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单元格元数据。作者手稿；PMC 2007年7月2日发布。
以最终编辑形式发布为：
单元格元数据。2006年7月；4(1): 13–24.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cmet.2006.05.011
预防性维修识别码：项目经理1904486
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院17131
PMID：16814729

氧化代谢和PGC-1β减轻巨噬细胞介导的炎症

Divya桶,1,4 拉塔·穆昆丹,1,4 贾斯汀·奥德加,1,4 张丽娜（Lina Zhang）,1 克里斯蒂·史密斯,1 克里斯汀·莫雷尔,1 大卫·R·格里夫斯,2 彼得·默里,三和阿杰·查拉1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

T辅助细胞（Th）和巨噬细胞之间的复杂相互作用有助于动脉粥样硬化斑块的形成和进展。虽然Th1细胞因子促进损伤巨噬细胞的炎症激活，但Th2细胞因子可减轻巨噬细胞介导的炎症并增强其修复功能。尽管Th2细胞因子具有生物学重要性，但其如何促进抗炎巨噬细胞成熟的生化和分子基础尚不清楚。我们在这里表明，作为对白细胞介素-4（IL-4）的响应，信号转导子和转录激活子6（STAT6）和PPARγ-辅激活子-1β（PGC-1β）诱导巨噬细胞程序进行脂肪酸氧化和线粒体生物生成。PGC-1β的转基因表达启动巨噬细胞的选择性激活，并强烈抑制促炎细胞因子的产生，而抑制氧化代谢或RNAi介导的PGC-1α的敲除可减弱这种免疫反应。这些数据阐明了线粒体氧化代谢与巨噬细胞激活的抗炎程序直接相关的分子途径，表明代谢疗法在治疗动脉粥样硬化性炎症中的潜在作用。

介绍

动脉粥样硬化是西方社会冠状动脉疾病死亡的主要原因(汉森，2005年). 虽然最初认为动脉粥样硬化是一种由血管壁脂质沉积引起的被动性疾病，但现在认为它是一种主动炎症状态，涉及内皮细胞、平滑肌细胞和免疫系统之间的复杂相互作用(Glass和Witztum，2001年;汉森，2005). 在当代观点中，高胆固醇血症、高血压、糖尿病或吸烟导致的内皮功能障碍会在血管壁中引发促炎反应，导致淋巴细胞和巨噬细胞的聚集。如果持续存在，白细胞的流入会促进慢性炎症状态，最终导致临床上显著的狭窄或血栓形成。

动脉粥样硬化斑块的发展和进展取决于促炎因子和抗炎因子之间的平衡(Binder等人，2002年;汉森，2005). 有趣的是，巨噬细胞被招募到受损的内皮细胞中，协调了动脉粥样硬化炎症的发生和消退(Goerdt和Orfanos，1999年;戈登，2003年). 例如，在动脉粥样硬化形成早期，Th1细胞因子干扰素γ（IFNγ）和侵入性脂蛋白促进病变巨噬细胞的经典活化，从而分泌促炎细胞因子、金属蛋白酶和水解酶。这种促炎程序通过清除、降解和清除有害的脂蛋白来保护宿主。然而，如果过度且有增无减，这种炎症反应就会变得有害，并阻碍愈合过程(Goerdt和Orfanos，1999年). 在这种情况下，最近的研究表明，Th2细胞因子白细胞介素-4（IL-4）和IL-13激活STAT6，以促进交替激活的巨噬细胞的成熟，从而抵消过度炎症并促进组织修复(戈登，2003年;Herbert等人，2004年;Rauh等人，2005年;Stout and Suttles，2004年). 这些巨噬细胞可以通过精氨酸酶I的表达来区分，精氨酸蛋白酶I将精氨酸代谢为脯氨酸，导致胶原蛋白生成和纤维化(戈登，2003年;莫瑟，2003). 由于两种精氨酸代谢酶诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶I分别受Th1型和Th2型细胞因子的相互调节，巨噬细胞呼吸爆发的大小和持续时间直接受Th1/Th2平衡的控制(Rauh等人，2005年;Rutschman等人，2001年). 为了支持这一观点，IFNγR/apoE双基因敲除小鼠的动脉粥样硬化病变明显较小，胶原含量显著增加(Gupta等人，1997年)表明Th1信号的丢失使巨噬细胞极化为炎症较少的替代状态。此外，据推测，他汀类药物的Th2偏向效应可能是其抗动脉粥样硬化作用的重要部分(Arnaud等人，2005年;Schonbeck和Libby，2004年). 然而，尽管交替激活的巨噬细胞具有治疗潜力，但对控制其成熟的调节因子和途径知之甚少。

转录辅活化因子PGC-1家族在炎症细胞程序和脂质稳态之间提供了潜在的分子联系(Lin等人，2005a). 虽然最初被确定为氧化代谢的主要调节器(Puigserver等人，1998年)，这些共激活蛋白在其功能上是高度通用的。通过与组织特异性转录因子相互作用，PGC-1蛋白调节各种细胞过程，包括产热、肌纤维类型规范、糖异生、脂肪生成和细胞因子信号传导(Lin等人，2002年,2005年b;Puigserver等人，1998年,2001;Yoon等人，2001年). 例如，促炎细胞因子的分解代谢作用由PGC-1α介导。在这种情况下，Th1型细胞因子刺激肌肉细胞会导致PGC-1α磷酸化和活化，从而增加肌细胞的非耦合呼吸和能量消耗。鉴于PGC-1蛋白具有转录整合细胞因子和脂质信号的能力，我们研究了PGC-1是否也可能调节巨噬细胞激活程序。我们在这里表明，用IL-4刺激巨噬细胞可强烈诱导PGC-1β并上调氧化代谢的基因程序。值得注意的是，PGC-1β协同激活STAT6的转录功能，使巨噬细胞代谢极化至替代状态，从而减弱其炎症爆发。综上所述，这些发现揭示了代谢调节剂控制巨噬细胞活化的新机制，从而为对抗动脉粥样硬化炎症提供了额外的治疗策略。

