本上导致了dOmi的不可清除突变(图2C，车道5）。观察到的轻微裂解产物可能是由dOmi的信号肽蛋白酶复合体对其进行杂乱裂解所致。由于线粒体蛋白的蛋白水解处理通常会导致其MTS残基的去除，我们接下来在S2细胞中表达Δ79和Δ92成熟形式的dOmi-myc（分别对应于37和35kDa片段），并通过荧光显微镜对其进行分析。正如预期的那样，由于dOmi不再与Mitotracker共定位，从dOmi-中去除这些N末端残基阻止了其进入线粒体®红色，但仍存在于细胞质中(图2B).

成熟dOmi含有两个IBMs，在苍蝇中受发育调控

从hOmi中蛋白水解去除MTS不仅可以从其线粒体膜锚中释放酶(图2A)，但也暴露了与XIAP交互所需的神秘IBM(对冲等, 2001;马丁斯等, 2001;铃木等, 2001;维尔哈根等, 2001). 轶事报道表明，hOmi的同源物不包含IBMs，主要是因为hOmi的AVPS基序在其他物种中不保守，包括果蝇属(图1B). 然而，dOmi在两个不同的双丙氨酸基序上经历了分裂，这一事实增加了它可能包含功能性IBM的可能性。事实上，Δ79-dOmi包含一个N末端AIIQ基序，与已知IAP拮抗剂Grim和Sickle观察到的类似，和Δ92-dOmi包含一个ASKM基序，该基序具有必需的N-末端丙氨酸，以及P中的首选疏水残基4位置(图3A). 因此，我们执行了在体外使用高纯度GST-DIAP1和重组Δ79-dOmi或Δ92-dOmi.进行下拉分析。如所示图3BDIAP1结合了dOmi的每一种裂解形式（3、5、9和11道），但当相应的IBMs（AIIQ和ASKM）被移除时（4道和6道），或当前两个氨基酸突变为甘氨酸时（10道和12道），DIAP1未能结合。因此，从dOmi中去除MTS的蛋白水解酶导致形成两个片段，这两个片段都具有能够与DIAP1结合的N末端IBMs。

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成熟dOmi通过两个不同的IBMs结合DIAP1，并受发育调控体内. (A类)Δ79-dOmi和Δ92-dO mi中的IBM与已知的IAP拮抗剂在果蝇属（收割者、冷酷、隐藏、镰刀、Jafrac2）和人类（Δ133-hOmi，Δ55-Smac）。(B)GST-DIAP1下拉分析使用重组Δ79-dOmi和Δ92-dOmi及其相应的IBM截断（ΔAIIQ公司, ΔASKM公司)或点突变体(GGIQ、GGKM)分别是。每个dOmi蛋白也包含一个活性位点突变（S266A）。分离的蛋白质复合物通过SDS-PAGE分离，凝胶用考马斯蓝染色。(C类)从苍蝇胚胎（12 h）裂解物中分离亚细胞组分，并与GST-DIAP1孵育。然后使用针对重组dOmi的兔多克隆抗体，清洗每个组分的DIAP1复合物并免疫印迹内源性dOmi。每个组分也进行了细胞色素免疫印迹c（c）、层粘连蛋白C、BiP和α-微管蛋白，以验证组分的纯度。(D类)对胚胎（12小时）、幼虫（2龄）、蛹和成虫的裂解物进行细胞色素免疫印迹c（c）和内源性dOmi（如面板C所述）。在每个发育阶段也分离出总RNA，并对其进行RT-PCR域名和肌动蛋白（内部控制）。

为了验证内源性dOmi的加工发生在线粒体内并导致苍蝇产生IAP拮抗剂，我们制备了野生型胚胎（12 h）的裂解物，并使用各种亚细胞组分进行了DIAP1下拉分析。然后用抗重组Δ79-dOmi的兔多克隆抗体对DIAP1沉淀物进行免疫印迹。正如预期的那样，DIAP1结合的dOmi片段仅从线粒体部分分离(图3C). 然后，我们从胚胎（12小时）、幼虫（二龄）、蛹和成虫以及S2细胞中制备裂解物，并再次使用GST-DIAP1进行下拉分析(补充方法). 有趣的是，我们发现dOmi的表达随果蝇的发育阶段而波动。dOmi的表达水平最初在胚胎中较高，但在幼虫和蛹期下降，但在成虫中反弹(图3D). 观察到的dOmi表达的变化不能用线粒体总密度的差异来解释，因为细胞色素c（c）只有成虫体内的含量增加(图3D). 我们对从每个组织样本中分离的总RNA进行了RT-PCR，并相应地观察到域名幼虫和蛹中的表达都略有减少(图3D). 目前尚不清楚为什么dOmi表达水平在发育过程中会发生变化，或者额外的翻译后修饰（例如泛素化）是否也会提高其周转率。

