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生物化学杂志。2007年6月15日；404（第3部分）：449–458。
2007年5月29日在线发布。2007年3月16日在线预发布。 数字对象标识：10.1042/BJ20070003
预防性维修识别码：第189页第6275页
PMID：17362206

胰岛素信号中IA类PI3K亚型功能冗余的证据

克莱尔·乔萨德,* 戈登·W·。重新卡斯尔,† 杰基·D·。肯德尔,† 威廉A。丹尼,† 基蒂·乔,* M线。格林,‡ 梅凌冲,* 萨沙·H·。阿纳格诺斯托,* 肖恩·P。杰克逊,§ 纳撒利·丹尼尔,和彼得·R。牧羊人*,1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

最近的基因敲除和药理学方法表明，在IA类PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）中，p110α亚型（PIK3CA）在胰岛素信号传递中起主要作用。我们使用了IA PI3K类异型选择性抑制剂，进一步剖析了单个p110亚型在胰岛素信号传导中的作用。其中包括p110α特异性抑制剂（PIK-75）、p110α选择性抑制剂（PI-103）、p101β特异性抑制物（TGX-221）和p110δ特异性抑制剂（IC87114）。虽然我们发现p110α在一些细胞系中对胰岛素刺激的PKB（蛋白激酶B）磷酸化是必要的，但我们发现在HepG2肝癌细胞中并非如此。单独抑制p110β或p110δ也不足以阻断这些细胞中PKB的胰岛素信号传导，但当与p110α抑制剂结合使用时，它们能够显著减弱胰岛素信号传导。令人惊讶的是，在J774.2巨噬细胞中，p110α、p110β或p110δ抑制剂对PKB的胰岛素信号的抑制程度相似。这些结果提供了p110β和p110δ可以在胰岛素信号传导中发挥作用的证据，也提供了p110亚型之间可能存在功能冗余的第一个证据。此外，我们的结果表明，功能冗余的程度与靶细胞中每个亚型的相对表达水平有关。

关键词：AS252424、胰岛素信号、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、PIK3CA、PIK3CB、蛋白激酶B/Akt
缩写：CHO-IR细胞、表达人胰岛素受体的中国仓鼠卵巢细胞；DMEM，Dulbecco改良的Eagle培养基；胎牛血清；GPCR，G蛋白偶联受体；NCS，新生小牛血清；磷脂酰肌醇；磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B；SH2，Src同源性2

简介

PI3Ks（磷脂酰肌醇3-激酶）催化磷脂酰肌糖醇头部基团D-3位置的磷酸化，从而合成第二信使PtdIns3P（P），PtdIn（3,4）P（P）2，铂族锡（3,5）P（P）2和PtdIns（3,4,5）P（P）三[1,2]. 我们对PI3K如何参与细胞信号传导的理解很大程度上基于两种结构不同的PI3K细胞渗透抑制剂LY294002的使用[三]和沃特曼[4]. 在胰岛素信号的情况下，这些抑制剂的使用提供了强有力的证据，表明PI3K活性对于胰岛素对细胞的广泛作用是必要的[1,5]. 然而，PI3K脂激酶家族由八种酶组成，根据序列同源性比较分为三类（I、II和III）。这些PI3K亚型具有不同的底物特异性、表达谱和调控模式[6,7]. I类PI3K分为两个亚类，IA类和IB类。只有一个IB类PI3K（p110γ），它在异三聚体GPCR（G蛋白偶联受体）的下游起作用。IA类PI3K是由催化亚基（p110）和调节亚基组成的异二聚体。调节亚单位没有催化活性，但具有两个SH2（Src同源2）结构域，促进与酪氨酸磷酸化的相互作用，并允许受体酪氨酸激酶激活。正因为如此，IA PI3K类被认为是胰岛素刺激的主要形式。在哺乳动物中，有三种不同的基因产生IA类PI3K的催化亚单位：p110α、p110β和p110δ[6,7]. p110α和p110β亚型普遍表达，而p110δ亚型主要在白细胞中表达[8]. 由于p110α和p110β是胰岛素靶组织中表达的主要形式，它们长期以来被认为是最可能参与胰岛素信号传导的两种形式的PI3K。

最近的观察表明，p110α的扩增或激活突变存在于多种肿瘤类型中[9——15]p110β参与血栓形成[16]p110δ和p110γ参与炎症过程[17,18]激发了人们对制定针对特定类别PI3K的战略的兴趣。然而，这种策略可能对正常细胞功能产生有害的副作用。这使我们重新致力于确定PI3K不同亚型在细胞信号通路中的作用。由于LY294002和沃特曼是PI3K的广谱抑制剂，它们在确定哪些亚型参与胰岛素信号传导方面没有特别有用。由于p110α-和p110β-基因敲除都是致命的，因此在小鼠中进行的基因靶向研究最初对解决这些问题没有什么价值[19——21]. 然而，杂合小鼠是可以存活的，并且已经在这些动物中研究了葡萄糖代谢和胰岛素作用[22]. p110α都不是+/−也不是p110β+/−小鼠具有胰岛素抵抗，但这两种亚型的杂合缺失导致小鼠轻度葡萄糖耐受[22]. 可以认为，这表明这两种亚型在胰岛素信号传导中存在功能冗余体内然而，很难解释这些发现，因为这些动物的p85适配器亚单位水平发生了显著变化，这也可能影响胰岛素信号表型[23,24]. 最近，一种转基因基因敲除方法已被用于产生小鼠，其中第110页α基因在单个残基处突变，产生一个等位基因，导致p110α催化失活。这种缺陷的纯合小鼠是胚胎致死性的，但杂合小鼠的p110α活性降低，这些小鼠的实验表明，p110α是胰岛素信号复合物中最重要的形式，是向下游事件发出信号所必需的[21]. 然而，针对这一点，有几项研究表明p110β在胰岛素信号传导中起着最重要的作用[25——27]. 发现CHO-IR细胞（表达人胰岛素受体的中国仓鼠卵巢细胞）中p110α或p110β的shRNA（短发夹RNA）敲除对胰岛素诱导的PKB（蛋白激酶B，也称为Akt）激活没有影响，这进一步使情况变得混乱[28]. 对这些结果的一种解释可能是，每种亚型都可以替代另一种亚型。尽管如此，所有这些研究的一般结论是，p85α/p110的每种组合都不同地参与生长因子信号通路，以实现不同的信号转导结果。