结果

交替巨噬细胞激活过程中氧化代谢和PGC-1β的诱导

为了研究巨噬细胞激活免疫程序和脂质稳态之间的相互作用，我们使用cDNA微阵列来研究经典（高度炎症）和交替（炎症较少）激活的巨噬细胞的基因表达模式。聚类分析表明，参与脂肪酸氧化的基因在交替激活的巨噬细胞中强烈诱导，但不是典型的激活巨噬细胞(图1A). 值得注意的是，IL-4显著增强了在脂肪酸线粒体氧化中重要的酶的表达，包括酰基辅酶A脱氢酶和烯酰基辅酶A水合酶。Northern blot分析进一步揭示，mRNA编码脂肪酸摄取所必需的蛋白质（LPL，脂蛋白脂肪酶；PPARγ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、转运（CD36，脂肪酸转运蛋白；CPT1，肉碱棕榈酰转移酶I）和氧化（MCAD，中链酰基辅酶A脱氢酶；LCAD，长链酰基辅酶A脱氢酶）同时在炎症较少的交替激活的巨噬细胞中诱导(图1B和图S1A在本文在线提供的补充数据中），从而提供微阵列数据的独立验证。有趣的是，巨噬细胞氧化程序的诱导伴随着PGC-1βmRNA表达的增加(图1B). 免疫印迹分析进一步证实，用IL-4刺激骨髓源性或巯基乙酸合法巨噬细胞可强烈诱导PGC-1β蛋白的表达(图1C). 由于STAT6缺乏的巨噬细胞中没有这些基因表达变化，因此它们可能是IL-4的直接作用。最后，在交替激活的巨噬细胞和经典激活的巨噬细胞之间观察到脂肪酸β-氧化和炎症相关基因的相互调节模式(图1A和第1部分)这表明氧化代谢可能与炎症较少的替代状态有内在联系。

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交替巨噬细胞激活过程中氧化代谢和PGC-1β的诱导

A）交替激活和经典激活期间巨噬细胞基因表达的聚类分析。注意炎症基因的表达与脂肪酸代谢相关基因的表达模式是相互作用的。

B）IL-4以STAT6依赖的方式诱导脂肪酸代谢所需的基因。显示了相对于未处理野生型样品的平均折叠诱导率。

C）IL-4以STAT6依赖方式诱导内源性PGC-1β蛋白。用PGC-1β抗体对来自野生型或STAT6阴性巨噬细胞的75μg总细胞裂解物进行免疫印迹分析。顶部面板：骨髓源性巨噬细胞（BMDM）；底部面板：巯基乙酸（TG）诱导的巨噬细胞。

D–F）替代激活增加了对脂肪酸代谢的依赖，如葡萄糖摄取量(C类)脂肪酸的吸收(D类)，和脂肪酸的β-氧化(E类). *p<0.05，**p<0.005。

为了确定IL-4刺激的巨噬细胞中β-氧化基因表达增加的意义，我们测量了被刺激进行经典或替代激活的巨噬细胞中葡萄糖摄取、脂肪酸摄取和脂肪酸氧化的速率。正如预期的那样，干扰素γ和脂多糖（LPS）对巨噬细胞的经典激活强烈地诱导了约450%的葡萄糖摄取(图1D)同时将脂肪酸的吸收和氧化速率降低约40%(图1E和1F). 相反，交替激活的巨噬细胞对葡萄糖和脂肪酸的摄取增加了约200%(图1D和1E). 重要的是，用IL-4刺激巨噬细胞可将β-氧化速率提高约200%(图1F)表明营养利用的转换伴随着替代性巨噬细胞激活。总之，这些数据清楚地表明，虽然经典活化的巨噬细胞优先利用葡萄糖，但巨噬细胞活化的替代程序转换为脂肪酸氧化以实现能量平衡。

