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分子诊断杂志。2007年7月；9(3): 320–326.
数字对象标识：10.2353/jmoldx.2007.060182
预防性维修识别码：项目经理1899415
PMID：17591931

粘液分化与缺乏表皮生长因子受体突变和存在KRAS公司具有支气管肺泡特征的肺腺癌的突变

卡琳·芬伯格,* Lecia V.后遗症,† 维多利亚·A·乔希,† 阿隆娜·穆齐坎斯基,§ 朱莉·M·米勒,* 韩文珠,* 贾瓦德·贝赫什蒂,* 卢西安·希利亚克, 尤金·J·马克,*和A.约翰·伊弗雷特*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

表皮生长因子受体基因的体细胞突变(表皮生长因子受体)在一组肺腺癌中检测到，尤其是支气管肺泡癌（BAC）和具有支气管肺泡特征的腺癌（AWBF），并与酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的临床反应相关。相反，对TKI耐药的肺腺癌通常在KRAS公司但缺乏表皮生长因子受体突变。一些腺癌有粘液组织学，但粘液模式的临床和分子意义研究较少。我们分析了提交给表皮生长因子受体突变测试以确定预测的组织病理学特征表皮生长因子受体或KRAS公司突变。表皮生长因子受体30例非幻觉性肿瘤中有14例（47%）检测到突变，而13例粘液性肿瘤中0例有表皮生长因子受体突变(P（P）= 0.003). 错义突变KRAS公司7例粘液腺癌中有6例（86%）检测到密码子12，而18例非幻觉腺癌中只有3例（17%）检测到了密码子12(P（P）= 0.003). 因此，在BAC/AWBF中，粘液分化与缺乏表皮生长因子受体突变和存在KRAS公司突变，表明黏液性BAC/AWBFs不太可能对TKI产生反应。因此，我们的数据表明表皮生长因子受体当识别出真正的粘液形态时，可以避免BAC/AWBF中的序列分析，从而避免相关的测试成本。

表皮生长因子受体（EGFR）是ErbB家族的一种受体蛋白酪氨酸激酶（TK），经常在实体肿瘤中表达，并促进肿瘤生长和生存。1非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌类型，经常表达EGFR。2最近表皮生长因子受体在非小细胞肺癌的一部分肿瘤中检测到三,4,5与酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗后的临床反应和生存率相关。三,4,5,6,7,8与其他非小细胞肺癌组织学类型相比，这种突变在女性、从不吸烟者、东亚血统患者和腺癌患者中更为常见。三,4,9,10,11一些研究表明表皮生长因子受体突变在NSCLC中更常见，表现为细支气管肺泡癌（BAC）的特征，三,5,10,12,13腺癌的一种亚型，肿瘤细胞沿着肺泡隔扩散（鳞状细胞生长模式）。14

除了表皮生长因子受体突变，表皮生长因子受体在NSCLC肿瘤中检测到基因扩增。15的复合端点表皮生长因子受体高多聚体+表皮生长因子受体在一些研究中，基因位点扩增与TKI治疗后生存率的提高有关15,16,17但其他人没有。18此外，在高水平肿瘤中表皮生长因子受体扩增（大于或等于六个拷贝），携带表皮生长因子受体突变优先放大，19表明这些肿瘤对EGFR信号有强烈依赖性。

ErbB信号通路其他成分的异常功能也被描述为肺癌。这些组件包括BRAF，20PIK3CA，21和下游GTP酶KRAS。22大约30%的肺腺癌在KRAS公司，最常见的激活密码子12的错义突变22与吸烟史密切相关。23几项研究表明，在肺腺癌中，表皮生长因子受体和KRAS公司突变是相互排斥的，11,24,25,26可能反映了不同的致癌机制。事实上，对TKI耐药的非小细胞肺癌通常在KRAS公司,24提示KRAS激活可能通过激活EGFR下游的信号通路实现TKI抵抗。因此，在缺乏NSCLC的肿瘤中表皮生长因子受体突变，知识KRAS公司突变状态可能对指导适当的药物治疗有价值。

