鲜血。2006年6月1日；107(11): 4458–4465.
抗原受体介导的B淋巴细胞葡萄糖代谢变化：磷脂酰肌醇3-激酶信号在糖酵解控制生长中的作用
来自马萨诸塞州Chestnut Hill波士顿学院生物和化学系。
重印：托马斯·奇尔斯（Thomas C.Chiles），波士顿学院生物系，马萨诸塞州栗子山希金斯厅414号，邮编02467；电子邮件：ude.cb@tselihc. 2005年12月13日收到；2006年1月24日接受。
摘要
B淋巴细胞的生物能量反应在遇到抗原后会发生快速变化，以提供支持生长所需的ATP和合成代谢前体。然而，参与葡萄糖获取和代谢的途径尚不清楚。我们发现B淋巴细胞在B细胞抗原受体（BCR）交联后迅速增加葡萄糖摄取和糖酵解。糖酵解抑制BCR介导的生长。在进入S期之前，葡萄糖代谢从主要的糖酵解转变为包括磷酸戊糖途径。BCR诱导的葡萄糖利用依赖于磷脂酰肌醇3-激酶（PI-3K）活性，通过LY294002处理正常B细胞抑制葡萄糖摄取和糖酵解以及PI-3K调节亚基p85α缺陷的B细胞的葡萄糖利用受损可以证明。激活Akt足以增加B细胞的葡萄糖利用率。我们发现BCR和FcγRIIB的共同作用抑制了葡萄糖的利用，这表明限制葡萄糖代谢可能是FcγRIIB介导的生长停滞的重要机制。总之，这些发现表明，促生长BCR信号和生长抑制FcγRIIB信号都调节葡萄糖能量代谢。操纵这些通路可能被证明在治疗淋巴增生性疾病中有用，其中B淋巴细胞的克隆性扩增发挥作用。
介绍
作为对抗原挑战的反应，静止的B淋巴细胞退出G0细胞周期的一个阶段，并在进行基因组复制之前经历一段生长期。1,2生长对应于细胞质量的积累，伴随着尺寸的增加，并与新生大分子合成的增加有关。三-5哺乳动物细胞的生长可能是基因组复制的必要条件，这突显了其在适应性免疫中的重要性，因为抗原特异性B淋巴细胞的克隆扩增是体液免疫反应的先决条件。大多数对B细胞的研究都集中在基因的作用上，这些基因的功能对B细胞抗原受体（BCR）诱导的蛋白质合成和增加细胞大小很重要。4,5然而，人们认识到，抗原受体触发的大分子合成和基因表达对淋巴细胞具有巨大的生物能量需求。5,6因此，B细胞对抗原挑战反应的一个基本方面是提供代谢底物，为细胞生长提供ATP和合成代谢前体，这在体内可能是至关重要的。
早期对凝集素刺激胸腺细胞的研究强调了葡萄糖摄取和分解代谢在为大分子合成提供能量和碳方面的重要性。7,8此外，当有足够的葡萄糖可用时，增殖的胸腺细胞主要通过糖酵解分解代谢来满足其ATP需求。9人们普遍认为，葡萄糖代谢是由稳态机制调节的，哺乳动物细胞通过调节营养吸收和分解代谢来应对ATP/ADP比率降低，以满足对ATP和大分子前体的增加需求。最近的工作为能量代谢的调节带来了新的见解，这表明细胞的生物能量活动不仅由增加的ATP需求控制，还可能由直接调节养分吸收和代谢的信号转导途径协调。10-12
目前，人们对葡萄糖获取和利用过程中涉及的细胞内信号和代谢途径知之甚少，以支持BCR参与后遇到的生物能量需求。13,14在BCR的参与下，静止的B细胞经历一段以从头RNA和蛋白质合成为特征的生长期，随后在31至48小时内进入细胞周期的S期。1,2磷脂酰肌醇3-激酶（PI-3K）活性抑制剂治疗早期G细胞1细胞周期的阶段阻碍了细胞大小的持续增加，这表明抗Ig刺激的B细胞在缺乏PI-3K活性的情况下无法进行基因组复制是由于关键生长检查点的阻滞所致。15有人认为，在这种情况下，生长受损可能是由于无法产生Rel/NF-κB——以及c-myc公司依赖性基因表达程序。4,16,17重要的是，全基因组分析发现Myc增加了特定糖酵解酶基因的表达。18-20因此，在缺乏PI-3K活性的情况下，B细胞的生长受损可能反映出无法通过糖酵解提供葡萄糖衍生的ATP和/或合成代谢前体。考虑到这一点，我们试图确定B淋巴细胞是否增加了对BCR参与的葡萄糖利用，并确定将抗原受体与葡萄糖能量代谢联系起来的信号传导和代谢途径。