炎症巨噬细胞成熟需要氧化代谢

交替激活巨噬细胞中氧化代谢的诱导表明，它可能与抗炎替代表型的表达密切相关。为了研究这种关系，我们通过药物抑制被刺激进行交替激活的巨噬细胞的线粒体呼吸。依托莫西对脂肪酸氧化的抑制作用(Djouadi等人，1999年)显著降低精氨酸酶活性的诱导(图2A)是抗炎症交替激活巨噬细胞的标志(Goerdt和Orfanos，1999年;戈登，2003年;莫瑟，2003). 同样，寡霉素和FCCP也能抑制氧化磷酸化和解偶联线粒体呼吸(Wu等人，1999年)精氨酸转化为尿素后，精氨酸酶活性分别显著降低(图2A) (Rutschman等人，2001年). 与这种酶活性下降相一致，编码精氨酸酶I和两种内吞受体dectin-1和甘露糖受体的mRNA在IL-4诱导下表现出对氧化代谢的绝对依赖性(图2B) (Munder等人，1999年;Stein等人，1992年;Willment等人，2003年). 这些和其他替代活化标记物的流式细胞术分析(戈登，2003年;Loke和Allison，2003年)进一步支持了这一结论（图S2A-S2C）。此外，由于已知交替激活的巨噬细胞可以抵消过度产生的促炎细胞因子(Goerdt和Orfanos，1999年;戈登，2003年;Herbert等人，2004年)，我们检测了线粒体呼吸抑制是否也可以消除这种反应。事实上，根据IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IL-12的分泌分析，用线粒体抑制剂预处理巨噬细胞可完全消除IL-4的抗炎作用(图2C-2E). 相反，抑制线粒体呼吸对IFNγ和脂多糖对巨噬细胞的炎症激活没有任何显著影响(图2C-2E). 值得注意的是，巨噬细胞与代谢抑制剂的孵育并没有显著改变细胞ATP、钙、STAT6或PGC-1β水平(图2FS2D和S2E）。总之，这些结果为线粒体氧化代谢直接参与抗炎替代表型的充分表达提供了证据，可能独立于STAT6和PGC-1β。

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抗炎交替激活巨噬细胞成熟过程中的氧化代谢需求

A）线粒体呼吸的抑制或解偶联可防止IL-4诱导精氨酸酶活性。

B）线粒体呼吸是表达替代表型所必需的，通过诱导各种mRNA来量化。

C–E）线粒体抑制剂减少IL-4的抗炎作用。在存在或不存在IL-4（5 ng/ml）的情况下，用IFNγ（1 u/ml）/LPS（2.5 ng/ml。ELISA用于定量巨噬细胞分泌的（C）IL-6、（D）IL-12p40和（E）TNF-α。依托莫司；寡、寡霉素**p<0.005。

F）通过PGC-1β的诱导和STAT6的磷酸化测定，经代谢抑制剂治疗的巨噬细胞中IL-4信号完整。

STAT6转录调节巨噬细胞的氧化代谢

虽然IL-4主要通过STAT6蛋白对巨噬细胞发挥免疫作用(伊勒，2001;武田和亚基拉，2000年;Wurster等人，2000年)到目前为止，该转录因子在调控巨噬细胞代谢反应中的作用尚未被研究。巨噬细胞的基因表达分析表明，IL-4未能上调STAT6阴性巨噬细胞中的关键代谢基因，包括CD36、LPL、MCAD、LCAD和PGC-1β(图1B和1C). 为了研究这些代谢基因是否可能是STAT6同型二聚体转录调控的靶点，我们在MCAD启动子近端0.5kb处发现了一个潜在的STAT6反应元件（STAT6RE）。用野生型和STAT6阴性巨噬细胞的核提取物进行凝胶迁移率变化分析，证实其以IL-4依赖的方式与MCAD-STAT6RE结合(图3A). 此外，与过量未标记探针的竞争和抗体超位移分析分别验证了STAT6结合的特异性及其在IL-4诱导的延迟复合物中的存在(图3A) (Ohmori等人，1996年). 为了检测已鉴定的MCAD-STAT6RE是否能够在体内发挥作用，使用含有0.5 kb MCAD启动子的报告构建物进行瞬时转染实验。在瞬时转染的RAW264.7细胞中，IL-4处理导致MCAD启动子的强烈激活(图3B). 此外，STAT6结合位点的突变完全消除了IL-4对该启动子的诱导作用。有趣的是，与STAT6缺乏的巨噬细胞MCAD mRNA的基础表达增加一致(图1B)STAT6RE突变增加了MCAD启动子的基础活性。这些发现表明，除了转录激活基因表达外，STAT6还可能在靶基因抑制中发挥重要作用(Schroder等人，2002年).

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STAT6调节交替激活巨噬细胞的氧化代谢

A）MCAD启动子中STAT6结合位点的鉴定。NRRE，核受体反应元件。用野生型和STAT6阴性巨噬细胞的核提取物进行凝胶迁移率变化分析；SS-STAT6的超频。

B）STAT6同源二聚体对MCAD启动子起反作用。注意，MCAD启动子中STATRE的突变取消了IL-4诱导，但提高了基本启动子活性。

C–E）STAT6缺失影响巨噬细胞的基础代谢流量和IL-4诱导的代谢流量；(C类)脂肪酸摄取(D类)脂肪酸氧化，以及(E类)葡萄糖摄取*p<0.05，**p<0.005。

F和G）IL-4刺激不能增加STAT6中的细胞线粒体含量−/−巨噬细胞，按(F类)MitoFluor绿色和(克)VDAC1、α-ATPase和CytC蛋白水平。β-肌动蛋白的免疫印迹证实了等效负荷。