虽然临床筛查表皮生长因子受体非小细胞肺癌的突变现在已经存在，关于分子剖析在非小细胞肝癌中的应用缺乏共识指南。为了确定非小细胞肺癌的任何特定组织病理学特征是否有助于指导合理的分子分析，我们回顾了提交给我们医院的一系列肿瘤标本表皮生长因子受体突变筛查。特别是，我们检查了具有细支气管肺泡特征的肿瘤，以预测表皮生长因子受体突变状态，KRAS公司突变状态，以及表皮生长因子受体基因拷贝数，与TKI治疗的临床反应性或难治性相关的分子特征。

材料和方法

病理和临床回顾

临床表皮生长因子受体2004年8月，马萨诸塞州总医院开始进行突变筛查。对提交给MGH的所有肿瘤标本的外科病理报告进行审查表皮生长因子受体2004年8月至2005年10月筛查。标本包括在MGH进行的手术中获得的肿瘤活检、切除和细针穿刺，以及从外部机构提交的参考标本。根据世界卫生组织标准对肿瘤进行分类27分为腺泡型、乳头型、BAC型或混合型。为了进行分析，将所有具有细支气管肺泡特征的混合型腺癌分为具有细支气管肺泡特征的腺癌（AWBF）。这定义了BAC/AWBF肿瘤组，这是临床分析和中央外科病理幻灯片审查的队列。两位作者（E.J.M.，A.J.I.）对所有可用BAC/AWBF病例的组织进行了组织学检查，并根据世界卫生组织标准评估了BAC/AWBB组中所有肿瘤的腺泡和乳头特征，进一步评估肿瘤是否有粘液特征，即单个肿瘤细胞高且分化良好，有位于基底的细胞核，并产生粘液。14,28

所有MGH患者的患者人口统计学、癌症史和吸烟史均采用结构化医生图表审查进行记录。分期采用美国癌症联合委员会分期标准。29使用标准标准对患者进行分类，包括前吸烟者（定义为在肺癌诊断前至少1年戒烟的患者）和从不吸烟者，定义为一生中吸烟少于100支的患者。30通过将每天吸烟的包数乘以吸烟年数来计算吸烟年数。

EGFR突变分析

对于每个福尔马林固定的石蜡包埋标本，用苏木精和伊红对5μm的组织切片进行染色，并通过光学显微镜进行检查，以选择适合显微切割的肿瘤受累的代表性区域。一些组织被切片和冷冻，以类似的方式分离肿瘤的代表性区域。DNA分离和突变分析表皮生长因子受体如前所述，对外显子18至24进行检测。31

KRAS突变分析

对于BAC/AWBF病例，从福尔马林固定石蜡包埋组织的连续5μm未染色切片中手动显微解剖可用的肿瘤组织（三张切片；～1 cm2每片纸巾）。组织在二甲苯中脱蜡并在100%乙醇中再水化。使用Puregene DNA纯化试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯Gentra Systems）提取DNA。聚合酶链反应（PCR）在20μl体积中使用1×铂进行塔克PCR缓冲液，200μmol/L dNTPs，3.0 mmol/L MgCl2、0.4μmol/L引物和1.0 U铂塔克聚合酶（Invitrogen，Carlsbad，CA），以40 ng肿瘤DNA为模板。以下引物用于PCR扩增KRAS公司外显子2：正向，5′-GGTGGAGTATTTGAGTTATAACC-3′；背面为5′-AGAATGGTCCTGACCAGTAA-3′。在Mastercycler ep（德国汉堡Eppendorf）中进行热循环，初始变性步骤为94°C，持续2分钟；然后在94°C下进行38次变性循环30秒，在61°C下退火30秒，并在72°C下延伸30秒；以及在72°C下进行10分钟的最终伸长步骤。使用DNA Clean and Concentrator（加利福尼亚州Orange，Zymo Research）纯化PCR产物，并使用用于扩增的相同引物进行双向染色终止测序。使用ABI Prism 3130XL DNA分析仪（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）通过毛细管电泳检测序列片段。序列色谱图通过ABI Seqscape软件进行分析。