成熟dOmi在凋亡过程中通过caspase依赖和独立机制从线粒体释放

如前所述，线粒体在苍蝇细胞凋亡中的作用仍存在很大争议，部分原因是之前的一些报告表明线粒体不经历外膜渗透，细胞色素c（c）激活DARK不需要·DRONC凋亡小体复合物(瓦尔基等, 1999;齐默尔曼等, 2002;多斯汀等, 2004). 因此，为了确定细胞色素c（c）S2细胞在凋亡过程中从线粒体释放，我们用普通丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂staurosporine（STS）处理S2细胞或将其暴露于DNA损伤的UVB照射下。在每种情况下，我们都观察到细胞色素的释放c（c）线粒体膜电位（Δψ）的损失米)效应器caspase DEVDase活性增加，DNA片段化（Sub-G1峰）(图4A和B). 同样，在转染全长dOmi-myc的细胞中，STS和UVB照射也刺激了Δ79-dOmi和Δ92-dOmi-以及细胞色素的释放c（c）(图4C)成熟的dOmi一旦进入胞浆，就会增强效应器caspase DEVDase的活性(图4D). 相应地，在功能丧失实验中，RNA干扰导致的dOmi缺失延迟了caspase的激活(图4E).

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STS和UVB辐射在S2细胞中诱导caspase依赖性和非依赖性MOMP。在存在或不存在胰蛋白酶抑制剂Z-VAD-fmk（50μM）的情况下，将S2细胞暴露于STS（1μM）或UVB照射（在紫外线透照仪上照射5分钟）。(A类,B)随后检测细胞Δψm（JC-1染色）和DNA片段（Sub-G1峰）。此外，制备细胞溶质组分并进行细胞色素免疫印迹c（c）并测定效应胱天蛋白酶DEVDase活性。(C类,D类)同样，用全长dOmi转染细胞，暴露于STS或UVB照射下，并检测细胞色素的线粒体释放c（c）和dOmi进入胞浆，以及效应caspase DEVDase活性。(E类)S2电池（0.3×106)用对照品或域名dsRNA（40 nM）3天，暴露于STS（1μM）中4–12小时，然后检测效应半胱天冬酶DEVDase活性。为了证实RNA干扰的敲除程度，通过RT–PCR和蛋白质印迹测定dOmi mRNA和蛋白质表达水平（插图）。

有趣的是，用胰蛋白酶抑制剂苄氧羰基-Val-Ala-Asp-（OMe）氟甲基酮（Z-VAD-fmk）预处理细胞可抑制UVB照射细胞中的所有上述事件，包括细胞色素的释放c（c）和dOmi，但在STS处理的细胞中没有这样做(图4A-C). 因此，根据促凋亡刺激，细胞色素c（c）和dOmi通过半胱天冬酶依赖和非依赖机制从线粒体释放，其确切细节尚待阐明。值得注意的是，紫外线照射选择性地诱导早期胚胎中DARK的表达(周和斯特勒，2003). 因此，在这种情况下，MOMP可能需要DRONC或其下游目标DrICE或DCP-1。