材料和方法
抗体和试剂
抗磷酸（Ser473）Akt和抗磷酸（Thr389）p70S6激酶抗体（Ab）来自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）。抗谷氨酸1抗体来自Research Diagnostics（马萨诸塞州康科德）。PE结合F（ab′）2山羊抗兔IgG片段来自CalTag实验室（加利福尼亚州伯林盖姆）。抗CD16/CD32（FcγIII/II受体）2.4G2单克隆抗体（mAb）和Cytofix/Cytoperm试剂盒购自BD Biosciences（加州圣何塞）。F（ab′）2山羊抗鼠IgM片段来自Jackson ImmunoResearch Labs（宾夕法尼亚州西格罗夫）。F（ab′）2从ICN Cappel（Aurora，OH）获得兔抗小鼠IgG和兔抗小鼠IgG的片段。Wortmannin、雷帕霉素和LY294002是从CalBiochem-NovaBiochem（加利福尼亚州圣地亚哥）获得的。霍乱毒素亚单位B（CT-B）–Alexa Fluor 488来自Invitrogen分子探针（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。使用生物红蛋白分析染料试剂（加利福尼亚州Hercules生物红实验室）对全细胞提取物进行蛋白质测定。21
脾B淋巴细胞分离
BALB/c小鼠和p85α缺陷小鼠（BALB/cAnNTac-Pik3r1 N12）是从Taconic Farms（Germantown，NY）获得的，饲养在波士顿学院。按照美国国立卫生研究院和波士顿学院的指导方针，始终对小鼠进行护理和处理。如前所述，纯化8至12周龄小鼠的脾B细胞，并在RPMI 1640培养基和10%FCS中培养。21然后通过Hodgkin等人描述的不连续Percoll梯度离心分离小而致密的B细胞。22表达肉豆蔻酰化Akt-雌激素受体融合（Akt-mER）的A20细胞系由Michael Gold博士（不列颠哥伦比亚大学微生物与免疫学系）提供。23
葡萄糖摄取
B细胞以3×10的速度重新悬浮7/吸收缓冲液中的mL（10 mM HEPES[pH 7.4]，136 mM NaCl，4.7 mM KCl，1.25 mM CaCl2和1.25 mM MgSO4). 通过将200μL B细胞与含有200μM 2-脱氧的200μL摄取缓冲液混合来启动转运-d日-葡萄糖（2-DOG）和2μCi（7.4×104Bq）/mL[三H] 2-DOG（Amersham Biosciences，新泽西州皮斯卡塔韦）。在指定的时间，将50μL运输混合物加载到每40μL 20%高氯酸200μL溴代癸烷的不连续梯度上，然后在14000℃下离心梯度克（90秒）。24离心后，倾析上层水和溴代癸烷层，收集高氯酸相，并将其放入装有5 mL闪烁鸡尾酒的小瓶中。然后通过液体闪烁光谱法对放射性进行定量。为了评估葡萄糖转运蛋白介导的葡萄糖摄取的作用[三H] 在10μM细胞松弛素B（一种有效的葡萄糖转运蛋白活性抑制剂）存在下测量2-DOG。
流式细胞术