上述方法都有各种局限性，很明显，使用适当的药理学方法可以提供重要的新见解。最近，已经报道了许多化合物具有选择性抑制不同PI3K亚型的能力。这些包括p110α抑制剂[29,30]，p110β[16,30]，p110δ[31]和p110γ[32]. 使用这些抑制剂证明p110α对胰岛素信号通路是必要的[21,30]. 然而，到目前为止，这些研究只关注有限范围的细胞类型，这是否是一个普遍要求尚待观察。

我们使用了一系列异型选择性PI3K抑制剂来进一步研究PI3K的单个异型在胰岛素信号传导中的作用。我们的结果表明，p110α是胰岛素刺激CHO-IR细胞和3T3-L1细胞PKB所必需的。然而，我们发现，在HepG2细胞和J774.2巨噬细胞中，其他异构体特异性IA类PI3K抑制剂对胰岛素信号具有减弱作用。这有力地证明了这些亚型可以参与胰岛素信号传导，并且在某些情况下，胰岛素信号传导中的IA类PI3K亚型之间可能存在功能冗余。此外，我们的数据表明，亚型参与信号传递的能力和冗余程度与不同类别IA催化亚单位的相对表达水平有关。

材料和方法

材料

除非另有说明，否则试剂是从Sigma Chemicals购买的。针对磷酸化-Ser的抗体473PKB和磷酸化-Thr308PKB来自Cell Signaling Technologies。p110α、p110β和p110δ的多克隆抗体由英国伦敦路德维希癌症研究所的Bart Vanhaesebroeck博士提供[33]. 重组p85α/p110δ购自Upstate Biotechnologies。

重组PI3K的生产

为了产生其他IA类PI3K，Sf21昆虫细胞与表达N末端His标记人类p85α和野生型小鼠p110α或野生型人类p110β的杆状病毒共同感染。为了生产IB类PI3K，用表达N末端His标记牛p110γ的杆状病毒感染Sf21昆虫细胞。使用Ni-NTA（Ni2+-三醋酸硝基苯酯）超流亲和柱。通过SDS/PAGE凝胶考马斯蓝染色验证PI3K制剂的纯度，并调整杆状病毒的滴度，使IA类PI3K的p85/p110比率约为1:1。通过Western blotting和对先前描述的异型选择性PI3K抑制剂的敏感性验证了重组PI3K的多种制剂的功能真实性(表1).

表1

集成电路50选定的PI3K抑制剂对抗脂质激酶活性的价值

所有IC50如材料和方法一节所述，使用PI3K脂激酶测定多种重组蛋白制剂的值（单位：nM）。集成电路50AS252424的值已在之前报告过[32]. 结果为平均值±S。D。n个所有测定均≥3。

抑制剂p110αp110βp110δ
PIK-75型7.8±1.7343±23907±32
第103页3.7±0.518.2±1.8>500
序号30693231±22667±32401±21
TGX-221型>10008.5±0.9211±18
IC87114号>1000>100060.2±5.6
AS252424标准935>5000>5000
沃特曼宁0.572.330.40
LY294002型500973570

PI3K抑制剂的合成及生化表征

PI3K抑制剂的合成遵循如下所述的一般程序：PI-103[34]，PIK-75[35]，IC87114[36]，序号30693[37]和AS252424[32]. TGX-221的制备如[38]在第一步中，使用二-2,4,6-三氯苯基丙二酸盐代替丙二酰二氯。二-2,4,6-三氯苯基丙二酸盐是根据[16].

集成电路50基本上如前所述，使用以PI为底物的标准脂激酶活性测量值[39]. 差异在于（i）使用100μM冷ATP而不是10μM，（ii）DMSO浓度为1%而不是2%，以及（iii）[γ-33P] 使用ATP（GE Healthcare）代替[γ-32P] ATP。使用磷光成像仪屏幕（Amersham的StormImager）对TLC板进行量化。报告的IC50通过非线性回归分析（GraphPad Prism软件）基于在重组蛋白的多种制剂上重复的至少三个独立实验来确定值。

细胞培养

HepG2细胞在添加10%（v/v）NCS（新生小牛血清）、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Invitrogen）的DMEM（Dulbecco改良Eagle's培养基）（Invit罗gen）中生长。CHO-IR细胞在添加10%（v/v）NCS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Ham’s F12（Invitrogen）中生长。3T3-L1成纤维细胞在补充10%（v/v）FBS（胎牛血清）（Invitrogen）、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中生长。J774.2细胞在添加10%（v/v）NCS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基（Invitrogen）中生长。

3T3-L1细胞的分化

3T3-L1成纤维细胞取自美国型培养物收集中心（A.T.C.C.，Manassas，VA，U.S.A.）。允许细胞汇合，并诱导其分化，如前所述[40]. 简言之，在汇合后2天（第0天），在含有10%（v/v）FBS的DMEM中添加100 nM胰岛素、1μM地塞米松和0.25 mM IBMX（异丁基甲基黄嘌呤，每隔2天用10%（v/v）FBS取代DMEM。细胞接种在6孔板中进行Western印迹和葡萄糖摄取实验，并在刺激前16 h在含有0.2%（w/v）BSA（ICP-Bio）、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无血清培养基中饥饿。

蛋白质分离、免疫沉淀和免疫印迹

用冰镇PBS（140 mM NaCl，3 mM KCl，6 mM Na）清洗细胞两次2高性能操作4，1 mM千赫2人事军官4pH 7.4），并用裂解缓冲液{20 mM Tris/HCl、138 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl溶解2，1 mM氯化钙2，5%（v/v）甘油，1%（v/v）壬烯醚P40，5 mM EDTA，20μM亮氨酸肽，18μM胃蛋白酶抑制素，1 mM AEBSF[4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟]，4μg/ml抑肽酶，2 mM Na三VO（旁白）4，20 mM NaF和1 mM DTT（二硫苏糖醇），pH7.4}。将裂解液放在冰上20分钟，并在14000下离心除去不溶性物质克持续10分钟。蛋白质浓度通过比色法测定[BCA（双茚二酸）；Pierce]。