成熟的dOmi主要通过其丝氨酸蛋白酶活性诱导S2细胞和发育中的蝇眼的细胞死亡

尽管dOmi在细胞凋亡过程中从线粒体中释放出来，但胞质dOmi-如何诱导细胞凋亡尚不清楚果蝇属细胞。因此，我们在S2细胞的细胞质中表达成熟的Δ79-dOmi或Δ92-dOmi(图2B)发现这两种形式在48小时内均可诱导约40%的细胞死亡(图5A，WT与Vec Ctrl）。然而，有趣的是，IBM变种了Δ79-dOmiGGIQ公司和Δ92-dOmiGGKM公司触发了与野生型dOmi相似的细胞死亡水平(图5AWT与IBM Mt），尽管他们无法绑定DIAP1(图3B). 此外，dOmi催化丝氨酸的突变降低了细胞死亡(图5A与S266A相比，WT），而去除其调控PDZ结构域（可以更容易地进入其活性位点）显著增加了细胞死亡(图1C和​和5A，5A级，WT与ΔPDZ）。因此，dOmi的丝氨酸蛋白酶活性似乎是导致S2细胞死亡的主要原因。Z-VAD-fmk预处理细胞可部分抑制dOmi催化活性形式（WT、ΔPDZ、IBM Mt）诱导的细胞死亡(图5A)表明dOmi的蛋白水解活性可以促进caspase的激活并诱导caspase依赖的凋亡。然而，dOmi与哺乳动物的对应物一样，也诱导了caspase非依赖性细胞死亡(对冲等, 2001).

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成熟的dOmi诱导S2细胞和发育中的苍蝇眼的细胞死亡。(A类)S2细胞与EGFP和野生型dOmi的表达质粒共转染（Δ79多米, Δ92天)或各种IBM变种（Δ79多米GGIQ公司, Δ92天千兆公里)，催化失活突变体（Δ79多米S266A型Δ92天第266页)，或PDZ截断突变体（Δ79多米Δ浦东新区, Δ92天Δ浦东新区). 通过添加CuSO，所有dOmi结构体在金属硫蛋白启动子的控制下表达4在有无Z-VAD-fmk（50μM）的情况下，将（0.7 mM）添加到培养基中。通过测定GFP的百分比来评估细胞死亡+在24和48小时时，细胞仍然存在。为了进行统计分析，进行了方差分析，以及Student–Newman–Keuls事后（post-hoc）分析（StatView软件）：*与Vec Ctrl显著不同(P（P）<0.05); #, 与未经Z-VAD-fmk处理的细胞显著不同(P（P）<0.05）。(B）Δ79-dOmi的表达导致表型变化，从一些品系的早期蛹致死到其他品系的轻度、轻微的眼睛粗糙（如图所示：GMR-gal4/+；UAS-Δ79-dOmi7B). Δ92-dOmi的表达导致持续更强的表型，从一些品系的早期蛹致死到其他品系的无眼苍蝇（如图所示：GMR-gal4/+；Δ92-dOmi5A/+). 杆状病毒半胱天冬酶抑制剂p35的共表达未能显著抑制Δ79-dOmi或Δ92-dOmi诱导的细胞死亡（如图所示：GMR-gal4/UAS-p35；Δ92-dOmi5A/+)，且催化失活dOmi突变体的表达未能诱导细胞死亡（如图所示：GMR-gal4/+；UAS-Δ79-dOmiS266A4A和GMR-gal4/+；UAS-Δ92-dOmiS266A42A). (C类)转基因系与GMR-gal4杂交，并根据以下量表进行表型评分：0，无表型；1、一些有活力的晚期色素细胞死亡；2、一些可行的、适度的眼睛缩小；3、一些活的，没有眼睛或眼睛很小；4、成虫期致死；5，蛹早期致死。对9个独立品系进行Δ92-dOmi评分，对7个品系进行了Δ79-dOmi打分，每个品系至少进行了两次测试，产生了至少10只具有相同表型的苍蝇。Δ92-dOmi的表达持续导致更严重的表型(P（P）<0.02，学生t吨-测试）。

为了确定dOmi是否能诱导发育中的苍蝇眼的细胞死亡，我们培育了表达野生型Δ79-dOmi的转基因苍蝇(GMR-加仑4;UAS域Δ79重量7B)，Δ92 dOmi(GMR-加仑4;UAS域Δ92重量5A)或其无催化活性的S266A突变体(GMR-加仑4;UAS-dOmi公司Δ79S266A4A型和GMR-加仑4;UAS-dOmi公司Δ92S266A42A型). 有趣的是，与对照苍蝇相比，Δ79-dOmi和Δ92-dOmi的表达导致了从蛹期的有机体致死到眼睛粗糙的表型(图5B和C). Δ92-dOmi的作用始终强于Δ79-dOmi(图5C)但正如之前在S2细胞中观察到的那样，催化失活S266A dOmi突变体的表达并没有导致任何表型(图5B). 与Z-VAD-fmk在S2细胞中的作用相反，杆状病毒半胱天冬酶抑制剂p35的表达并不抑制Δ79-dOmi或Δ92-dOmi-诱导的细胞死亡(图5B，数据未显示）。然而，苍蝇眼睛中dOmi的GMR驱动表达持续了约5-6天，从第三幼虫龄的感光细胞分化开始，一直持续到蛹发育，而S2细胞中dOmi表达的影响在1-2天后进行了检测。因此，dOmi可以通过其丝氨酸蛋白酶活性促进caspase依赖性凋亡，但长期来看不需要caspase活性来诱导细胞死亡。