B细胞在染色缓冲液（1mL PBS，含1%FCS/0.1%NaN）中洗涤两次三)然后用抗CD16/CD32（2.4G2）mAb-Fc封闭试剂（1:500 vol/vol）孵育20分钟（4°C）。细胞在0.1 mL染色缓冲液中清洗两次，并在250μL Cytofix/Cytoperm溶液（4°C）中重新悬浮。20分钟后，将细胞在0.5 mL Perm/Wash溶液中洗涤两次，再悬浮在0.1 mL Perm/Wash溶液中，并用1:500稀释的抗谷氨酰胺抗体或同型对照抗体（4°C）进行培养。60分钟后，将细胞在0.1mL Perm/Wash溶液中洗涤3次，然后与PE缀合的F（ab′）一起孵育2山羊抗兔IgG片段（1:800）1小时（4°C）。然后在0.1 mL Perm/Wash溶液中清洗细胞，在BD-FACSCanto细胞仪上通过流式细胞术测量谷氨酸染色，并通过FACSDiva软件（BD-Biosciences）分析数据。
间接免疫荧光
使用Cytospin（Thermo Electron，Pittsburgh，PA）将脾B细胞离心到玻璃载玻片上，并在22°C下与5μg/mL CT-B–Alexa Fluor 488孵育30分钟。用PBS清洗玻片一次，并在3.7%（vol/vol）甲醛中培养20分钟（22°C）。在0.5%（vol/vol）Triton X-100中进行渗透（5分钟），然后将载玻片在2%（wt/vol）BSA（22°C）中封闭30分钟。将载玻片与抗谷氨酸1兔多克隆抗体孵育1小时（22°C），然后与TRITC结合的山羊抗兔IgG孵育（Jackson ImmunoResearch Labs）。用PBS清洗4次后，用Aqua Polymount安装载玻片，并在488 nm激发下通过共焦激光扫描显微镜进行分析（Leica TCS SP2共焦显微镜；德国Wetzlar Leica Microsystems）。使用100×/0.53数字孔径物镜对图像进行可视化。使用徕卡共焦软件2.61版采集图像。
葡萄糖利用率测量
B电池（106细胞/0.5 mL）与[5-三H] 葡萄糖（Amersham Biosciences）90分钟。抗Ig诱导的糖酵解的初始速率在180分钟内保持线性。在指定的时间，取下100μL细胞，置于含有50μL 0.2 N HCl的1.5 mL微离心管中。然后将微离心管放置在含有0.5 mL水的20 mL闪烁瓶中，并加盖和密封小瓶。三H（H）2O从未代谢中分离出来[三H] 蒸发扩散葡萄糖48小时（25°C）。通过液体闪烁光谱法定量扩散和未扩散氚的量，并与含有[5]的平行小瓶进行比较-三H] 仅葡萄糖和三H（H）2O独自一人。14葡萄糖分解代谢产生的三羧酸（TCA）循环流量通过14一氧化碳2[6的生产-14C] 葡萄糖（Amersham Biosciences）。14根据制造商的说明，使用从西格玛诊断公司（密苏里州圣路易斯）获得的化验结果测量葡萄糖和乳酸。
核磁共振波谱
B电池（3×107)在含有10 mM的RPMI 1640中培养-13C] 葡萄糖或[2-13C] 葡萄糖（马萨诸塞州安多佛市剑桥同位素实验室）。用1 mL 70%（vol/vol）乙醇提取B细胞3次。避免清洗颗粒细胞，因为这会导致大量乳酸流出。将可溶性乙醇提取物合并，在液氮中冷冻，并冷冻干燥。然后将干燥材料重新悬浮在0.5 mL D中2O代表128°C下的H NMR分析。1H和13C型联轴器1如前所述，使用配备5 mm间接检测探针的瓦里安INOVA 500分光光度计（瓦里安，加利福尼亚州帕洛阿尔托）获取H光谱。25简而言之，传统1使用5006.6 Hz扫描宽度、9984个基准点、90度脉冲宽度、3.0秒循环延迟时间和128个瞬态，获得了H NMR谱。一维异核多量子相干（HMQC）光谱（仅检测耦合到13C） 扫描宽度为7509.6 Hz，2048个基准点，90度脉冲宽度，1.0秒循环延迟时间13C已解耦。对于13C解耦，平均单键1H（H）-13C J耦合常数设置为135赫兹。使用4000个瞬态获得光谱。在这些采集条件下，乳酸-甲基双链不会被分解，但早期小分子的积分强度可以很容易地量化。