蛋白质通过SDS/PAGE分离并转移到PVDF膜上（Pall公司）。将膜在含有3%（w/v）BSA或非脂奶粉的封闭缓冲液[20 mM Tris/HCl，pH 7.4，137 mM NaCl和0.5%（v/v）Tween 20]中培养1h，然后在含有抗体的封闭缓冲溶液中培养过夜。根据制造商的说明（GE Healthcare），使用辣根过氧化物酶连接二级抗体（Dako）和ECL®（增强化学发光）检测免疫反应蛋白。使用富士FLA-3000荧光成像仪和富士图像仪软件对信号进行分析和量化。

对于免疫沉淀，通过在4°C下与蛋白A–Sepharose孵育30分钟，将裂解产物提交至预清除。p85α的N-SH2结构域的多克隆抗体与蛋白A–Sepharose预孵育，然后加入清除的裂解物，并在4°C下孵育过夜。免疫复合物用裂解缓冲液洗涤两次，然后溶解在1×Laemmli样品缓冲液中。

统计分析

结果以平均值±S表示。图例中显示了实验次数。使用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验评估统计学显著性。

结果

异型体特异性PI3K抑制剂的表征

IA类异构体特异性抑制剂(图1)如材料和方法一节所述合成，并在在体外使用多种重组p85/p110制剂进行PI3K检测(表1). 这是关于PIramed化合物SN 30693选择性的首次报道，我们发现它是一种广谱PI3K抑制剂，但对p110α有一定的选择性。我们的结果与以前的研究结果基本一致，这些研究发现PIK-75和PI-103是p110α的选择性抑制剂[30]TGX-221对p110β有选择性[16]IC87114对p110δ具有选择性[30,31]. 然而，值得注意的是，我们的结果与Knight等人的结果略有不同[30]就绝对IC而言50PI-103和PIK-75的值，尤其是p110β和p110δ的相对灵敏度。原因尚不清楚，但可能与检测方法或酶来源的细微差异有关。例如，我们使用100μM ATP，而Knight等人的研究[30]使用10μM ATP。

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所选PI3K抑制剂的结构

p110α是CHO-IR和3T3-L1细胞中负责胰岛素信号传导的主要PI3K亚型

CHO-IR细胞具有10个5每个细胞的胰岛素受体[41,42]因此对胰岛素刺激极为敏感。在我们手中，1 nM胰岛素在两个位点诱导50%的最大PKB磷酸化（结果未显示）。使用该限制剂量的胰岛素（1 nM），我们发现p110α特异性抑制剂PIK-75阻断了胰岛素诱导的PKB在两种血清中的磷酸化473和Thr308在CHO-IR细胞中(图2A） 以剂量依赖的方式(图2B） ，带IC5078 nM(图2C） ●●●●。PKB-Ser的磷酸化473还使用对p110α（PI-103）具有选择性的第二种结构无关的抑制剂进行阻断(图2D） ●●●●。作为对照，沃特曼（100 nM）和LY294002（5μM）也被证明可以阻断胰岛素诱导的PKB-Ser磷酸化473在CHO-IR细胞中(图2E） 。相反，p110β抑制剂（TGX-221）即使在高浓度下也不能抑制PKB磷酸化(图2A和​和2B）。2B） ●●●●。使用0.1、10或100 nM胰岛素也获得了类似的结果（结果未显示）。

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异型体特异性抑制剂对胰岛素诱导CHO-IR细胞PKB磷酸化的影响

将过夜保存的CHO-IR细胞与指定的PI3K抑制剂或DMSO孵育5分钟，并用胰岛素刺激或不刺激（1 nM，10分钟）。然后使用特异性抗体通过Western印迹分析全细胞裂解产物。(A类)p110α-特异性抑制剂（PIK-75100 nM）和p110β-特异性抑制剂（TGX-221100 nM）对胰岛素诱导的PKB磷酸化Ser的影响473（左）和Thr308（右）。代表性的Western blot显示在每个上部面板中，量化如下。基础水平以上的胰岛素相对刺激值取100%，所有数值均以此百分比计算。结果为平均值±S。三个独立实验的E.M.，每个实验一式三份。(B)p110α-特异性抑制剂（PIK-75）和p110β-特异性抑制物（TGX-221）对胰岛素诱导的PKB刺激的剂量-反应效应（1 nM，10 min）。(C)乙状结肠浓度-在PIK-75浓度增加的情况下获得的PKB磷酸化反应曲线。(D类)另一种结构无关的p110α选择性抑制剂（PI-103）对胰岛素诱导的PKB磷酸化刺激的剂量-反应效应（100 nM胰岛素，10分钟）。(E类)沃特曼（Wrt；100 nM）和LY294002（LY；5μM）对胰岛素刺激的PKB磷酸化的影响（100 nM胰岛素，10分钟）。这些广泛活性的PI3K抑制剂被用作对照。

Knight等人[30]之前已经证明，3T3-L1脂肪细胞中的p110α是胰岛素向PKB传递信号所必需的，该细胞模型具有许多介于CHO和CHO-IR之间的胰岛素受体[43]. 我们试图扩展这些发现，并确定这种功能是否是在分化过程中获得的。我们发现，在3T3-L1前脂肪细胞中，PIK-75对p110α的抑制降低了胰岛素诱导的PKB在两个位点的磷酸化（Ser473和Thr308) (图3A） ●●●●。PI-103具有非常相似的效果(图3B） ●●●●。另一方面，p110β抑制剂TGX-221对PKB磷酸化状态没有影响(图3A） 而沃特曼和LY294002完全抑制PKB的磷酸化(图3C） ●●●●。在完全分化的3T3-L1脂肪细胞中，p110α抑制剂（而非p110β抑制剂）可观察到类似的模式，降低胰岛素诱导的两种血清PKB磷酸化473和Thr308(图4).