荧光现场杂交（FISH）

对于具有粘液形态的BAC/AWBF肿瘤，将可用的经处理的5μm石蜡肿瘤切片与细菌人工染色体CTD-2113A18（染色体7p表皮生长因子受体基因座）和RP5-1129E22（染色体7q参考探针）。细菌人工染色体分别用SpectrumOrange或SpectrumGreen dUTP（Vysi，Inc.，Downers Grove，IL）进行缺口翻译标记，细胞核用4,6-二氨基-2-苯基吲哚进行复染。使用奥林巴斯BX-61显微镜（奥林巴斯，宾夕法尼亚州中央山谷）进行荧光显微镜检查。使用100个细胞的信号定量来产生7p/7q比率。考虑的比率为7p:7q>2.0表皮生长因子受体基因座扩增。The distribution of表皮生长因子受体使用前面描述的标准，用细胞群中的拷贝数来评估多染色体。15

统计分析

之间的关联表皮生长因子受体和KRAS公司使用SAS统计软件（版本8.02；SAS Institute，Cary，NC），通过Fisher精确检验对突变状态和组织学特征进行评估。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。KRAS公司突变分析，表皮生长因子受体根据我们机构审查委员会批准的方案进行基因拷贝数分析和病历审查。本分析中包括的一些患者已被纳入其他临床分析。31,32

结果

提交用于EGFR突变分析的临床样本

在提交给MGH病理科的119例原发性肺癌中表皮生长因子受体在研究期间的突变状态评估中，111例（93%）为腺癌，2例为腺鳞癌，1例为鳞癌，一例为大细胞癌，4例为非小细胞肺癌，未另行说明（图1）111例腺癌中有44例为BAC/AWBF。在这44例患者中，39例患者接受了MGH治疗，因此可用于临床图表审查。这39名患者的临床特征如下所示表1.

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研究组织，包括提交给表皮生长因子受体肿瘤BAC/AWBF亚群的突变状态评估和形态学和分子特征总结。N.O.S.，未另行规定。

表1

39例BAC/AWBF患者的临床特点

中位年龄69岁（范围为45至85岁）
性别
 女性26 (67%)
 男性13 (33%)
比赛
 白色36 (92%)
 亚洲的2 (5%)
 未知1 (3%)
疾病阶段*
 阶段I、II或IIIA27 (69%)
 阶段IIIB或IV12（31%）
吸烟史
 从不吸烟9 (23%)
 前吸烟者26 (67%)
 当前吸烟者4 (10%)
*美国癌症联合委员会分期系统。29 

BAC/AWBF肿瘤EGFR突变状态的形态学相关性

表皮生长因子受体在44个BAC/AWBF组的15个（34%）肿瘤中检测到突变（补充表见http://jmd.amjpathol.org/)67例腺癌中有13例（19%）缺乏BAC特征（数据未显示）。这种流行差异表皮生长因子受体突变没有统计学意义(P（P）=0.2）。在表皮生长因子受体纯BAC与AWBF的突变(P（P）= 0.69). 在BAC/AWBF队列中表皮生长因子受体突变，在7个标本（47%）中检测到第21外显子2573T>G（L858R）突变，而6个肿瘤（40%）在第19外显子中存在框内缺失（见补充表http://jmd.amjpathol.org/). 这两种类型的突变是最常见的表皮生长因子受体非小细胞肺癌的突变占所描述变异的约90%，且均与TKI反应相关。33在一个AWBF和一个BAC中检测到G719A突变，后者也含有R776H突变。

对BAC/AWBFs的组织学检查（44例中有43例可供检查）表明（图2A）与缺乏表皮生长因子受体突变，而缺乏粘液组织学（图2、B和C）与表皮生长因子受体突变。在13个粘液性BAC/AWBF肿瘤中，没有一个具有表皮生长因子受体突变，而30例（47%）非幻觉性肿瘤中有14例表皮生长因子受体突变阳性(P（P）= 0.003,表2).