结果
BCR参与导致PI-3K依赖性葡萄糖摄取和谷氨酸1表达增加
我们试图确定BCR信号是否调节B细胞的葡萄糖摄取。为此，小而致密（静止）的脾B细胞表现出相对较低的2-DOG摄取率，而用10μg/mL F（ab′）刺激2抗鼠IgM（anti-Ig）片段持续15小时，导致2-DOG摄取量增加约10倍(). 抗Ig刺激的2-DOG摄取的初始速率在大约90秒内呈线性，并被判断为特异性，因为促进葡萄糖转运蛋白抑制剂细胞松弛素B阻止了2-DOG的摄取增加(，插图）。BCR交联在几分钟内诱导PI-3K活化，从而激活Akt和p70S6激酶。15为了确定PI-3K活性对BCR结扎后葡萄糖摄取增加是否必要，使用LY294002和沃特曼抑制PI-3K。在LY294002存在下，与未经处理的B细胞相比，抗-Ig刺激的葡萄糖摄取显著降低(). 用沃特曼素预处理B细胞也能抑制抗-Ig诱导的葡萄糖摄取，但程度与LY294002不同(). PI-3K抑制剂的功效已被证明，因为用LY294002或沃特曼蛋白预处理B细胞可以阻断BCR诱导的Ser473上的Akt磷酸化(). 为了确定哺乳动物同源物mTOR的作用，我们测试了mTOR抑制剂雷帕霉素对抗Ig诱导的葡萄糖摄取的影响。在几项实验中，雷帕霉素仅对抗Ig诱导的葡萄糖摄取有中度抑制作用(). 重要的是，雷帕霉素抑制了Thr389上抗-Ig诱导的p70S6激酶磷酸化，这依赖于mTOR，表明所用雷帕霉素的浓度足以抑制mTOR(). 这些数据表明，BCR结扎可增加葡萄糖转运，并通过依赖PI-3K活性的途径实现。
BCR的参与增加PI-3K依赖性途径中的葡萄糖摄取。（A） 在没有（Med）或存在10μg/mL抗-Ig（Ig）的情况下培养脾脏B细胞15小时。吸收2-[三H] 脱氧葡萄糖在存在或不存在10μM细胞松弛素B的情况下测量60秒。运输代表总2-[三H] 脱氧葡萄糖摄取（cpm/106细胞/秒）减去在10μM细胞松弛素B存在下的摄取。（插图）脾脏B细胞在10μg/mL抗Ig（Ig）存在下培养15小时。收集细胞，初始摄取2-[三H] 如“材料和方法”中所述，在存在（底线）或不存在（顶线）10μM细胞松弛素B的情况下，测量指定时间（以秒为单位）的脱氧葡萄糖-[三H] 抗Ig刺激的B细胞中的脱氧葡萄糖在90秒内呈线性。（B） 在没有（Ig）或存在10μM LY294002（Ig+LY）、50 nM沃特曼（Ig+沃特）或20 nM雷帕霉素（Ig~+Rap）的情况下，也用10μg/mL抗-Ig（15小时）刺激平行B细胞。然后收集细胞，2-[三H] 测定脱氧葡萄糖摄取量。抑制剂对2-[三H] 仅在培养基中培养的B细胞的脱氧葡萄糖摄取（数据未显示）。误差条反映了与三次测量平均值的标准偏差，面板A-B的数据代表了3个独立实验。（C） 用10μM LY294002（LY）、50 nM沃特曼（Wort）或20 nM雷帕霉素（Rap）预处理B细胞30分钟，并在单独培养基（M）中培养或用10μg/mL抗-Ig（α-Ig）刺激15分钟。制备细胞裂解物，并通过Western blot监测Ser473上的Akt和Thr389上的p70S6K的磷酸化。21这些数据代表了4个独立实验。
