细胞渗透性α-酮戊二酸衍生物缓解琥珀酸脱氢酶缺乏细胞的假性缺氧^▿

细胞培养。

HEK293人胚胎肾细胞、RCC4人肾细胞癌细胞和ARPE人视网膜色素上皮细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基中生长。HCT116人结肠癌细胞在补充有10%胎牛血清的McCoy培养基中生长。通过将pEGFP/ODD、pRC-CMV/HA-pVHL和pBabe-Puro共转染到HEK293细胞中，生成表达GFP-ODD的克隆。在嘌呤霉素中进行选择后，随机挑选96个克隆，并在96个well板中进行复制，每个克隆在有或没有CoCl的培养基中培养₂.经CoCl处理后，GFP荧光基础水平较低且荧光诱导显著的克隆₂进行了进一步研究。

α-酮戊二酸衍生物的合成。

α-酮戊二酸酯的合成方法采用了以前的工作(6,27). 使用以下方法制备辛基-α-酮戊二酸酯：在室温下将辛基-氯甲酸酯逐滴添加到α-酮戊二酸（10 mmol）和三乙胺（1.0 eq）在二氯甲烷（50 ml）中的溶液中。在环境温度下将所得混合物搅拌16 h，然后用二氯甲烷（50 ml）稀释，用0.5 N盐酸水溶液（50 ml。

对于苄基或3-三氟甲基苄基-α-酮戊二酸酯类似物，将相应的苄基溴（1.1当量）添加到α-酮戊二酸（10 mmol）和二环己胺（1.2当量）在二甲基甲酰胺（50 ml）中的溶液中，并将溶液在50°C下加热16 h。在减压下浓缩混合物，将残留物重新悬浮在二氯甲烷（100 ml）中，并用0.5 N盐酸水溶液（50 ml）清洗。干燥有机层（硫酸镁），并在减压下去除溶剂。使用正相快速柱色谱法（己烷/乙酸乙酯）纯化粗产物。

体外PHD活性。

反应如前所述进行(23)使用体外翻译的HA-ODD作为底物，HeLa细胞提取物作为PHD的酶源（20 mM Tris[pH7.4]，5 mM KCl，1.5 mM MgCl₂1 mM二硫苏糖醇添加“完全”蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche]，100μMN个-乙酰-Leu-Leu-Norleu-CHO）。在37°C下，在5 mM抗坏血酸、100μM FeCl存在下进行15分钟的反应₂α-酮戊二酸和琥珀酸的指示量。通过添加Laemmli样品缓冲液并立即煮沸，终止反应。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，使用抗HA抗体对样品进行Western blotting分析。

蛋白质分析。

在Laemmli样品缓冲液中提取细胞。SDS-PAGE后，将蛋白质印在硝化纤维素上，并用以下抗体进行分析：抗HIF1α（BD Biosciences）、抗HIF2α（Novus Biologicals）、抗HA（Roche）、抗GFP（BD bioscience）和抗凝集素（Sigma）。

α-酮戊二酸的测量。

细胞按照上述方法生长。以下所有操作均在4°C下进行。用磷酸盐缓冲液清洗细胞单层，并用RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH7.4]，150 mM NaCl，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%补充有“完全”蛋白酶抑制剂混合物的SDS[Roche]）溶解。从平板上收集细胞裂解物，用力旋涡，并在15000×克温度为4°C。立即分析等分提取物中的α-酮戊二酸。测定溶液由100 mM KH组成₂人事军官₄（pH值7.2），10 mM NH₄氯，5 mM氯化镁₂和0.15 mM NADH。在37°C下与提取物平衡后，通过添加5个单位的谷氨酸脱氢酶开始反应。在340 nm处监测吸光度降低。α-酮戊二酸的细胞内水平是根据NADH的吸光度降低来测定的（消光系数[ɛ]=6.22 mM⁻¹厘米⁻¹).