为了阐明STAT6在氧化代谢中的调节作用，我们测量了野生型和STAT6阴性巨噬细胞对脂肪酸的摄取和利用。与脂肪酸分解代谢mRNA诱导受损相一致，IL-4的刺激并没有显著改变STAT6阴性巨噬细胞的脂肪酸摄取或氧化(图3C和3D). 然而，STAT6缺失的巨噬细胞中脂肪酸氧化的基本速率较高，这可能反映了一种代偿反应，如这些细胞中MCAD mRNA的表达增加所证明的(图3C和3D). 葡萄糖和脂肪酸的平衡代谢（通常是相互作用的）支持细胞能量平衡。由于STAT6缺陷的巨噬细胞对脂肪酸代谢有较高的依赖性，我们推测这可能是对糖酵解流量减少的一种补偿反应。的确，如所示图3ESTAT6缺失的巨噬细胞中，基础和IL-4刺激的葡萄糖摄取率分别降低了约45%和约70%(图3E). 总之，这些结果表明，STAT6是葡萄糖和脂肪酸稳态中基础和IL-4依赖性变化所必需的。

STAT6调节巨噬细胞氧化代谢的能力表明，该转录因子也可能在线粒体生物发生中发挥重要作用。MitoFluor Green染色定量显示，野生型巨噬细胞的替代而非经典激活导致细胞线粒体质量急剧增加(图3F和S3A）。引人注目的是，IL-4未能诱导PGC-1β的表达(图1B和1C)增加STAT6缺陷巨噬细胞的线粒体含量(图3F). 正如预期的那样，STAT6阴性巨噬细胞具有较高的氧化能力，在其基础状态下有更多的线粒体和一些线粒体蛋白的表达增加，包括电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）和ATP合成酶α（α-ATPase）(图3G). 然而，IL-4增强所有三种线粒体蛋白VDAC1、α-ATPase和细胞色素C（CytC）表达的能力在STAT6阴性巨噬细胞中完全消失(图3G)表明IL-4是通过STAT6将巨噬细胞氧化代谢与更大的免疫激活程序耦合的生理触发因子。最后，巨噬细胞氧化代谢的这种代偿性增加并未伴随调节线粒体生物发生的转录因子表达的任何显著变化（图S3B）或辅活化蛋白PGC-1α的异常增加（数据未显示）。

PGC-1β的组成性表达下调巨噬细胞炎症反应

IL-4对PGC-1β的诱导表明，该辅活化因子可能反过来调节STAT6的转录活性，从而直接参与抗炎巨噬细胞的成熟。为了研究这种可能性，我们检测了PGC-1β共激活STAT6响应精氨酸酶I启动子的能力。正如预期的那样，IL-4对潜在STAT6蛋白的激活导致瞬时转染RAW264.7细胞中精氨酸酶I启动子活性增加约2倍(图4A) (Pauleau等人，2004年). 值得注意的是，添加PGC-1β显著增强了精氨酸酶I启动子上的STAT6活性（约为基础水平的8倍，图4A). 位于精氨酸酶I启动子增强子区的STAT6结合位点突变(Pauleau等人，2004年)，完全阻断了STAT6和PGC-1β激活该启动子的能力，表明PGC-1α可能直接与精氨酸酶I启动子上的STAT6相互作用。事实上，在共免疫沉淀分析中，Flag-PGC-1β（f-PGC-1β）存在于与STAT6有效沉淀的可溶性复合物中(图4B). 为了确定精氨酸酶I远端增强子中PGC-1β是否被招募到STAT6RE，我们进行了定量染色质免疫沉淀（ChIP）分析。如所示图4C，用IL-4刺激巨噬细胞导致STAT6和PGC-1β对精氨酸酶I增强子的协同作用增加，表明转录活性STAT6可以在其结合位点附近有效地招募PGC-1α。

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PGC-1β促进抗炎交替激活巨噬细胞的成熟

A）精氨酸酶I启动子上PGC-1β对STAT6的共激活。在PGC-1β存在或不存在的情况下，用野生型精氨酸酶I启动子（Arg I-luc）或STAT6RE突变体（Arg-ΔSTAT6-luc）报告构建体瞬时转染RAW264.7细胞。

B）PGC-1β和STAT6的免疫共沉淀。

C）精氨酸酶启动子的实时ChIP分析。用IL-4刺激巨噬细胞后，STAT6和PGC-1β被招募到精氨酸酶启动子。

D）PGC-1β在替代巨噬细胞激活期间增强精氨酸酶活性。

E和F）PGC-1β的表达减弱巨噬细胞的炎症激活。分泌IL-6的ELISA测定(E类)和IL-12 p40亚单位(F类). *p<0.02，**p<0.005。

PGC-1辅活化剂的一个独特特征是其能够将线粒体生物发生与与氧化代谢增加相关的生物过程耦合起来(Lin等人，2002年,2005年a). 为了研究PGC-1β的组成性表达是否可以类似地将巨噬细胞极化为更氧化的替代状态，我们逆转录将f-PGC-1α引入野生型巨噬细胞（图S4A）。正如预期的那样，f-PGC-1β表达细胞中的脂肪酸氧化率高约160%，这与该辅活化剂的已知代谢作用一致（图S4B）。引人注目的是，f-PGC-1β的组成性表达通过精氨酸酶I增加了IL-4诱导的尿素生成约800%-900%(图4D)这表明PGC-1β确实可以增强巨噬细胞沿炎症替代轴的活化。值得注意的是，f-PGC-1β对精氨酸酶I活性的增强与STAT6总蛋白或磷酸化蛋白水平的变化无关（图S4C）。为了进一步研究PGC-1β启动是否可以减弱巨噬细胞的炎症激活，用LPS攻击对照细胞和f-PGC-1α表达细胞，并用ELISA定量细胞因子分泌。在LPS攻击的巨噬细胞中，f-PGC-1β的表达强烈减少了炎症细胞因子IL-6和IL-12的分泌(图4E和4F). 此外，PGC-1β强烈诱导了交替激活巨噬细胞标记物dectin-1的细胞表面表达（图S4D）。综上所述，这些结果表明，IL-4信号通路和PGC-1β之间的合作对于巨噬细胞极化到氧化程度更高、炎症程度更低的替代状态至关重要。