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异型体特异性抑制剂对3T3-L1成纤维细胞胰岛素信号转导的影响

用指示的PI3K抑制剂或二甲基亚砜将隔夜保存的3T3-L1成纤维细胞培养5分钟，并用胰岛素刺激或不刺激（100 nM，10分钟）。然后使用特异性抗体通过Western印迹分析全细胞裂解产物。(A类)p110α-特异性抑制剂（PIK-75，100 nM）和p110β-特异性抑制物（TGX-221，100 nM）对胰岛素诱导的PKB磷酸化刺激的影响。代表性的Western blot显示在每个上部面板中，量化如下。基础水平以上的胰岛素相对刺激值取100%，所有数值均以此百分比计算。结果为平均值±S。三个独立实验的E.M.，每个实验一式三份。(B)另一种结构无关的p110α选择性抑制剂（PI-103）对胰岛素诱导的PKB刺激的剂量-反应效应。(C)沃特曼（Wrt；100 nM）和LY294002（LY；5μM）对PKB磷酸化的影响。这些广泛活性的PI3K抑制剂被用作对照。

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异型体特异性抑制剂对3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号转导的影响

用指示的PI3K抑制剂或二甲基亚砜培养过夜保存的3T3-L1脂肪细胞5分钟，并用胰岛素刺激或不刺激（100 nM，10分钟）。然后使用特异性抗体通过Western印迹分析全细胞裂解产物。(A类)p110α-特异性抑制剂（PIK-75100 nM）和p110β-特异性抑制剂（TGX-221100 nM）对胰岛素诱导的PKB磷酸化刺激的影响。代表性的Western blot显示在每个上部面板中，量化如下。基础水平以上的胰岛素相对刺激值取100%，所有数值均以此百分比计算。结果为平均值±S。三个独立实验的E.M.，每个实验一式三份。(B)另外两种结构无关的p110α选择性抑制剂（PI-103和SN 30693）对胰岛素诱导的PKB磷酸化刺激的剂量-反应效应。

在HepG2细胞中，p110α是必需的，但不足以介导胰岛素信号

与3T3-L1和CHO-IR细胞相比，在人肝癌HepG2细胞系中，p110α选择性抑制剂均不能减少胰岛素诱导的PKB磷酸化(图5A和​和5B）。5B） ●●●●。即使胰岛素刺激前抑制剂的暴露时间增加到30分钟（结果未显示），情况也是如此。作为对照，100 nM的沃特曼宁和5μM的LY294002完全抑制PKB的磷酸化(图5C） 证明同时抑制所有PI3K亚型确实会阻断这些细胞中的胰岛素信号。因此，我们研究了p110β、p110δ和p110γ特异性抑制剂对胰岛素诱导的PKB磷酸化的影响。然而，这些抑制剂本身也不能减少胰岛素诱导的磷酸化对PKB的影响(图5A和​和55C） ●●●●。

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异构体特异性抑制剂对HepG2细胞胰岛素信号转导的影响

用指示的PI3K抑制剂或二甲基亚砜将经过过夜保护的人类七角细胞（HepG2）孵育5分钟，并用胰岛素刺激或不刺激（100 nM，10分钟）。然后使用特异性抗体通过Western印迹分析全细胞裂解产物。(A类)p110α-特异性抑制剂（PIK-75）和p110β-特异性抑制物（TGX-221）对胰岛素诱导的PKB磷酸化刺激的剂量-反应效应。(B)另外两种结构无关的p110α选择性抑制剂（PI-103和PI-SN 30693）对胰岛素诱导的PKB磷酸化刺激的剂量-反应效应。(C)p110δ-特异性抑制剂（IC87114）和p110γ-特异性抑制物（AS 252424）对胰岛素诱导的PKB磷酸化刺激的剂量-反应效应。沃特曼（Wrt）和LY294002（Ly）显示为对照。(D类)联合抑制剂对胰岛素诱导的PKB磷酸化刺激的影响。上面板显示了一个具有代表性的Western blot，量化如下。基础水平以上的胰岛素相对刺激值取100%，所有数值均以此百分比计算。结果为平均值±S。三个独立实验的E.M.，每个实验一式三份***P（P）<0.001; n.s，不显著。

考虑到沃特曼和LY294002的作用，我们接下来研究PI3K亚型参与这些细胞中PKB的胰岛素信号传递是否存在一定程度的冗余。为了进行这些实验，我们使用了抑制剂组合，在其浓度下，它们可以特异性地抑制其目标亚型(图5D） ●●●●。抑制p110α/p110β或p110α/p110δ可将PKB的磷酸化降低到接近基础水平，而抑制p110β/p110δ则没有(图5D） ●●●●。

在J774.2细胞中，所有IA类PI3K亚型均可介导胰岛素信号

在J774.2巨噬细胞中，胰岛素强烈增加PKB的磷酸化，100 nM沃特曼蛋白完全消除了这一作用，这表明PI3K是实现这一作用所必需的(图6). 在这些细胞中，PIK-75、TGX-221和IC87114都部分减弱胰岛素诱导的Ser磷酸化473表明p110α、p110β和p110δ都有助于这些细胞中的胰岛素信号传导，这三者都是胰岛素充分有效所必需的。

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异型体特异性抑制剂对J774.2细胞胰岛素信号转导的影响

将过夜饥饿的J774.2细胞与wortmannin（wrt；100nM）、PIK-75（50nM）、TGX-221（50nM）、IC87114（100nM）或DMSO孵育5分钟，并用胰岛素刺激或不刺激（100nM，10分钟）。然后使用识别磷酸化-Ser的抗体通过Western印迹分析全细胞裂解产物473（pS473）。上面板显示了一个典型的Western blot，量化如下。基础水平以上的胰岛素相对刺激值取100%，所有数值均以此百分比计算。结果为平均值±S。三个独立实验的E.M.，每个实验重复进行***P（P）<0.001.