渗透细胞的α-酮戊二酸衍生物可增加细胞内游离α-酮戊二酸的水平。

α-酮戊二酸是亲水性的，不能有效地穿过质膜以达到足够高的细胞内水平（见下文）。因此，我们设计并合成了三种具有不同疏水指数的α-酮戊二酸透膜单酯衍生物（表​（表1）。1). 一旦这些衍生物进入细胞，酯就会被胞浆酯酶水解，从而增加胞浆中α-酮戊二酸的浓度。α-酮戊二酸酯具有完全的质膜渗透性和平衡性_在里面应等于[α-酮戊二酸酯]_外面的细胞溶质酯酶将α-酮戊二酸酯转化为α-酮戊二酸，既能在细胞内捕获α-酮谷氨酸，又能产生浓度梯度，将更多的α-酮谷氨酸酯从培养基转移到细胞溶质中。由此在细胞中形成和代谢的α-酮戊二酸将迅速被外源性α-酮戊二酸酯所取代，原则上，细胞内的α-酮戊二酸可能会超过细胞外α-酮庚二酸酯的浓度。

表1。

合成的α-酮戊二酸不同酯衍生物的分子结构和相对疏水性（以AlogP98计）

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^一αKG，α-酮戊二酸。

为了检测α-酮戊二酸酯增加α-酮戊二酸细胞水平的能力，HEK293细胞与1 mM未充分活化的α-酮谷二酸、苄基-α-酮谷氨酸、辛基-α-酮戊酸或TFMB-α-酮戊二酸进行孵育。制备细胞提取物，并使用谷氨酸脱氢酶（GDH）分光光度法立即分析细胞内游离α-酮戊二酸水平(29)（图。​（图2a）。2a个). NH含量高₄⁺和NADH被用于将GDH反应转变为谷氨酸形成（还原胺化），其中α-酮戊二酸的浓度与氧化NADH的量成化学计量比（在340 nm处的光吸收降低）（图。​（图2b）。2亿). 将已知量的α-酮戊二酸盐添加到未处理细胞的提取物中，可回收近95%外源性添加的α-酮戊二酸盐（数据未显示），表明α-酮戊二酸在提取物中具有化学和代谢稳定性。重要的是，当直接添加到GDH分析中时，α-酮戊二酸衍生物（前药）均未导致340-nm吸光度降低，表明只有游离的α-酮戊二酸才能参与GDH反应，因此，提取时细胞中残留的非水解α-酮戊二酸酯不会对游离酸的测量产生影响（数据未显示）。

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图2。

经α-酮戊二酸酯衍生物处理的细胞内α-酮戊二酸水平升高。（a） GDH反应示意图。（b） NADH的减少（通过340 nm处的光吸收测定）与添加到GDH反应中的α-酮戊二酸的化学计量比。（c） HEK293细胞要么未经处理，要么用1 mM的指定α-酮戊二酸衍生物或未激活的α-酮戊二酸处理。如图b所示，使用GDH反应分析细胞提取物中的α-酮戊二酸水平。（d）HEK293细胞转染对照Sc或靶向shRNAsSDHD公司（Di3或Di4）和48小时后，细胞要么未经处理，要么用1 mM辛基-α-酮戊二酸处理。在小组b和c中分析了α-酮戊二酸的细胞内水平。aKG是未激活的α-酮戊二酸；OaKG、TaKG和BaKG分别是辛基、TFMB-和苄基-α-酮戊二酸酯。误差线表示标准偏差。

当细胞在提取前用辛基-α-酮戊二酸或TFMB-α-酮戊二酸处理2小时时，细胞内的α-酮戊二酸水平大约增加了四倍（图。​（图2c）。2厘米). 相反，用未充分活化或苄基-α-酮戊二酸（疏水性最低的衍生物）处理的细胞（表​（表1）1)显示细胞内α-酮戊二酸的水平在基础水平以上没有增加（图。​（图2c）。2厘米). 这些结果表明，未衍生的α-酮戊二酸不能有效地进入细胞，这强调了酸的衍生和引入足够的疏水性对有效性至关重要。在随后的实验中，辛基-和TFMB-α-酮戊二酸酯用于升高细胞内的α-酮戊二酸，而未衍生化的和苄基-α-酮戊二酸用作阴性对照。

在上述实验中，α-酮戊二酸衍生物用于具有正常TCA循环的细胞。我们假设外源性α-酮戊二酸会优先在TCA循环中间产物代谢受损的细胞中积累。为了验证这个假设，将Di3或Di4短发夹RNA（shRNA）瞬时转染细胞，靶向SDHD公司亚单位，已知能有效抑制细胞中SDH活性(23). 干扰shRNA（Sc）用作阴性对照。转染48小时后，用1 mM辛基-α-酮戊二酸处理细胞2小时，然后按上述方法分析细胞内游离α-酮戊二酸水平。shRNA结构对未处理细胞的基础α-酮戊二酸水平没有影响。然而，用辛基-α-酮戊二酸衍生物处理的SDH缺陷细胞显示，α-酮戊二酸水平比扰乱对照转染细胞中观察到的升高高出两倍（图。​（图2d）。第2天). 有趣的是，在TCA循环被α-酮-β-甲基抑制的细胞中，也观察到α-酮戊二酸水平增加-n个-戊酸是α-酮戊二酸脱氢酶的抑制剂（数据未显示）。这表明，减慢TCA循环的条件会阻止线粒体中的α-酮戊二酸氧化，从而加速细胞溶质α-酮戊二酸的积累。