PGC-1β基因敲除损害替代性巨噬细胞激活

IL-4对PGC-1β的诱导表明，PGC-1α可能是巨噬细胞STAT6功能转录激活所必需的。为了测试这种可能性，我们使用了shRNA，这些shRNA先前被证明在敲低PGC-1β蛋白表达方面具有高度特异性和有效性(Lin等人，2005年b). 如所示图5A，逆转录病毒介导的两种不同shRNA的稳定表达导致巨噬细胞中内源性PGC-1β的敲除率超过80%。正如预期的那样，在PGC-1β敲除细胞中，IL-4促进脂肪酸β氧化的能力降低了35%–52%(图5B). 通过RNAi敲低PGC-1β，精氨酸酶活性降低61%–72%(图5C). 此外，Th2细胞因子IL-4在PGC-1β击倒巨噬细胞中的抗炎作用显著减弱，IL-4不能完全抑制IL-6或IL-12 p40亚单位的释放(图5D和5E). 值得注意的是，在没有IL-4刺激的情况下，对照组和PGC-1β击倒巨噬细胞的炎症激活之间没有显著差异（图S5A和S5B），这表明PGC-1α对替代状态的抗炎功能具有高度的特异性。最后，与氧化代谢抑制剂对替代性巨噬细胞激活的有效抑制相反，PGC-1β敲除的巨噬细胞仍保留一定的替代性激活能力，这可能反映了PGC-1α蛋白或IL-4诱导的氧化代谢增加的残余活性。

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选择性巨噬细胞活化对PGC-1β的需求

A）RNAi逆转录病毒表达对内源性PGC-1β蛋白的敲除。野生型巨噬细胞被表达抗GFP或PGC-1βshRNAs的逆转录病毒载体稳定感染。通过免疫印迹法分析全细胞裂解物的内源性PGC-1β。

B）IL-4中PGC-1β的需求刺激脂肪酸β氧化的增加。

C）对照组和PGC-1β击倒巨噬细胞中的精氨酸酶活性。在测定尿素生产之前，刺激巨噬细胞IL-4（5 ng/ml）24小时。

D和E）PGC-1β在抑制巨噬细胞炎症激活中的作用。在IL-4（2 ng/ml）的存在下，LPS（1 ng/ml）刺激巨噬细胞，并用ELISA定量分泌的细胞因子培养上清液。代表性数据如上所示（n=3）*p<0.05**p<0.004。

PGC-1β转基因小鼠Th1型巨噬细胞炎症减轻

为了研究PGC-1β是否能激发巨噬细胞进入体内炎症较轻的替代状态，我们在人类CD68启动子（一种优先将转基因表达导向巨噬细胞的启动子）的控制下，构建了表达f-PGC-1α的转基因小鼠(图6A) (Gough等人，2001年;Lang等人，2002年). 将两个阳性创始株系进行扩增，以建立Mac-PGC-1β转基因克隆。重要的是，来自转基因动物的巨噬细胞表现出PGC-1β蛋白的强劲表达(图6A). 与CD68启动子的组织特异性一致，我们未能检测到瘦鼠骨骼肌或脂肪组织中Flag-PGC-1β的表达（数据未显示）。此外，对巨噬细胞蛋白质的分析表明，创建者#1表达PGC-1β的水平与IL-4刺激的野生型巨噬细胞相同(图6A). 为了检测PGC-1β的转基因表达是否增强了IL-4驱动的巨噬细胞交替激活程序，我们测量了IL-4刺激后BMDM中精氨酸酶I mRNA和活性水平。如所示图6B和6C来自PGC-1β转基因小鼠的巨噬细胞中精氨酸酶I mRNA的表达和精氨酸活性的诱导显著升高。除了使精氨酸代谢偏向炎症较轻的状态外，PGC-1β蛋白的表达增加导致巨噬细胞介导的炎症减弱，如培养上清液中IL-6和IL-12p40的分泌减少所证明的(图6D和6E). 总之，这些结果表明，PGC-1β可以增强体内巨噬细胞活化的替代程序，并且PGC-1α对STAT6的直接协同活化可能是巨噬细胞免疫反应中这种表型转换的重要部分。

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PGC-1β的转基因表达增强体内巨噬细胞介导的选择性激活和减轻炎症

A）hCD68启动子将PGC-1β转基因表达导向巨噬细胞。通过PGC-1β的免疫印迹分析野生型或Mac-PGC-1β巨噬细胞的裂解物（中间面板）。PGC-1β的表达水平相当于IL-4刺激的野生型巨噬细胞中的水平（右图）。

B）通过Northern blots评估，PGC-1β增强精氨酸酶I mRNA的表达。

C）IL-4（2 ng/ml）刺激24小时后，野生型和Mac-PGC-1β小鼠巨噬细胞精氨酸酶活性增加了一倍。

D和E）PGC-1β转基因表达可减轻巨噬细胞炎症爆发。在用脂多糖（0.5 ng/ml）攻击之前，用IFNγ（1 u/ml）刺激野生型和PGC-1β转基因小鼠的BMDM 20小时。6小时后用ELISA检测细胞因子分泌*p<0.04。