dOmi中的IBMs选择性地与DIAP1中的BIR2域相互作用，并取代引发剂caspase DRONC

据报道，Rpr、Hid、Grim、Sickle和Jafrac2均通过与DIAP1中BIR1结构域的效应caspase DrICE和/或BIR2结构域的启动子caspase DRONC相互作用并取代其，诱导苍蝇凋亡(柴等2003年;扎查里奥等2003年;雁鸣声等, 2004). 因此，由于dOmi以IBM-依赖的方式与DIAP1明确绑定(图3B)令人惊讶的是，仅这种相互作用未能在S2细胞或发育中的苍蝇眼中诱导大量凋亡(图5A，S266A与Vec控制，图5B). 为了解决这个难题，我们试图进一步描述dOmi与DIAP1的相互作用，以及它在促进caspase激活中的作用。我们首先将各种DIAP1截短突变体表达为GST融合蛋白，随后使用幼稚的S2细胞裂解物进行下拉测定(图6A和B). 重要的是，DIAP1中的BIR2结构域被发现对结合内源性dOmi的两种加工形式至关重要，而BIR1和RING结构域都不是必需的(图6B).

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成熟dOmi不与DIAP1中的BIR1结构域结合或取代效应器caspase DrICE。(A、 B类)GST-DIAP1和截短突变体在细菌中表达并纯化至同质性。然后使用GSH–Sepharose珠捕获蛋白质（500 nM），并用原始S2细胞裂解物（100μg）孵育（4°C下3小时），最终体积为300μl。随后分离珠复合物，通过SDS–PAGE分离，并使用兔抗dOmi多克隆抗体进行免疫印迹。(C类,D类)将重组DrICE（175 nM）与GST-BIR1（抑制剂，3.5μM）在25°C下预培养30分钟。然后单独添加人PARP（底物，5.75μM），或与重组Δ79-dOmi、Δ92-dOmi-或IBM截断突变体（ΔAIIQ公司, ΔASKM公司)（4.5μM），并在25°C下进一步孵育60分钟。Δ79-IBM肽和阳性对照物Rpr-IBM肽类（5μg）也在单独的培养中进行了测试。所有蛋白复合物用SDS-PAGE分离，凝胶用考马斯蓝染色。(E类)Δ79-IBM绑定到DIAP1-BIR1的结构模型。

鉴于dOmi未能结合BIR1，我们预测它将无法对抗依赖BIR1的DrICE抑制。为了提供明确的证据，我们单独或在GST-BIR1存在下，将重组DrICE与其底物PARP孵育。大致如此集成电路50，GST-BIR1抑制DrICE介导的PARP断裂约50%(图6C和D，车道1-3）。正如预期的那样，这种抑制作用很容易被Rpr肽克服，与它的N末端IBM（Rpr-IBM；AVAFYIPD）相匹配，但没有被对照肽克服（MKSDFYFQ）(图6D，车道4和6）。然而，更重要的是，无论是重组Δ79-dOmi、Δ92-dOmi还是它们的IBM截断突变体（ΔAIIQ或ΔASKM），都没有促进依赖于DrICE的PARP裂解(图6C，车道4-7）。此外，与Rpr-IBM不同，Δ79-dOmi的IBM肽（AIIQREDL）也未能对抗依赖BIR1的DrICE抑制(图6D，车道4和5）。为了确定dOmi无法取代DrICE的原因，我们使用之前求解的绑定到Rpr-IBM的BIR1的晶体结构（PDB代码1SDZ；雁鸣声等, 2004). 如所示图6EdOmi中的Arg5似乎与BIR1口袋底部的Glu86发生了空间碰撞，从而阻止了Δ79-dOmi与BIR1.形成稳定的络合物。