接下来，我们确定抗-Ig抗体引起的葡萄糖摄取增加是否归因于葡萄糖转运蛋白表达的变化。研究人员评估了谷氨酸1的表达，因为有报道称谷氨酸1是造血细胞上表达的主要促进葡萄糖转运蛋白。26虽然静止的B细胞表达谷氨酸1，但通过Western blot分析和流式细胞术测定，谷氨酸1的表达随着抗-Ig刺激的反应而增加(分别）。值得注意的是，我们还测量了单独在培养基中培养或用抗-Ig刺激12小时的非渗透性B细胞的谷氨酸1染色；抗Ig刺激后，表面Glut1表达的平均荧光强度增加了5倍（数据未显示）。用LY294002预处理的B细胞中抗Ig诱导的谷氨酸1表达反映了静止B细胞的情况，表明谷氨酸1的表达增加需要PI-3K活性(). 与这些发现一致，抗-Ig诱导的谷氨酸1表达在p85α阴性小鼠的脾B细胞中受损，表现出BCR诱导的PI-3K活性显著降低().27-29BCR诱导的野生型B细胞中的谷氨酸1表达对雷帕霉素不敏感（数据未显示）。我们还通过免疫荧光评估了B细胞Glut1的表达。为了监测表面染色，B细胞在固定前用Alexa Fluor 488-共轭CT-B孵育(，左侧面板）。CT-B与鞘糖脂结合，与GM1有很强的亲和力，因此可以用作质膜标记物。30静止的B细胞显示出相对较低水平的抗谷氨酸1抗体染色，这种染色随着BCR的参与而增加().
BCR交联增加谷氨酸1的表达。（A） B细胞在不存在（Med）或存在10μg/mL抗Ig（αIg）的情况下培养12和24小时。制备细胞裂解物，并用Western blot检测等量的总蛋白的谷氨酸1和Mek-1蛋白水平；后者用作加载控制。脑和肾裂解物分别作为组织来源，表达相对较高和较低水平的谷氨酸1。（B） 在无（Med）或有10μg/mL抗-Ig（α-Ig）的情况下培养B细胞6小时和12小时，然后通过流式细胞仪测定谷氨酸1的表达。用10μM LY294002预处理平行B细胞30分钟，然后用抗-Ig刺激12小时（α-Ig 12小时+LY）。还从p85α缺陷小鼠中分离出B细胞，在没有（Med）或有10μg/mL抗Ig（αIg）的情况下培养12小时，然后通过流式细胞术测定谷氨酰胺1的表达。在野生型和p85α缺陷型分析中，对照Ab表明用10μg/mL抗-Ig刺激12小时的B细胞的同种型匹配对照染色。在未显示的数据中，B细胞的抗MHC抗体染色在所有条件下都是相似的。（C） B细胞在单独培养基（Med）中培养或用10μg/mL抗-Ig（α-Ig）刺激12小时。按照“材料和方法”中的描述，用Alexa Fluor 488-共轭CT-B和抗谷氨酸抗体对细胞进行染色。这些数据是3个独立实验的代表性数据。
BCR交联后糖酵解途径增加的葡萄糖分解代谢需要PI-3K活性
为了研究葡萄糖摄取增加的意义，我们评估了BCR信号是否增加了葡萄糖流入参与葡萄糖分解代谢的几个代谢途径的流量。的生成[三H] 小时2[5脱水产生的O-三H] 糖酵解途径中倒数第二步烯醇化酶催化的葡萄糖被监测为糖酵分解的读数。12静止的B淋巴细胞表现出可测量的糖酵解率，尽管相对较低(). 在12小时时，抗Ig刺激的B细胞增加了糖酵解，糖酵分解持续增加31小时，并在至少48小时内保持升高(). 在1 mM 2-DOG存在下，BCR诱导的糖酵解被抑制90%以上()是一种有效的糖酵解抑制剂。31BCR参与后糖酵解增加被LY294002或沃特曼阻断，在较小程度上被雷帕霉素阻断(). 为了证实这些发现，我们检测了从缺乏PI-3K p85α亚单位的小鼠体内分离的脾B细胞。