讨论

最近的研究表明，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）控制的糖酵解途径在促进经典活化巨噬细胞的效应器反应中起着关键作用(Cramer等人，2003年). 然而，抗炎症交替激活巨噬细胞成熟的代谢和转录基础基本上仍不清楚。本文提供的数据表明，IL-4对巨噬细胞的选择性激活诱导脂肪酸氧化和线粒体生物发生的细胞途径。除了直接调节脂肪酸β-氧化中重要的基因外，介导IL-4转录反应的STAT6还需要诱导辅激活蛋白PGC-1β。有趣的是，前列腺素C-1β由STAT6诱导并共同激活的前馈回路，放大并维持了交替激活巨噬细胞的代谢、生物生成和抗炎程序。最后，PGC-1β增强巨噬细胞选择性激活程序的能力提供了一个独特的例子，说明免疫反应如何由代谢辅活化剂进行转录调控。

氧化代谢为替代巨噬细胞活化提供燃料

四个独立的证据线支持氧化代谢在启动和阐述炎症较少的替代巨噬细胞表型中的重要性。首先，用IL-4刺激巨噬细胞强烈诱导脂肪酸代谢的整个程序，包括脂肪酸的摄取和氧化以及线粒体的生物生成。其次，通过药物抑制氧化代谢可以有效地抑制交替激活的巨噬细胞的效应器功能，但不是典型的激活巨噬细胞。第三，STAT6是淋巴细胞和巨噬细胞Th2反应的转录调节器，是协调巨噬细胞代谢程序对IL-4反应的主要因素。最后，代谢辅激活蛋白PGC-1β的转基因表达增强了选择性激活，而RNAi对其的敲除则损害了选择性激活巨噬细胞的代谢和抗炎功能。

虽然我们的结果明确证明了STAT6在调节Th2细胞因子IL-4的代谢反应中的需求，但STAT6缺陷的巨噬细胞在氧化代谢中表现出矛盾的增加。例如，STAT6阴性巨噬细胞脂肪酸摄取和氧化的基本速率较高(图3C和3D)可能反映了这些细胞中能量平衡的改变。与这个概念一致，STAT6阴性巨噬细胞的葡萄糖摄取显著降低(图3E). 由于葡萄糖代谢的改变可能影响细胞能量平衡，我们假设能量敏感型AMP-活化蛋白激酶（AMPK）途径的代偿激活或辅活化蛋白PGC-1α的诱导可能是增加对脂肪酸β-氧化依赖性的驱动力(Lin等人，2005a;Ruderman等人，2003年). 然而，尽管多次尝试，我们仍未能检测到野生型和STAT6阴性巨噬细胞在AMPK及其底物乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的表达或磷酸化方面的任何显著差异（数据未显示）。此外，在各种刺激条件下，定量RT-PCR无法检测野生型和STAT6阴性巨噬细胞中PGC-1αmRNA的表达（数据未显示），因此这些途径不太可能是这些巨噬细胞之间观察到的代谢差异的原因。另一种解释可能是，在缺乏IL-4的情况下，STAT6抑制其一部分靶基因，包括那些参与β-氧化的基因。与这一观点一致，MCAD启动子中STAT6结合位点的缺失或巨噬细胞中STAT5蛋白的遗传缺陷导致MCAD启动程序的激活，这反映在MCAD mRNA的高基础启动子活性和表达上(图3B和​和1B）。1B年). 有趣的是，Schroder等人在活化的B细胞中也报告了类似的发现(Schroder等人，2002年). 在他们的研究中，超过50%的差异表达基因在STAT6缺失细胞中被去抑制，这意味着STAT6直接或间接抑制其靶基因的一个子集。需要进行更详细的研究来描述STAT6在葡萄糖和脂肪酸稳态中的激活和抑制功能。

我们的工作提出了一个有趣的问题，即为什么IL-4驱动的生物程序的表达需要氧化代谢。一种可能性是，巨噬细胞向糖酵解或氧化代谢的代谢偏斜是其在宿主防御中发挥关键功能所必需的。例如，Th1型细胞因子IFNγ刺激巨噬细胞增加促炎细胞因子、活性氧和一氧化氮的生成，以安全清除细胞内病原体(戈登，2003年;Stout and Suttles，2004年). 呼吸爆发所需的能量由糖酵解途径快速提供，糖酵化途径由缺氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）转录控制(Cramer等人，2003年). 抑制髓系细胞糖酵解或HIF-1α基因缺失的药理作用可大大降低细胞ATP含量，并降低其抗菌活性(Cramer等人，2003年;Peyssonnaux等人，2005年). 相反，Th2型细胞因子IL-4和IL-13促进替代性巨噬细胞激活，以提供对细胞外寄生虫的防御(Goerdt和Orfanos，1999年;戈登，2003年;Stout and Suttles，2004年). 在这种情况下，STAT6控制长期巨噬细胞激活的遗传程序(武田和亚基拉，2000年;Wurster等人，2000年). 通过增加几丁质酶、趋化因子和胶原蛋白的分泌，这些交替激活的巨噬细胞中和入侵的寄生虫，招募嗜酸性粒细胞，并促进肉芽肿的形成(戈登，2003年). 从强度和持续时间来看，巨噬细胞分泌程序需要大量能量。由于氧化代谢最适合满足巨噬细胞长期激活的生物能量需求，我们的数据表明，IL-4介导的STAT6激活有助于转录偶联代谢途径和这些细胞执行的免疫功能(图7).