异构体依赖性与每个异构体的相对表达水平和活性有关

不同IA亚型依赖性的差异可能是由于不同细胞类型内表达水平的差异。我们使用了两种方法对此进行调查。第一种是Western blotting，它可以比较不同细胞类型之间给定亚型的相对表达水平(图7A） ●●●●。这揭示了一些有趣的发现。首先，J774.2细胞表达高水平的p110β和p110δ。HepG2细胞也表达容易检测到的p110δ水平。这可能解释了为什么p110δ抑制剂只能减弱HepG2和J774.2细胞中的胰岛素信号。这些研究的另一个观察结果是，p110α选择性抑制剂完全阻断胰岛素信号的细胞类型是表达相对较高水平p110α和相对较低水平p110β和p110δ的细胞类型(图7A、 车道2–4）。

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不同IA类PI3K亚型的相对表达水平和活性的比较

(A类)使用异型体特异性抗体进行Western blotting，比较不同细胞类型中IA类p110亚型的表达水平：1区，J774.2；通道2，3T3-L1成纤维细胞；车道3，3T3-L1脂肪细胞；CHO-IR第4车道；HepG2第5车道。对于p110α检测，使用识别p85α适配器亚单位的抗体从200μg裂解液中免疫沉淀总IA活性，并装载重组蛋白作为对照（0.2μg，车道标记+）。对于p110β和p110δ检测，每种情况下加载20μg总细胞裂解液。(B——E类)使用识别p85α适配器亚单位的抗体，从所示细胞类型的20μg裂解液中免疫沉淀IA类总活性。然后在100 nM的抑制剂存在下测定PI3K活性。细胞类型为J774.2(B)，3T3-L1成纤维细胞(C)，3T3-L1脂肪细胞(D类)、CHO-IR(E类)和HepG2(F类). 结果表示为与二甲基亚砜存在下的活性相关，为平均值±S。三个独立测定的E.M。沃特、沃特曼。

不同的抗体反应性意味着蛋白质印迹法不允许直接比较给定细胞类型内每个亚型的相对水平。因此，我们使用了第二种方法，即使用p85α抗体免疫沉淀所有IA类PI3K活性。然后，我们使用同种型选择性PI3K抑制剂来评估可归因于任何特定同种型的总活性的相对量(图7B–7E). 另一种p110α选择性抑制剂PI-103的结果与使用PIK-75获得的结果非常相似（结果未显示）。这些研究的一个发现是，在3T3-L1成纤维细胞中未检测到显著的p110β活性(图7B） 但p110β在分化为脂肪细胞后成为IA类PI3K总活性的一小部分(图7C） ●●●●。这为Asano等人之前的蛋白质印迹研究提供了功能证据[27]在分化过程中，p110β表达增加。然而，p110β活性的总量仍远低于p110α。由此可知，p110α活性占所有细胞类型中IA类活性的大多数，其中p110α选择性抑制剂优先阻断胰岛素信号(图7C–7E). 同样，p110β和p110δ抑制剂有效的细胞类型具有这些亚型的最大活性。结合Western blotting数据，这些发现表明，细胞类型中给定亚型的总量是该亚型是否在胰岛素信号传导中发挥作用的重要决定因素。

讨论

以前使用广谱PI3K抑制剂沃特曼和LY294002的研究提供了强有力的证据，表明PI3K活性对胰岛素的几乎所有作用都至关重要[1,5]. 然而，PI3K不同亚型的作用还没有被广泛研究，结果有些矛盾。对3T3-L1脂肪细胞的初步研究表明，p110β在胰岛素信号传导中比p110α更重要[27]. 这些结论基于三大证据：（i）在3T3-L1细胞分化为胰岛素敏感性脂肪细胞的过程中，p110β水平显著升高，而p110α活性水平保持不变；（ii）胰岛素刺激后p110β增加，而p110α活性没有增加；和（iii）微量注射靶向p110β的中和抗体阻断胰岛素刺激的GLUT4易位，而p110α抗体则没有。后一项发现被视为p110β在胰岛素信号传导中起主要作用的直接证据。然而，这些发现受到了两项不同研究的挑战，这两项研究表明，p110α是胰岛素信号传导所必需的，而p110β则不是。其中一项研究使用了敲除小鼠，这些小鼠是p110α激酶死亡形式的杂合子[21]. 这些小鼠在葡萄糖代谢和胰岛素信号传导方面存在缺陷，这意味着p110α在胰岛素作用中具有重要作用。第二项研究使用了PI3K的异构体选择性抑制剂[30]. 在该研究中，p110α的异构体选择性药理抑制剂阻断了胰岛素的一系列作用在体外和体内而p110β抑制剂没有作用。

本研究使用一系列结构不同的IA类PI3K异构体特异性抑制剂，以扩展对不同PI3K亚型在一系列细胞类型胰岛素信号传导中作用的研究。我们使用PI-103和PIK-75的研究扩大了研究p110α在胰岛素信号传导中作用的细胞类型范围。这两种抑制剂以前都被证明是高效的p110α选择性抑制剂，它们潜在的非靶向活性也被广泛研究[30]. 这些研究表明，他们有非常不同的非目标活动模式。这意味着，将这些因素结合使用，可以高度确信所观察到的影响是由p110α引起的。此外，我们的研究扩展了以前的工作[30]通过添加一种新型PI3K抑制剂SN 30693的生物学数据，我们发现其对p110α具有一定的选择性。

此外，Knight等人的研究[30]使用了两种被描述为p110β/p110δ抑制剂的化合物（TGX-115和TGX-286），但对p110β有一定的选择性。他们发现，在他们测试的细胞类型中，这些化合物对胰岛素作用没有显著影响，并得出结论，p110β对胰岛素信号传导并不重要。为了更广泛地测试p110β在胰岛素信号传导中的作用，我们使用了另一种化合物TGX-221[16]，因为这是一种更具选择性和效力的p110β抑制剂。使用该化合物，我们提供了进一步的证据，证明p110β活性实际上对CHO-IR和3T3-L1细胞中的胰岛素信号传递不是必需的。

我们研究的主要发现是，p110α不是所有细胞类型中胰岛素信号传导所必需的，p110β和p110δ可以参与某些细胞类型。重要的是，我们已经证明，在HepG2肝癌细胞中，没有p110α抑制剂阻断胰岛素向PKB的信号传导。据我们所知，这是第一个p110α抑制剂对生长因子信号无影响的例子。肝癌细胞中的发现可能与肝细胞的功能相关，因为有证据表明胰岛素在肝脏中不像在其他组织中那样依赖p110α活性。这来自杂合子p110α敲除小鼠，其中PKB的胰岛素信号在肝脏中相对正常，但在肌肉和脂肪中严重受损[21].