由于成熟dOmi绑定到DIAP1中的BIR2域(图6B)，我们预测dOmi可能会取代BIR2结合囊中的启动子caspase DRONC。因此，我们将GST-BIR2-RING与DRONC（1–139）的N末端片段孵育，并观察到BIR2-RING的形成·DRONC综合体(图7A，车道1和10），与之前的报告一致(柴等2003年). 正如预期的那样，向孵育混合物中添加Δ79-dOmi或Δ92-dOmi会导致DRONC从复合物中浓度依赖性位移(图7A，车道2-5和11-14），与Δ92-dOmi相比，Δ79-dO mi对BIR2-RIG的亲和力更高(K（K）d日～0.27μM与～1.18μM）(图7C). 相比之下，IBM截断突变体（ΔAIIQ或ΔASKM）均未与BIR2-RING结合或取代DRONC(图7A6–9和15–18车道）。在其他实验中，Rpr-IBM肽也将DRONC从BIR2结合囊中移除(图7B)，与Hid-IBM的亲和力相似(K（K）d日～0.036μM与0.041μM）(图7C) (吴等, 2001). 因此，在我们的分析中，在取代DRONC时，Rpr的效力是Δ79-dOmi的约7倍(图7C). 尽管如此，Δ79dOmi对DIAP1-BIR2的亲和力比DRNC的亲和力高出约3倍(图7C) (柴等2003年). 此外，通过比较，Δ79-dOmi对DIAP1-BIR2的亲和力高于Smac与XIAP-BIR3的亲和力(线路接口单元等, 2000)考虑到DRONC和caspase-9对其各自的IAP表现出几乎相同的结合亲和力，这一点很有说服力(图7C).

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成熟dOmi选择性地结合到DIAP1中的BIR2结构域，并取代启动子caspase DRONC。(A类,B)GST-BIR2-RING（3μM）与DRONC（6μM）的N末端片段在没有或存在Rpr-IBM肽（0-4μM）、重组Δ79-dOmi、Δ92-dOmi或其相应的IBM突变体（ΔAIIQ公司, ΔASKM公司)（2-16μM）。dOmi蛋白还包含一个活性位点突变（S266A），以确保dOmi's蛋白水解活性不会干扰DRONC的置换。绘制位移曲线以确定欧盟委员会50每个Rpr-IBM肽和dOmi蛋白的值。然后用SDS-PAGE分离所有蛋白复合物，并用考马斯蓝染色凝胶。(C类)特定苍蝇和哺乳动物IAP拮抗剂和启动子半胱天冬酶与其各自IAP的离解常数的比较。(D类)Δ79-IBM绑定到DIAP1-BIR2的结构模型。

随后，通过建模研究，利用与Hid-IBM（PDB代码1JD6）结合的BIR2的晶体结构，揭示了BIR2对BIR1的Δ79-dOmi选择性的原因(吴等, 2001) (图7D). 事实上，Δ79-dOmi中的Arg5与BIR1中的Glu86之间观察到的空间位阻冲突(图6D)在BIR2模型中不存在，因为Glu86被类似位置的甘氨酸取代（Gly269）(图7D). 在BIR2中，Arg5似乎与Arg260和Arg262表现出一定的电斥力，因此可能解释了与Rpr和Hid相比，BIR2的Δ79-dOmi亲和力降低的原因(图7C和D). 总的来说，生化和结构数据表明，Δ79-dOmi可以选择性地将DRONC从DIAP1的BIR2结构域中置换出来。然而，这种相互作用本身并不足以诱导显著水平的细胞死亡，这可能是因为BIR1结构域保留了抑制效应半胱天冬酶DrICE的能力。事实上，我们之前已经在人类细胞中表明，XIAP中的连接子BIR2结构域可以抑制效应caspase-3并防止细胞死亡，即使其BIR3结构域中的突变阻止了启动子caspase-9的抑制(布拉顿等, 2002).