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代谢调节剂HIF-1α和Th1型刺激物调节巨噬细胞激活的模型可增加糖酵解代谢，以支持巨噬细胞的促炎症经典激活。相反，对Th2细胞因子IL-4、STAT6和PGC-1β的反应增强了氧化代谢并促进了炎症替代表型的表达。

PGC-1β对巨噬细胞代谢和免疫功能的整合

先前的研究和本文提供的数据表明，STAT6和氧化代谢在促进抗炎交替激活的巨噬细胞成熟方面起着关键作用。然而，这些不同的细胞途径是如何整合到巨噬细胞基因表达的连贯程序中的，目前还没有描述。我们在此报道，辅激活蛋白PGC-1β转录调节交替激活巨噬细胞的发育。一些关键数据支持这一说法。首先，IL-4以STAT6依赖的方式诱导静止和活化巨噬细胞中PGC-1βmRNA和蛋白的表达。其次，PGC-1β的异位表达导致巨噬细胞代谢和功能发生显著变化。将PGC-1β转基因表达至与IL-4诱导的水平相等的水平，可增加巨噬细胞的氧化代谢，并刺激炎症反应较轻的替代状态的蛋白质表达。这可能代表了PGC-1β的生理功能，因为RNAi对PGC-1的敲除会大大降低这些反应。

总之，本文的研究结果大大拓宽了我们对Th2细胞因子如何减轻巨噬细胞介导的炎症的机制性理解，并为PGC-1辅活化蛋白家族成员的细胞过程代谢整合提供了另一个例子。以类似于代谢调节器对肌肉纤维的转化的方式(Lin等人，2002年;Wang等人，2004年)，我们的结果表明，在一个模型中，代谢途径及其转录调节器是指导巨噬细胞活化的促炎症和抗炎程序的关键节点(图7). 例如，HIF-1α和糖酵解促进巨噬细胞的促炎激活，而STAT6和PGC-1β调节的氧化代谢使巨噬细胞进入炎症较少的替代状态。此外，这些发现增加了这样一种可能性，即巨噬细胞代谢启动至炎症较少的替代状态可能是促进脂肪酸（如纤维酸和噻唑烷二酮类）利用的疗法减轻动脉粥样硬化中巨噬细胞介导的炎症的主要机制(Duval等人，2002年;Zhang和Chawla，2004年).

实验程序

细胞培养

对于骨髓源性巨噬细胞（BMDM）、野生型和STAT6−/−从股骨和胫骨分离骨髓，并在补充有10%胎牛血清和20%L929条件培养基的IMDM中培养。如前所述，培养胚胎干细胞源性巨噬细胞（ESDM）(Chawla等人，2001年)，以下修改除外。ES衍生的骨髓祖细胞用编码HOXA9-ER的嗜生态逆转录病毒进行条件永生化，HOXA9-ER是一种以雌激素依赖性方式阻断骨髓分化的融合蛋白(赛克斯和坎普斯，2001年). 野生型HOXA9-ER系在SCF（25 ng/ml）、IL-3（1.25 ng/ml）和雌二醇（1μM）存在下增殖。通过提取雌二醇，在添加10%小牛血清和20%L929条件培养基的IMDM中培养细胞，诱导巨噬细胞分化。分化的巨噬细胞在6-7天内形成。用对照或编码f-PGC-1β的逆转录病毒感染增殖的WT-HOXA9-ER株系，并用嘌呤霉素（4μg/ml）进行选择。通过克隆PGC-1β#1和#2 shRNAs实现了PGC-1α的敲除(Lin等人，2005年b)pSIREN-Puro逆转录病毒载体。WT-HOXA9-ER细胞感染GFP、PGC-1β#1或PGC-1α#2 shRNA-表达逆转录病毒，并用嘌呤霉素（4μg/ml）进行筛选。对于经典或替代巨噬细胞激活，分别用小鼠IFNγ（100 u/ml）加LPS（5 ng/ml）或小鼠IL-4（10–20 ng/ml）刺激巨噬细胞24小时。

PGC-1β转基因小鼠的制备

将编码标记的mPGC-1β的cDNA片段亚克隆到含有hCD68启动子的载体中(Gough等人，2001年). 从克隆载体中提取DNA并注入CBA 3 C57Bl6小鼠卵母细胞。转基因后代用以下引物进行PCR分型：TY1:5′-TTCTCGCTCTGAATGACA-3′和5′-CAGCCCTCTTGGAAAGGAGG-3′。方正小鼠回交到C57Bl6背景上，F1-F3子代用于巨噬细胞实验。

凝胶迁移率变化分析和瞬时转染

用野生型或STAT6的核提取物进行凝胶迁移率变化分析−/−巨噬细胞，以及32P末端标记的寡核苷酸。使用GenePulser II（BioRad）在300V、1000μF下通过电穿孔瞬时转染RAW 264.7细胞，然后用IL-4（10 ng/ml）刺激12–20小时。根据制造商的协议，使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）进行荧光素素酶分析。通过PCR产生0.5 kb小鼠MCAD启动子片段，并将其克隆到荧光素酶报告基因构建物pGL3-Basic（Promega）中。所有转染均一式三份，并至少重复三次。