我们最初的假设是，另一种IA亚型将取代p110α，但在HepG2细胞中并非如此，因为p110β和p110δ抑制剂也对胰岛素刺激PKB没有影响。然而，p110α抑制剂与p110β或p110δ抑制剂联合使用能够阻断PKB的信号传导，这提供了证据，证明这些细胞中存在p110亚型之间的功能冗余，并且当一种亚型受到抑制时，另一种亚形至少可以部分补偿。然而，结果表明p110α是该混合物中的必要成分，因为p110β和p110δ抑制剂的组合没有作用。J774.2细胞是另一种细胞类型，其中p110α不是参与胰岛素信号传导的唯一IA亚型，但在这些细胞中，所有三种亚型都可以发挥作用。

这些对特定PI3K亚型的不同依赖模式是如何产生的？一种解释可能是，异形依赖性与特定细胞中p110α、p110β和p110δ的表达水平和活性相关。例如，与其他亚型相比，p110α抑制剂主要减弱胰岛素信号的细胞（即CHO-IR、3T3-L1成纤维细胞和脂肪细胞）的p110α相对水平都很高。这与HepG2细胞和J774.2细胞形成对比，后者表达显著水平的p110β和p110δ。因此，对我们结果最可能的解释是，参与胰岛素信号传递的能力与细胞中特定亚型的活性水平有关。

为了支持这一点，我们观察到，在p110α被发现是胰岛素信号的主要亚型的敲除小鼠组织中，归因于p110α的活性非常高，归因于其他亚型的活性非常低[21]. 以前的研究也支持这一观点，研究表明，p110β或p110δ的过度表达可以改变细胞对血清的反应，表明细胞中的酶水平是参与生长因子信号通路能力的关键因素[44]. 然而，重要的是要注意，给定亚型的表达程度将由该亚型的动力学特性调节[39]. 例如，p110α对其生理底物PtdIns（4,5）的比活性P（P）2比p110β或p110δ高五倍以上[45]. 因此，p110β水平可能需要比p110α显著增加才能达到同样的效果。这可能解释了为什么3T3-L1细胞分化为脂肪细胞时观察到的p110β水平的微小增加并没有导致p110β在这些细胞的胰岛素信号中发挥重要的功能作用。

这就提出了一个问题，即为什么细胞可能需要表达不同水平的不同IA类PI3K亚型。我们推测，其目的与其说是改变PI3K的直接生长因子介导的参与和激活，不如说是允许与其他信号通路发生不同的联系，最有可能是通过p110亚型本身的差异。例如，有强有力的证据表明p110β（但不是p110α或p110δ）也可以被GPCR激活[28,46]. 因此，细胞中显著水平的p110β的存在可能允许生长因子和GPCR信号之间的协同作用。还观察到p110β对Ras活化的要求与p110α或p110δ不同[44]，表明p110β的存在可能允许生长因子和Ras信号通路之间的不同连接。此外，有人提出，异构体之间催化性能的差异可能导致不同效应途径的激活[39].

总之，我们的结果表明，所有三类IA PI3K亚型都可以参与胰岛素诱导的PKB激活，并且表明表达水平和活性是决定特定亚型参与程度的关键因素。这些发现表明，IA类PI3K信号的特异性并不来自不同p85/p110组合与上游酪氨酸磷酸化蛋白偶联能力的差异。我们认为，特异性可能是不同p110亚单位与不同信号通路相互作用的结果。

致谢

资金由奥克兰医学研究基金会、莫里斯·威尔金斯分子生物发现中心、奥克兰癌症学会研究中心和新西兰健康研究委员会提供（06/062A项目赠款）。我们感谢Phill Hawkins博士（英国剑桥Babraham研究所）和Osamu Hazeki博士（日本东京大学药物科学研究生院）提供试剂。我们感谢Cenk Suphioglu博士（莫纳什大学过敏与临床免疫学系）在制备重组PI3K方面的帮助。