dOmi通过蛋白水解降解DIAP1减轻DIAP1对半胱氨酸蛋白酶的抑制

尽管野生型dOmi通过其丝氨酸蛋白酶活性明显诱导S2细胞和发育中的苍蝇眼的细胞死亡，但仍不清楚这是如何导致半胱氨酸蛋白酶激活的。hOmi蛋白水解降解哺乳动物细胞中的某些IAP，包括cIAP1、cIAP2和Bruce/Apollon(金等2003年;杨等2003年)增加了dOmi可能通过降解DIAP1间接增加caspase活性的可能性，至少部分是这样。因此，我们研究了dOmi对S2细胞中DIAP1表达水平的影响。如所示图8A，当与野生型Δ79dOmi、Δ92dOmi或IBM突变体共表达时，DIAP1在细胞中基本上不存在（泳道2、4、5和7），而在共表达催化失活的S266A突变体的细胞中很容易检测到DIAP1（泳道3和6）。因此，dOmi的蛋白水解活性负责调节DIAP1中的缺失，而不依赖于其IBMs。我们接下来用DIAP1（转染S2细胞的免疫沉淀）培养重组dOmi-，发现Δ79-dOmi和Δ92-dOmi-以浓度依赖的方式直接降解DIAP1(图8B). 然而，由于HA标签的蛋白水解去除，很难看到许多DIAP1片段。因此，我们重复了我们的在体外通过将重组dOmi与GST-DIAP1（首先纯化，然后生物素化）孵育，进行卵裂试验。在这些条件下，dOmi再次通过蛋白质水解将DIAP1加工成许多片段，这些片段很容易用链霉亲和素HRP进行印迹(图8C).

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dOmi蛋白水解降解DIAP1。(A类)用pIE1-HA-DIAP1和pRmHa3-Omi（Δ79多米, Δ92天)dOmi（Δ79多米S266A型, Δ92天S266A型)或dOmi（Δ79多米GGIQ公司, Δ92天GGKM公司). 在添加CuSO4（0.7 mM）以诱导dOmi及其突变体的表达后，对全细胞裂解物进行DIAP1和dOmi表达水平的免疫印迹。(B)HA-DIAP1在S2细胞中表达，并使用抗HA抗体（262K，Cell Signaling）进行免疫沉淀。然后将免疫沉淀物与野生型Δ79-dOmi或Δ92-dOmi（50-200 nM）在37°C下孵育2 h，然后进行HA-DIAP1免疫印迹。(C类)生物素化GST-DIAP1（250 ng）与重组Δ79-dOmi或Δ92-dOmi（50-200 nM）在37°C下孵育2 h，总体积为30μl，然后用链霉亲和素-HRP进行印迹。

如前所述，最近的一些研究表明，苍蝇中的其他IAP拮抗剂可能刺激DIAP1的自动泛素化，并将DIAP1靶向26S蛋白酶体的破坏(海斯等, 2002;霍利等, 2002;Ryoo公司等, 2002;机翼等, 2002;哟等, 2002). 另一方面，dOmi似乎没有诱导DIAP1自身泛素化，因为Δ79-dOmiS266A型或Δ92-dOmiS266A型在S2细胞中共表达时诱导DIAP1缺失(图8A，车道1、3和6）。此外，在随后在体外使用苍蝇胚胎裂解物（既不是重组dOmi，也不是Δ79-IBM肽）进行的分析增强（或抑制）了DIAP1自泛素化的基础水平（数据未显示）。因此，dOmi促进了caspase活性和细胞死亡，至少部分是通过清除细胞中的DIAP1。然而，dOmi完成了这一壮举，不是通过刺激DIAP1自身泛素化，而是通过直接降解DIAP1。