细胞内α-酮戊二酸水平升高会重新激活琥珀酸或富马酸盐抑制的PHD。

为了分析α-酮戊二酸衍生物对细胞PHD活性的影响，我们生成了两个表达GFP-ODD融合蛋白和HA标记pVHL的HEK293衍生细胞系（图。​（图3a，3a年，左）。在这些细胞中，GFP水平受到PHD活性的严格调节，PHD活性构成了GFP-ODD融合蛋白的靶点，用于pVHL介导的蛋白酶体降解。用氯化钴处理的细胞₂一种抑制PHD活性的低氧化合物，在Western blot中显示GFP-ODD水平增加（图。​（图3a，3a年（右）和共焦显微镜（图。​（图3b，3亿，top）分析，确认这些细胞中的GFP荧光水平反映了PHD的活性。为了确定提高细胞内α-酮戊二酸是否克服琥珀酸介导的PHD抑制，首先用丁二酸二甲酯处理细胞，这些细胞在处理48小时后GFP荧光增强（图。​（图3b）。3亿). 辛基-α-酮戊二酸或TFMB-α-酮戊二酸在加入二甲基琥珀酸处理的细胞后12小时内降低了GFP荧光（图。​（图3b），3亿)，表明PHD活动受到刺激。相应的Western blot显示，在用丁二酸二甲酯处理的细胞中，GFP-ODD和内源性HIF1α的水平升高，在添加α-酮戊二酸衍生物后又下降到基础水平（图。3c和d).

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图3。

细胞内α-酮戊二酸水平的增加减轻了琥珀酸对PHD活性的抑制。（a，左）通过Western blotting分析共表达GFP-ODD融合蛋白和HA标记pVHL的克隆（C2和C3）。用仅编码GFP的质粒瞬时转染的细胞作为GFP分子量（Co）的参考。肌动蛋白被用作负载对照。（右）克隆3（C3）细胞未经处理（U）或用低氧化合物CoCl处理₂通过蛋白质印迹分析GFP-ODD和HA-pVHL蛋白水平。（b） 克隆3细胞未经处理或用CoCl处理₂或25 mM丁二酸二甲酯（DMS）48 h。如有指示，在培养的最后12 h添加1 mMα-酮戊二酸衍生物（与丁二酸二甲酯），并在显微镜下观察GFP-ODD水平。（c） 克隆3细胞按b组处理，通过Western blotting检测GFP-ODD水平。氯化钴₂-处理细胞（CC）作为PHD抑制的阳性对照，肌动蛋白水平作为负荷对照。（d） 克隆3细胞要么未经处理（U），要么用丁二酸二甲酯（DMS）处理，要么加入或不加入TFMB-α-酮戊二酸。Western blotting检测GFP-ODD和HIF1α水平。肌动蛋白被用作加载控制。（e） 克隆3细胞按d组处理，蛋白裂解物用抗GFP（多克隆）抗体免疫沉淀。用抗GFP（单克隆）抗体和抗HA抗体对免疫沉淀（IP）前后的裂解产物进行Western blotting分析。OaKG和TaKG分别是辛基和TFMB-α-酮戊二酸酯。

由于pVHL与ODD的结合通过ODD-脯氨酰羟基化显著增强，因此GFP-ODD与HA-VHL的关联程度是ODD羟基化水平的良好指示。因此，为了确定α-酮戊二酸处理的细胞中GFP-ODD水平是否因ODD羟基化而下降，通过共免疫沉淀分析GFP-ODT和HA-pVHL之间的相互作用。正如预期的那样，用丁二酸二甲酯处理的细胞产生较少的GFP-ODD-相关的HA-pVHL，并且添加α-酮戊二酸衍生物恢复了这种依赖于羟化的蛋白质相互作用（图。​（图3e）。第三版). 此外，HA-pVHL的总水平未被丁二酸二甲酯或α-酮戊二酸改变（图。​（图3e，第三版，左），表明GFP-ODD-相关HA-pVHL的水平在翻译后受到调节。