工具书类

1谢泼德P.R。，威瑟斯·D·J。，Siddle K.磷酸肌醇3-激酶：胰岛素信号的关键开关机制。生物化学。J。1998;333:471–490. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2Vanhaesebroeck B.、Leevers S.、Ahmadi K.、Timms J.、Katso R.、Driscoll P.C.、。，Woscholski R.、Parker P.J.等人。，Waterfield医学博士。3-磷酸化肌醇脂质的合成和功能。每年。生物化学评论。2001;70:535–602.[公共医学][谷歌学者]
三。弗拉霍斯·C.J。，W.F.事项。，许国勇。，布朗·R·F。磷脂酰肌醇3-激酶的特异性抑制剂2-（4-吗啡基）-8-苯基-4H（H）-1-苯并吡喃酮（LY294002）生物学杂志。化学。1994;269:5241–5248.[公共医学][谷歌学者]
4Arcaro A.、Wymann M.P。沃特曼是一种有效的磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂：磷脂酰3,4,5-三磷酸在中性粒细胞反应中的作用。生物化学。J。1993;296:297–301. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5牧羊人P.R。胰岛素敏感组织中磷酸肌醇3-激酶信号传导的调节机制。生理学报。扫描。2005;183:3–12.[公共医学][谷歌学者]
6Vanhaesebroeck B.，Waterfield医学博士。不同类别的磷脂酰肌醇3-激酶的信号传导。实验细胞研究。1999;253:239–254.[公共医学][谷歌学者]
7Wyman M.P。，Pirola L.磷脂3-激酶的结构和功能。生物化学。生物物理学。行动。1998;1436:127–150.[公共医学][谷歌学者]
8Vanhaesebroeck B.、Welham M.J.、。，Kotani K.、Stein R.、Warne P.H.、。，兹韦利比尔·M·J。，Higashi K.、Volinia S.、Downward J.、Waterfield M.D。p110δ，一种新的白细胞磷脂3-激酶。程序。国家。阿卡德。科学。美国。1997;94:4330–4335. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Shayesteh L.、Lu Y.、Kuo W.、Baldocchi R.、Godfrey T.、Collins C.、Pinkel D.、Powell B.、Mills G.B.、。，格雷·J·W。PI3KCA公司与卵巢癌有关。自然遗传学。1999;21:99–102.[公共医学][谷歌学者]
10Levine D.A。，Bogomolniy F.、Yee C.J.、。，拉什·A·巴拉卡特·R·R·。，博尔根P.I。，Boyd JPIK3CA公司卵巢癌和乳腺癌的基因。临床。癌症研究。2005;11:2875–2878.[公共医学][谷歌学者]
11Velho S.、Oliveira C.、Ferreira A.、Ferriera A.C.、。，苏里亚诺·G·、施瓦茨·S·、杜瓦尔·A·、卡内罗·F·、马查多·J·C·。，Hamelin R.、Seruca RPIK3CA公司胃癌和结肠癌的突变。《欧洲癌症杂志》。2005;41:1649–1654.[公共医学][谷歌学者]
12坎贝尔I.G。，Russell S.E。，Choong D.Y.先生。H、。，蒙哥马利K.G。，Ciavarella M.L。，胡伊·C.S。F、。，克里斯蒂亚诺·B.E。，皮尔逊R.B。，菲利普斯·W·A。基因突变PIK3CA公司卵巢癌和乳腺癌的基因。癌症研究。2004;64:7678–7681.[公共医学][谷歌学者]
13Samuels Y.、Wang Z.、Bardelli A.、Silliman N.、Ptak J.、Szabo S.、Yan H.、Gazdar A.、Powell S.M.、。，里金斯·G·J。，等PIK3CA公司人类癌症中的基因。科学。2004;304:554.[公共医学][谷歌学者]
14巴赫曼·K·E。，Argani P.、Samuels Y.、Silliman N.、Ptak J.、Szabo S.、Konishi H.、Karakas B.、Blair B.G.、。，Lin C.等人PIK3CA公司该基因在人类乳腺癌中发生了高频突变。可以。生物疗法。2004;三:772–775.[公共医学][谷歌学者]
15Wu G.、Mambo E.、Guo Z.、Hu S.、Huang X.、Gollin S.M.、。，Trink B.、Ladenson P.W.、。，Sidransky D.，Xing M.不常见的突变，但常见的扩增PIK3A型甲状腺肿瘤中的基因。临床杂志。恩多克。Metab公司。2005;90:4688–4693.[公共医学][谷歌学者]
16杰克逊S.P。，Schoenwaelder S.M。，Goncalves一世、Nesbitt W.S。，Yap C.L。，赖特·C·E。，Kenche V.、Anderson K.E.、。，多普海德S.M。，袁毅，等。PI 3-激酶p110β：抗血栓治疗的新靶点。自然医学。2005;11:507–514.[公共医学][谷歌学者]
17Ruckle T.、Schwarz M.K.、。，隆美尔C.PI3Kγ抑制：走向“21世纪的阿司匹林”？Nat.Rev.药物发现。2006;5：903–918。[公共医学][谷歌学者]
18Okkenhaug K.、Bilancio A.、Farjot G.、Priddle H.、Sancho S.、Peskett E.、Pearce W.、Meek S.E.、。，Salpekar A.，Waterfield医学博士。，等。p110δPI 3-激酶突变小鼠的B和T细胞抗原受体信号受损。科学。2002;297:1031–1034.[公共医学][谷歌学者]
19Bi L.、Okabe I.、Bernard D.J.、。，努斯鲍姆R.L。缺乏PI 3-激酶p110β催化亚单位的小鼠的早期胚胎致死率。妈妈。基因组。2002;13:169–172.[公共医学][谷歌学者]
20Bi L.、Okabi I.、Bernard D.J.、。，Wynshaw-Boris A.、Nussbaum R.L。磷酸肌醇3-激酶p110α亚基缺失的纯合小鼠的增殖缺陷和胚胎致死性。生物学杂志。化学。1999;274:10963–10968.[公共医学][谷歌学者]
21Foukas有限责任公司。，Claret M.、Pearce W.、Okkenhaug K.、Meek S.、Peskitt E.、Sancho S.和Smith A.J。H、。，威瑟斯·D·J。，Vanhaesebroeck B.p110α磷脂酰肌醇-3-OH激酶在生长和代谢调节中的关键作用。自然。2006;441:366–370.[公共医学][谷歌学者]
22Brachman S.M。，Ueki K.、Engelman J.A.、。，卡恩·C·R。，坎特利L.C。磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基缺失和调节亚基对小鼠胰岛素敏感性有相反的影响。分子细胞。生物。2005;25:1596–1607. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Ueki K.、Fruman D.A.、。，Yballe C.M。，Fasshauer M.、Klein J.、Asano T.、Cantley L.C.、。，卡恩·C·R。磷脂酰肌醇3-激酶p85α和p85β调节亚基在胰岛素信号传导中的积极和消极作用。生物学杂志。化学。2003;278：48453–48466。[公共医学][谷歌学者]
24Terauchi Y.、Tsuji Y.，Satoh S.、Minoura H.、Murakami K.、Okuno A.、Inukai K.，Asano T.、Kaburagi Y.和Ueki K.等人。缺乏磷脂酰肌醇3-激酶p85α亚基的小鼠的胰岛素敏感性增加和低血糖。自然遗传学。1999;21:230–235.[公共医学][谷歌学者]