讨论

线粒体在苍蝇细胞凋亡中的作用仍然存在很大争议，这在很大程度上是因为线粒体在应激后Δψm和MOMP是否会丢失方面存在分歧(卡努库山等, 1999;齐默尔曼等, 2002;多斯汀等, 2004;塞努·马苏达等, 2005). 此外，尽管线粒体释放细胞色素c（c）哺乳动物细胞中Apaf-1凋亡小体复合体的形成和caspase的激活(凯恩等, 2002)，对细胞色素的重要性存在分歧c（c）促进苍蝇细胞死亡(齐默尔曼等, 2002;阿拉马等2003年,2006;多斯汀等, 2004;门德斯等, 2006). 细胞色素c（c）尽管存在争议，但哺乳动物中还有其他线粒体蛋白在促进细胞凋亡方面发挥作用，包括双重IAP拮抗剂和丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2(对冲等, 2001;马丁斯等, 2001;铃木等, 2001;维尔哈根等, 2001). 在我们的研究中，我们开始确定果蝇属Omi的同源物也可能参与细胞死亡。我们发现dOmi与hOmi高度同源，特别是在丝氨酸蛋白酶域内，其表达受到发育调控。dOmi被导入苍蝇线粒体并加工就地dOmi的成熟形式在胁迫后通过半胱天冬酶依赖和非依赖过程释放到细胞质中。然而，一旦进入胞浆，dOmi主要通过DIAP1和可能的其他底物的蛋白水解降解，在S2细胞和发育中的蝇眼中诱导细胞死亡。

实际上，催化活性Δ79-dOmiS266A型和Δ92-dOmiS266A型由于两种形式的dOmi都选择性地结合到DIAP1中的BIR2结构域并取代启动子caspase DRONC，因此未能诱导显著的凋亡，这有点令人惊讶。特别是，Δ79-dOmi对BIR2的亲和力(K（K）d日～0.27μM）低于Rpr-IBM的观察值(K（K）d日～0.036μM），但略高于具有XIAP-BIR3的成熟Smac的观察值(K（K）d日～0.42μM）(线路接口单元等, 2000;吴等, 2001). 那么为什么dOmi需要其蛋白水解活性来诱导细胞死亡，而不是诱导快速的IBM-依赖性凋亡？值得注意的是，与其他表现出对BIR1或BIR2结构域的部分偏好的苍蝇IAP拮抗剂不同，dOmi完全无法结合DIAP1中的BIR1结构域，并且没有取代活性效应器caspase DrICE。因此，DIAP1对DrICE的持续抑制可能足以抑制细胞死亡。哺乳动物中出现这种情况是有优先权的，因为我们之前已经证明，不能结合和抑制caspase-9的XIAP突变体仍然可以通过单独抑制caspase-3来阻止细胞凋亡(布拉顿等, 2002).

苍蝇和哺乳动物IAP拮抗剂之间的主要区别之一与它们独立诱导细胞凋亡的能力有关。事实上，Rpr、Hid和Grim在培养细胞和苍蝇中都能诱导强烈的细胞死亡(Kornbluth and White，2005年)而哺乳动物细胞细胞质中成熟Smac的过度表达在缺乏伴随的产生刺激的情况下通常无法诱导凋亡(杜等, 2000;克里格等, 2004). 对这些结果的潜在解释可能涉及到它们与IAP结合后诱导环依赖性自身泛素化的相对能力。事实上，尽管苍蝇中的许多IAP拮抗剂诱导DIAP1自身泛素化，但Smac似乎抑制了XIAP自身泛素化(克里格等, 2004). 在我们的研究中，dOmi未能诱导或抑制DIAP1与BIR2结构域结合后的自身泛素化。因此，在缺乏dOmi蛋白水解活性的情况下，DIAP1可能再次通过其BIR1结构域自由维持其对DrICE的抑制。相比之下，鉴于DIAP1可以通过靶向活性DRONC进行蛋白质体降解来保护细胞(威尔逊等, 2002)DIAP1也可能通过促进dOmi的周转来调节细胞死亡。Hay及其同事此前曾报道，当DIAP1结合突变体DRONC（F118E）在发育中的蝇眼中表达时，其诱导的细胞死亡明显多于野生型DRONC(柴等2003年)相应地，我们发现Δ92-dOmi根据其对DIAP1的相对亲和力持续产生比Δ79-dOmi-更严重的表型。