染色质免疫沉淀分析

按照说明进行染色质免疫沉淀分析（ChIPs）(Pauleau等人，2004年)进行了以下修改。2.5 × 106将RAW细胞接种在10cm平板中，休息过夜，并用10ng/ml IL-4刺激。细胞与甲醛交联并进行ChIP处理。用1μg M200抗STAT6多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology）与James Ihle（St.Jude Children’s Research Hospital）提供的1μl多克隆抗STAT5抗体混合进行每个STAT6免疫沉淀。使用亲和纯化的兔多克隆抗体进行PGC-1β免疫沉淀。按照说明处理免疫沉淀物(Pauleau等人，2004年)并使用精氨酸酶I增强子特异性引物进行qPCR分析。数据表示为与小鼠基因组DNA标准曲线相比的相对富集。每个实验重复进行两次，并独立重复三次。

Western blot分析、ELISA和流式细胞术

采用BMDM标准程序进行蛋白质印迹分析。通过免疫印迹法分析细胞色素C（1:1000，BD-Pharmingen）、VDAC1（1:2000，Sigma）、α-ATPase（1:1000；分子探针）、Flag（1:11000，Sigma-）、PGC-1β（1:500）和β-actin（1:5000，Sigma:。红外™在奥德赛红外检测系统上使用染料800缀合的第二抗体（1:30000，Rockland）进行蛋白质检测。对于ELISA，将细胞置于48或96周的平板中，用细胞因子或LPS刺激6–24小时。根据制造商的方案（BD Pharmingen），通过ELISA定量TNF-α、IL-6和IL-12分泌。对于流式细胞术，在进行FACs Caliber分析之前，用针对甘露糖受体、dectin-1和PD-L2的FITC-偶联抗体培养对照和IL-4刺激的巨噬细胞。为了测量细胞内钙，将处理过的巨噬细胞重新悬浮在含有1μM fluo-4AM的培养基中（用非离子洗涤剂pluronic按1:1添加），在37℃下悬浮45分钟，然后通过流式细胞仪进行分析。所有分析至少重复三次。

基因表达分析

使用Trizol试剂（Invitrogen）从三个独立的重复实验中制备总RNA，并通过Northern blot分析进行分析(Chawla等人，2001年). 用20–25μg总RNA进行微阵列实验，总RNA用荧光核苷酸标记并与小鼠cDNA载片杂交。通过安捷伦扫描仪查询杂交玻片，对数据进行背景减除和归一化，并使用微阵列软件包进行统计分析。

蛋白质相互作用分析

在共免疫沉淀试验中评估PGC-1β与STAT6的物理相关性。用编码f-PGC-1β和小鼠STAT6的质粒转染293-T细胞。转染后24小时，用hIL-4（10 ng/ml）刺激细胞60分钟。使用Flag抗体（Sigma）免疫沉淀含PGC-1β的复合物，在变性凝胶上溶解，并免疫印迹STAT6（1:1000，Santa Cruz）。

代谢分析

为了摄取葡萄糖和脂肪酸，用Th1或Th2细胞因子预先刺激巨噬细胞，并用14C-标记的2-脱氧葡萄糖或无脂肪酸BSA偶联物14C-油酸。随后，对细胞进行广泛清洗和溶解，并对其中的放射性进行量化。如前所述进行脂肪酸氧化分析(Muoio等人，2002年). 精氨酸酶分析，5×105巨噬细胞被置于24孔板中，用IL-4刺激15小时。通过检测尿素生成的比色法监测细胞总精氨酸酶活性(Rutschman等人，2001年). 总细胞数或蛋白质含量用于归一化。对于药物抑制或解偶联氧化代谢的研究，在用IL-4刺激巨噬细胞之前，用依托莫西（50μM）、寡霉素（2μg/ml）或FCCP（50 nM）预处理巨噬细胞24小时。所有测定均一式两份或三份进行，并重复至少三次。

统计分析和阵列数据集

所有统计分析均使用配对Student t检验进行，结果以平均值±SEM表示。p值<0.05被认为是显著的。本出版物中讨论的数据保存在NCBIs Gene Expression Omnibus（GEO，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)并可通过GEO系列登录号GSE5003访问。

补充数据

补充数据包括五位数，可在以下网站上找到http://www.cellmetrosasm.org/cgi/content/full/4/13/DC1/.

补充材料

补充的

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致谢

我们感谢Chawla实验室成员和C.Lee的宝贵意见；A.Loh、R.Evans、R.Kraemer和E.Butcher对手稿的评论；R.Wagner为微阵列实验提供帮助。我们还感谢Y.Ohmori、J.Ihle和A.Kakizuka提供关键试剂。这项工作得到了以下机构的资助：NIH（DK062386和HL076746）、AHA Western Affiliate、Rita Allen Foundation、Astellas USA Foundation、Rockefeller Brothers Fund和Goldman Philanthropic Partnerships；NIH拨款AI062921、Sandler哮喘研究项目、癌症中心CORE（P30 CA 21765）和美国Leb-anese叙利亚联合慈善机构向P.J.M.提供资助。A.C.是Charles E.Culpeper医学学者。院长奖学金为D.V.和L.M.提供了支持。所有动物护理都符合斯坦福大学A-PLAC委员会的指南。

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