25Roche S.、Downward J.、Raynal P.、Courtneidge S.A。有丝分裂期间成纤维细胞中磷脂酰肌醇3-激酶β（p85α-p110β）的功能：胰岛素和溶血磷脂酸介导的信号转导的需要。分子细胞。生物。1998;18:7119–7129. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26Hooshmand-Rad R.、Hajkova L.、Klint P.、Karlsson R.、Vanhaesebroeck B.、Claesson-Welsh L.、Heldin C.H。PI 3-激酶亚型p110α和p110β在PDGF和胰岛素介导的信号传导中具有不同的作用。细胞科学杂志。2000;113:207–214.[公共医学][谷歌学者]
27Asano T.、Kanda A.、Katagiri H.、Nawano M.、Ogihara T.、Inukai K.、Anai M.、Fukushima Y.、Yazaki Y.、Kikuchi M.等。p110β在3T3-L1细胞分化过程中上调，有助于高胰岛素反应性葡萄糖转运活性。生物学杂志。化学。2000;275:17671–17676.[公共医学][谷歌学者]
28Kubo H.、Hazeki K.、Takasuga S.和Hazeki O.p85/p110β在GTP-结合蛋白介导的Akt活化中的特殊作用。生物化学。J。2005;392:607–614. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Hayakawa M.、Kaizawa H.、Moritomo H.、Koizumi T.、Ohishi T.、冈田M.、Ohta M.、Tsukamoto S.、Parket P.、Workman P.、Waterfield M.D。新型PI3-激酶p110α抑制剂4-吗啉-2-苯基喹唑啉及其衍生物的合成和生物学评价。生物器官。医药化学。2006;14:6847–6858.[公共医学][谷歌学者]
30骑士Z.A。，冈萨雷斯B.、费尔德曼M.E.、。，Zunder E.R。，戈登堡博士。，Williams O.、Loewith R.、Stokoe D.、Balla A.、Toth B.等人。PI3-K家族的药理学图谱定义了p110α在胰岛素信号传导中的作用。单元格。2006;125:733–747. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Sadhu C.、Masinovsky B.、Dick K.、Sowell C.G.、。，斯汤顿D.E。磷脂酰肌醇3-激酶δ在中性粒细胞定向运动中的重要作用。免疫学杂志。2003;170:2647–2654.[公共医学][谷歌学者]
32Pomel V.、Klicic J.、Covini D.、Church D.、。，Shaw J.P。，Roulin K.、Burgat-Charvillon F.、Valognes D.、Camps M.、Chabert C.等人。呋喃-2-亚甲基噻唑烷二酮类作为新型、有效和选择性的磷脂酰肌醇3-激酶γ抑制剂医学化学杂志。2006;49:3857–3871.[公共医学][谷歌学者]
33Shepherd P.R.，牧羊人。，纳韦B.T。，Rincon J.、Nolte L.A.等人。，Bevan A.P。，Siddle K.、Zierath J.R.、。，Wallberg-Henriksson H.人骨骼肌中胰岛素对磷脂酰肌醇3-激酶适配器亚基变体的差异调节。生物学杂志。化学。1997;272：19000–19007。[公共医学][谷歌学者]
34Hayakawa M.、Kaizawa H.、Moritomo H.、Kawaguchi K.-i.、Koizumi T.、Yamano M.、Matsuda K.、Okada M.、Ohta M.缩合杂芳基衍生物。国际专利。WO/2001/083456。2001 [谷歌学者]
35Hayakawa M.，Kaizawa H.，Kawaguchi K.-i.，Matsuda K.，Ishikawa N.，Koizumi T.，Yamano M.，Okada M.，大田M.咪唑啉衍生物。国际专利。WO/2001/083481。2001 [谷歌学者]
36Sadhu C.、Dick K.、Treiberg J.、Sowell C.G.、。，凯西基E.A。，Oliver A.人磷脂酰肌醇3-激酶δ抑制剂国际专利。WO/2001/081346。2001 [谷歌学者]
37沙特尔沃思S.J。，福克斯·A·J。，Chuckowree I.S.公司。，万北卡罗来纳州。，汉考克斯T.C。，贝克·S·J。，索哈尔S.，拉蒂夫M.A。药物化合物。国际专利。WO/2006/046040。2006 [谷歌学者]
38杰克逊S.P。，罗伯逊·A.D。，Kenche V.、Thompson P.、Prabaharan H.、Anderson K.、Abbott B.、Goncalves I.、Nesbitt W.、Schoenwaeld S.、Saylik D.抑制磷脂酰肌醇3-激酶β国际专利。WO/2004/016607。2004 [谷歌学者]
39甜菜C.A。，Chance E.M。，Foukas有限责任公司。，牧羊人P.R。比较Ia类磷脂酰肌醇3-激酶p110α和p110β催化亚基的脂质和蛋白激酶活性的动力学特性。生物化学。J。2000;350:353–359. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40纳韦B.T。，Haigh R.J。，海沃德A.C。，Siddle K.，Shepherd P.R。血小板衍生生长因子和胰岛素对3T3-L1脂肪细胞中磷脂酰肌醇3-激酶的分区特异性调节。生物化学。J。1996;318:55–60. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Konstantopoulos N.，Clark S.胰岛素和胰岛素样生长因子-1与粘着斑激酶平行刺激帕罗西汀的去磷酸化。生物化学。J。1996;314:387–390. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Hawley D.M。，Maddux学士。，帕特尔·R·G。，王国勇。，马穆拉P.W。，凡士通G.L。，Brunetti A.、Verspohl E.、Goldfine I.D。模拟胰岛素作用而不激活酪氨酸激酶的胰岛素受体单克隆抗体。生物学杂志。化学。1989;264:2438–2444.[公共医学][谷歌学者]
43王琦、比兰·P·J、。，Klip A.胰岛素对3T3-L1脂肪细胞和过度表达胰岛素受体的细胞中黏附蛋白的相反作用。分子生物学。单元格。1998;9:3057–3069. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Kang S.、Denley A.、Vanhaesebroeck B.、Vogt P.K。I类磷脂酰肌醇3-激酶的p110β、-γ和-δ亚型诱导的致癌转化。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2006;103:1289–1294. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45迈尔T.I。，库克J.A。，托马斯·J·E。，Radding J.A。，Horn C.、Lingaraj T.、Smith M.C。人ⅡA类磷脂酰肌醇3-激酶亚型的克隆、表达、纯化和表征。蛋白质表达纯化。2004;35:218–224.[公共医学][谷歌学者]
46Kurosu H.、Maehama T.、Okada T.、Yamamoto T.、Hoshino S.、Fukui Y.、Ui M.、Hazeki O.、Katada T.由p85和p110β组成的异二聚磷脂酰肌醇3-激酶由G蛋白的βγ亚基和磷酸酪氨酸肽协同激活。生物学杂志。化学。1997;272:24252–24256.[公共医学][谷歌学者]
文章来自生物化学杂志由提供生物化学学会