其他人则认为，与Apaf-1相比，哺乳动物和苍蝇IAP拮抗剂之间存在着这样的差异·caspase-9凋亡小体复合物·DRONC凋亡小体复合体具有组成活性。因此，DIAP1需要持续泛素化DRONC并介导其周转，以防止细胞死亡(穆罗等, 2002). 在该模型中，Rpr、Hid或Grim只需取代该活性DRONC，即可促进效应半胱天冬酶的激活并诱导细胞凋亡。然而，最近的研究表明，至少对Rpr和Grim来说，这些IAP拮抗剂的C末端在促进线粒体损伤和/或抑制蛋白质翻译方面起着重要作用(克拉维利亚等, 2002;霍利等, 2002). Rpr和Grim的这些替代功能可能是首先启动半胱天冬酶激活所必需的，之后，IBMs将取代DIAP1中的这些活性半胱天冬酶。因此，可能是dOmi与DIAP1-BIR2的结合就其本身而言不会诱导细胞凋亡，因为在没有其他刺激的情况下，可能很少有活性的DRONC被取代。无论如何，无论dOmi是仅仅通过其蛋白水解活性诱导细胞杀伤，还是在某些情况下作为一种纯粹的IAP拮抗剂发挥作用，我们的研究表明线粒体在苍蝇细胞凋亡中的作用可能比以前认为的要重要得多。

材料和方法

细菌和苍蝇表达结构

从EST（AT14262；BDGP）中PCR扩增全长和截短的dOmi结构，使用Pfu公司聚合酶（Stratagene），并克隆到pRmHa3-myc(生态RI–巴姆HI）、pUAS(生态RI–Xho公司一） ，或pET21b(Nde公司I–Xho公司一、 Novagen）表达载体果蝇属S2细胞、苍蝇和大肠杆菌菌株BL21（DE3）。通过定点突变（QuikChange）引入活性位点（S266A）、IBM和裂解位点突变®斯特拉赫纳）。同样，从EST（LD28292和GH24292；BDGP）中PCR扩增出苍蝇半胱天冬酶DRONC（残基1–139）和全长DrICE，并克隆到Nde公司I–Xho公司我和Nco公司I–Xho公司分别为pET21b和pET28b的I位点。通过SOE-PCR使用EST生成全长DIAP1(L49440号)和a线构造（由Colin S Duckett博士善意提供）。然后PCR扩增DIAP1和各种截短片段并克隆到pIE1-HA中(巴姆你好——不是一、 Novagen）或pGEX-4T-1(生态RI–不是一、 Pharmacia）载体在S2细胞和大肠杆菌分别是。

细胞培养、转染和细胞死亡分析

果蝇属S2细胞在28°C下在补充有谷氨酰胺（20mM，Invitrogen）的HyQ SFX昆虫培养基（Hyclone）中常规培养。对于转染，～3×106用pRmHa3-myc质粒DNA（1.5–2.0μg）转染细胞（Cellfectin，10μl，Invitrogen），该质粒DNA编码野生型、截短型或突变型Δ79-dOmi或Δ92-dOmi蛋白。对于细胞死亡实验，细胞也被pPAC-3-GFP（0.5μg）共转染，然后在转染后24小时分裂成多孔板12。然后用CuSO诱导蛋白质表达4（0.7 mM），存在或不存在Z-VAD-fmk（50μM，Biomol）。通过流式细胞术（Beckman-Coulter FC500；λ前任/λ相对长度单位=488/525 nm），通过量化完整GFP的百分比+诱导与未诱导细胞群中的细胞（即[1−（GFP+诱发的/GFP公司+未引入的)] × 100). 用小鼠抗myc抗体（9B11，细胞信号转导）进行Western blotting，确认dOmi和各种突变体的表达水平。

果蝇遗传学

转基因苍蝇是由马萨诸塞州总医院皮肤生物研究中心的转基因苍蝇核心设施产生的。UAS-Δ79-dOmi的7个品系和UAS-△92-dOmi-的9个品系与GMR-gal4杂交，并在25°C下对致死性和眼部表型进行评分。对p35的抑制进行评分，基因型的苍蝇UAS-p35/GMR-gal4；UAS-dOmi/TM6B与相比SM1/GMR-gal4；UAS-dOmi/TM6B.

补充材料

补充方法

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致谢

我们感谢Janice Fischer博士的有益建议，感谢John Sisson博士的飞行胚胎和BiP抗体，感谢Hung-wen Liu教授和Tao Zhihua Tao教授的重组PARP。这项工作得到了得克萨斯大学奥斯汀分校的启动资金、美国癌症协会的拨款（RSG-05-029-01-CCG）和美国制药研究与制造商基金会的研究启动拨款（全部给SBB）的部分支持；BP得到了马萨诸塞州生物医学研究委员会托斯特森博士后奖学金的支持，KW部分得到了NIH拨款GM55568的支持。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团