在这些实验中，为了用丁二酸二甲酯最大限度地诱导GFP-ODD（表示PHD的最大抑制），细胞被维持在10%氧气的条件下，而不影响GFP-ODC的基础水平（图。​（图3b，3亿，未经处理）。有理由认为，琥珀酸在次优氧条件下对PHD的抑制作用最大，在没有琥珀酸的情况下，这种抑制作用仍足以维持PHD的活性。这可能有助于解释不完全外显率和轻度表型SDHD公司与高海拔相比，低海拔家庭的突变(2). 然而，瞬时转染Di3 shRNA的HEK293细胞靶向SDHD亚单位，在正常氧条件下HIF1α水平升高（图。​（图4a）。4a类). 通过使用1 mM辛基-α-酮戊二酸或1 mM TFMB-α-酮戊二酸衍生物（图。​（图4a）。4a类). 这表明，当由SDH功能障碍和随后的琥珀酸升高引起PHD抑制时，过量的α-酮戊二酸可以克服PHD抑制。未活化的α-酮戊二酸（未显示）和疏水性最低的苄基α-酮戊二酸衍生物对HIF1α水平没有影响（图。​（图4a4a类).

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图4。

α-酮戊二酸酯克服了琥珀酸或富马酸介导的HIF1α稳定性。（a） 用打靶SDHD（Di3）的干扰对照Sc或shRNA转染HEK293细胞。如有指示，在转染48小时后添加α-酮戊二酸衍生物，然后进行HIF1α的Western blot分析。肌动蛋白水平被用作负荷控制。（b） 在提取之前，HCT116细胞用或不用2 mM单乙基叶酸处理24 h和/或2 mM TFMB-α-酮戊二酸酯处理最后2 h。如图a所示进行蛋白质印迹分析。（c）ARPE细胞未经处理或用指定量的富马酸单乙酯处理3小时，用或不用2mM辛基-α-酮戊二酸酯。与面板a一样进行蛋白质印迹分析。（d）HEK293细胞未经处理或用0.5 mM CoCl处理₂在含有或不含有2mM所示的α-酮戊二酸衍生物的情况下持续2小时。如图a所示进行蛋白质印迹分析。（e）ARPE细胞未经处理或用2mM富马酸单乙酯和/或2mM TFMB-α-酮戊二酸酯处理。通过Western blotting检测HIF1α、HIF2α、pVHL和肌动蛋白的内源性蛋白水平。U、 未经处理；CC、氯化钴₂; MEF，戊二酸单乙酯；OaKG，辛基-α-酮戊二酸；TaKG，TFMB-α-酮戊二酸；BaKG，苄基-α-酮戊二酸。

与SDH突变患者不同，不同的突变FH携带者根据海拔高度（氧气水平）对肿瘤形成的敏感性不同。此外，在体外，富马酸是一种比琥珀酸更好的PHD抑制剂(13). 因此，在不同的细胞系中测试了在常压条件下，单乙基呋喃甲酸酯对HIF1α蛋白水平的影响。在用1至3 mM单乙基呋喃甲酸钠治疗后，在肾脏（HEK293）（未显示）、结肠（HCT116）中观察到HIF1α蛋白水平升高（图。​（图4b），4b个)和视网膜上皮（ARPE）（图。​（图4c）4c类)单元格。在所有情况下，添加有效的α-酮戊二酸衍生物完全阻断了这种诱导（图。4b和c). 重要的是，虽然α-酮戊二酸能逆转富马酸或琥珀酸介导的HIF1α对单乙基-富马酸处理或SDH-敲除细胞的诱导作用，但α-酮戊二酸对CoCl没有影响₂-诱导HIF1α水平，这与CoCl₂通过不涉及琥珀酸或α-酮戊二酸的独立机制抑制PHD（图。​（图4d第4天).

我们之前已经证明，在HEK293细胞中，HIF2α水平的变化对琥珀酸增加不太敏感(23). 为了分析富马酸和α-酮戊二酸对HIF2α的影响，用含或不含TFMB-α-酮戊二酸的单乙基富马酸处理ARPE细胞。与HIF1α相比，HIF2α水平对这两种化合物的反应较小（图。​（图4e）。第四版). 综上所述，这些结果和我们之前的结果表明，HIF1α和HIF2α可能受到不同PHD的调节，这些PHD对琥珀酸和富马酸的敏感性不同。重要的是，在这些条件下，未观察到pVHL内源性水平的变化（图。​（图4e），第四版)进一步支持了α-酮戊二酸在不改变pVHL水平的情况下稳定HIF1α的观点。

这项工作得到了英国国际癌症研究协会的支持。

我们感谢阿亚拉·金出色的编辑工作。