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BAC/AWBF的形态和分子特征。答：含有显著BAC成分的粘液腺癌KRAS公司突变和缺失表皮生长因子受体突变。插入，DNA序列色谱图显示的密码子12和13KRAS公司在同一个肿瘤中。基因第35位核苷酸的杂合G>A转换KRAS公司观察到编码序列。B类：缺乏显著BAC成分的非黏液腺癌表皮生长因子受体突变。抄送：非粘液性BAC表皮生长因子受体突变。插入，密码子746（GGA）后的序列追踪与L747_T751delinsP突变一致（通过测序反向链确认缺失；数据未显示）。医生： 表皮生长因子受体FISH基因拷贝数分析显示黏液性BAC中存在高度多聚体KRAS公司突变（35G>T）和缺乏表皮生长因子受体突变。红色信号表示探针杂交到染色体7p(表皮生长因子受体基因座），绿色信号表示染色体7q参考探针的杂交。原始放大倍数：×200(A–C); ×1000 (D类).

表2

BAC/AWBF肿瘤的粘液和非粘液形态学表皮生长因子受体TK突变和KRAS公司外显子2突变

粘液的非粘液性
表皮生长因子受体检测到突变0% (0/13)47% (14/30)
表皮生长因子受体未检测到突变100% (13/13)53% (16/30)
KRAS公司检测到突变86% (6/7)17% (3/18)
KRAS公司未检测到突变14% (1/7)83% (15/18)

粘液性BAC/AWBF肿瘤分析

鉴于我们的发现，在任何BAC/AWBF肿瘤中均未观察到粘液组织学表皮生长因子受体突变，我们试图确定BAC/AWBF中粘液组织学的存在是否与之前与TKI临床难治性或反应性相关的其他分子特征相关。在25个有足够组织可供分析的BAC/AWBF中KRAS公司9例（36%）检测到外显子2（表2）.没有任何肿瘤KRAS公司检测到的突变也携带表皮生长因子受体突变。KRAS公司突变与粘液形态显著相关，在7例粘液形态患者中有6例（86%）检测到突变(图2A，插图），相比之下，18例中有3例（17%）具有非幻觉形态(P（P）= 0.003,表2). 在粘液性病例中，我们发现第12密码子的正常DNA序列（GGT；甘氨酸）突变为TGT（半胱氨酸）1例，GAT（天冬氨酸）2例，GTT（缬氨酸）3例（表3）此外，我们对粘液病例进行了FISH评估表皮生长因子受体基因拷贝数和检测到的表皮生长因子受体分析了五个病例中的四个病例的基因座，而表皮生长因子受体未观察到基因扩增(表3;图2D). 在MGH治疗的39例BAC/AWBF患者中，只有5例接受了TKI治疗，只有4例在随访期间死亡；因此，没有足够的力量来执行治疗反应或生存分析。

表3

KRAS公司突变状态和表皮生长因子受体粘液性BAC/AWBF缺乏基因拷贝数表皮生长因子受体TK突变

案例KRAS公司突变状态腺癌亚型表皮生长因子受体副本编号
134G>温度混合（腺泡和BAC，粘液）高度多形性
235G>安混合（腺泡和BAC，粘液）高度多形性
三35G>安混合（乳头状和BAC，粘液）高度多形性
435克>吨BAC，粘液未注明。
535克>吨混合（腺泡和BAC，粘液）高度多形性
635克>吨混合（乳头状和BAC，粘液）低多形性
7野生型BAC，粘液未注明。

N.D.，未完成。 

讨论

我们将非小细胞肺癌的病理特征与是否存在表皮生长因子受体临床上一系列肿瘤的突变表皮生长因子受体突变筛选。表皮生长因子受体在所有腺癌亚型中检测到突变，包括腺泡型、乳头型、BAC型和混合型。在临床环境中，如果只有有限的组织可用于组织学检查，则将肿瘤分类为纯BAC可能很困难。因此，为了进行分析，我们将BAC和具有BAC特征的混合亚型腺癌分为一组，即BAC/AWBF。在我们的研究中，我们评估了不同类型的外科病理标本。对于某些患者，可评估材料的数量有限，可能会出现取样偏差，例如，导致无法检测到肿瘤中的外围BAC成分，或诊断出实际上是AWBF的肿瘤中的纯BAC。

不同人群使用的BAC的不同定义，以及不同的患者人口统计数据，可能导致患有表皮生长因子受体突变，以及表皮生长因子受体BAC突变。例如，Lynch和同事三将任何成分的细支气管肺泡癌的腺癌分类为BAC；按照这种定义，八分之三（37.5%）的非小细胞肺癌肿瘤中存在BAC表皮生长因子受体最初的突变表皮生长因子受体MGH突变发表。在测试的初始患者队列中使用类似的定义表皮生长因子受体纪念斯隆-凯特琳癌症中心的突变，Pao及其同事5发现12个肿瘤中表皮生长因子受体突变，11例（92%）具有具有BAC特征的腺癌组织学（一例为纯BAC，一例为局灶性浸润BAC，九例为AWBF）。在860名意大利患者中，表皮生长因子受体使用Barkley和Green命名法定义的BAC病例中有22例（26%）存在突变34与17例（6%）传统腺癌相比，P（P）< 0.0001.12在35名台湾患者中，任何BAC成分的腺癌组织学与表皮生长因子受体突变（21例患者中14例，66%）与单纯腺癌（13例患者中3例，23%，P（P）= 0.009); 然而表皮生长因子受体世界卫生组织标准严格定义的突变和纯BAC27未观察到。10同样，在一系列60名日本患者中，BAC的任何成分都与携带表皮生长因子受体突变为5.0（95%置信区间为2.0至12.6），但严格的世界卫生组织纯BAC分类与突变状态无关。13相反，根据世界卫生组织的标准对来自美国的97例非小细胞肺癌患者的腺癌进行分类，并对其鳞状细胞生长百分比进行评分，结果显示，在这些患者中表皮生长因子受体突变和BAC特征的存在或百分比。11值得注意的是，在这个队列中，7个纯BAC肿瘤中没有一个腺癌存在表皮生长因子受体突变。11

我们证明，我们队列中没有任何BAC/AWBF肿瘤表皮生长因子受体突变显示粘液形态。在不同人群的非小细胞肺癌患者中也观察到类似的结果。在几项研究中报告的粘液性BAC/AWBF的临床和分子特征总结如下表4在一项对香港华人非小细胞肺癌患者的研究中，BAC肿瘤是根据世界卫生组织的标准定义的，表皮生长因子受体在5例粘液型BAC中没有检测到突变，但在19例非粘液型BAC中有15例检测到突变。26在前面提到的意大利系列中，根据世界卫生组织标准对非小细胞肺癌进行了亚型，根据Barkley和Green标准对BAC进行了组织学亚型，34 表皮生长因子受体17例粘液性BAC中0例检测到突变，69例非粘液性BA中22例（32%）检测到突变。12

表4

患病率比较表皮生长因子受体突变，KRAS公司突变，增加表皮生长因子受体几项研究中报告的粘液性BAC/AWBF的拷贝数和对TKI治疗的反应

书房患有以下疾病的病例比例表皮生长因子受体突变具有以下特征的病例比例KRAS公司突变增加病例比例表皮生长因子受体副本编号*对TKI作出回应的案件比例
Tam等人260/5 (0%)未注明。未注明。未注明。
Marchetti等人12†0/17 (0%)2017年13月（76%）未注明。未注明。
Hirsch等人16未注明。未注明。1/14 (7%)0/11 (0%)
本研究0/13 (0%)6/7 (86%)4/5 (80%)未注明。
总计0/35 (0%)19/24 (79%)5/19 (26%)0/11 (0%)

N.D.，未确定/未报告。 

*增加表皮生长因子受体根据Cappuzzo et al。15 
†使用Barkley和Green术语定义的BAC病例。34 

除了粘液分化和表皮生长因子受体突变，我们确定KRAS公司突变在粘液性BAC/AWBF中很常见，86%的队列中发生。我们的发现证实了先前的关联KRAS公司粘液性BAC突变。35此外，多项研究表明表皮生长因子受体突变和KRAS公司在非小细胞肺癌中，突变几乎总是互斥的。11,12,24,25,26,36我们发现粘液分化与KRAS公司突变和缺乏表皮生长因子受体突变进一步强化了这一假设。

这个KRAS公司我们在外显子2中检测到的突变都曾在对TKI治疗无效的非小细胞肺癌病例中报告过。Pao和同事24检查了60例TKIs治疗患者的肺腺癌，发现22例（77%）TKI敏感腺癌中有17例在表皮生长因子受体，他们都没有窝藏KRAS公司外显子2突变。此外，在38个TKI难治性肿瘤中，有9个（24%）存在KRAS公司突变。此外，KRAS公司在一项对晚期非小细胞肺癌患者进行初次化疗（卡铂和紫杉醇）伴或不伴TKI治疗的随机试验中，突变与TKI疗法后的不良预后相关。37突变亚组的进展时间和存活率降低KRAS公司接受TKI和化疗治疗的患者与突变亚组相比KRAS公司仅用化疗治疗。37

表皮生长因子受体基因拷贝数是另一个分子特征，已被证明会影响接受TKIs治疗的非小细胞肺癌患者的预后。在一项对具有BAC特征的BAC或腺癌患者的研究中表皮生长因子受体根据Cappuzzo及其同事的研究，拷贝数被定义为FISH高多聚体和基因扩增的复合终点，15与TKI治疗后生存率的提高有关。有趣的是，在同一项研究中，治疗的临床反应和表皮生长因子受体FISH阳性在无幻觉形态的BAC患者中更常见。百分之三十（6/20）的非幻觉BAC患者对TKI治疗有反应，而11名粘液BAC患者中有0名有反应，并且表皮生长因子受体35例非幻觉BAC中11例（31%）FISH阳性，14例粘液BAC中只有1例（7%）阳性KRAS公司未检测这些粘液病例的突变状态。16根据卡普佐（Cappuzzo）及其同事的标准定义高度多义性，15我们的表皮生长因子受体拷贝数分析发现，五分之四（80%）的受检粘液BAC/AWBF中存在高度多聚体KRAS公司外显子2突变，但在任何粘液性BAC/AWBF病例中未检测到基因扩增。

当考虑到我们研究的意义时，应该指出，我们的研究系列特别包括提交给表皮生长因子受体突变筛查，可能不完全代表普通人群中未选择的腺癌。我们的队列可能包括来自某些人口统计学组（即女性、亚洲人和非吸烟者）和某些肿瘤组织学（即BAC/AWBF）的患者比例过高。由于我们的患者群体是异质的，不属于单一前瞻性治疗方案的一部分，我们缺乏比较治疗反应和进行生存分析的能力。

总之，我们的发现表明黏液性BAC/AWBFs缺乏致敏性表皮生长因子受体突变，通常包含激活KRAS公司突变，因此不太可能对EGFR TKIs产生反应。从患者测试的角度来看，我们的数据表明表皮生长因子受体当识别出真正的粘液形态时，可以避免序列分析，从而避免相关的测试成本。我们的发现表皮生长因子受体与…共存KRAS公司一些黏液BAC/AWBF中的突变增加了高多聚体可能无法有效预测该肿瘤亚群的TKI反应性的可能性。需要进一步的临床试验来提高对腺癌组织学亚型、，表皮生长因子受体突变状态，表皮生长因子受体基因拷贝数状态，KRAS公司突变状态，以及这些因素与TKI治疗反应之间的相互关系。

补充材料

补充材料：

致谢

我们感谢David N.Louis博士对手稿的批判性审查。

脚注

由马萨诸塞州总医院、布里格姆女子医院和分子医学实验室部门资金支持。

K.E.F.和L.V.S.对本研究做出了同等贡献。

本文的补充材料可以在上找到网址：http://jmd.amjpathol.org/.

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文章来自分子诊断杂志：JMD由以下人员提供美国病理研究学会