21,29与野生型B细胞相比，我们观察到p85α阴性B细胞中BCR诱导的糖酵解显著受损(). 为了了解糖酵解增加的生物学意义，我们用1 mM 2-DOG和抗-Ig培养静止的B细胞。通过平均前向散射评估，2-DOG阻断了抗-Ig反应中细胞大小的增加(). 此外，2-DOG阻断了蛋白质含量的增加，以应对抗-Ig(). 值得注意的是，在18小时测量时，2-DOG使细胞数量减少了11%（数据未显示）。综上所述，这些结果表明糖酵解通量对BCR诱导的B细胞生长是必要的。
BCR参与以PI-3K依赖的方式增加糖酵解。（A） 静止脾脏B细胞在不存在（t=0小时）或存在10μg/mL抗Ig的情况下培养(♦). 抗Ig刺激的B细胞也用1mM 2-DOG（2DOG）培养12小时（▵）。在指定时间前90分钟，B细胞培养物补充[5]-三H] 然后按照“材料和方法”中的描述测量葡萄糖和糖酵解。每个时间点的标准偏差小于三次测量平均值的5%，数据代表了3个独立实验。（B） 在用10μM LY294002（Ig+LY）、50 nM沃特曼（Ig+Wort）或20 nM雷帕霉素（Ig+/Rap）预处理30分钟，然后用10μg/mL抗Ig（Ig）刺激18小时的平行B细胞中进行糖酵解。抑制剂对仅在培养基（Med）中培养的B细胞的糖酵解没有明显影响（数据未显示）。（C） 来自野生型（WT）和p85α缺乏（KO）小鼠的脾B细胞在没有（培养基）或存在10μg/mL抗-Ig（Ig）的情况下培养。在指定时间前90分钟，测量糖酵解。每个条件的标准偏差小于平均值的5%。（D） B细胞在单独培养基（Med）中培养，或在不存在或存在1mM 2-DOG的情况下用10μg/mL抗-Ig（Ig）刺激18小时。然后采集细胞进行流式细胞术分析，以确定其大小（平均fwd散射）和总细胞蛋白含量。根据制造商的建议，使用生物红蛋白分析染料试剂对细胞总提取物中的蛋白质进行测定。21（E） B细胞在单独培养基（培养基）中培养或用10μg/mL抗-Ig（Ig）刺激指定时间，然后测量分泌到组织培养基中的乳酸量。数据以毫升/升（mmol/L）表示。在面板D-E中，误差条反映了与三次测量平均值的标准偏差，数据代表了3次独立实验。
在这些实验过程中，我们观察到BCR交联后糖酵解的增加伴随着乳酸的产生(). 我们估计，在24小时和48小时检测时，抗Ig刺激的B细胞消耗的葡萄糖中，有80%以上（通过培养基中的葡萄糖消耗进行测量）转化为乳酸。对这一解释的一个重要警告是，除葡萄糖外的碳源可能有助于乳酸库的形成（例如，谷氨酰胺通过苹果酸和PEP-羧激酶的不完全氧化）。为了更全面地评估葡萄糖代谢，我们比较了抗Ig刺激B细胞中放射性标记葡萄糖通过糖酵解途径和TCA循环的流量。与通过TCA循环流量的葡萄糖氧化相比，通过糖酵解途径的葡萄糖流量很大(). 因为14一氧化碳2在这些分析中产生的是[6-14C] 葡萄糖，我们不能完全排除某些葡萄糖可能通过“截断的”TCA循环被不完全氧化的可能性。
表1。
| 12小时 | 24小时 | 48小时 |
|---|
| 糖酵解，nmol/106细胞/分钟 | 0.50 | 1.11 | 1.39 |
| TCA循环，nmol/106细胞/分钟 | 0.031 | 0.017 | 0.020 |
核磁共振波谱揭示活化B淋巴细胞葡萄糖分解代谢的变化
接下来，我们试图进一步了解BCR信号在控制葡萄糖碳流中的作用。我们的方法是使用1核磁共振氢谱实验，专门监测13[1的C固定-13C] 通过只选择代谢物将葡萄糖转化为代谢物1H耦合到13C核。25我们偏爱1核磁共振氢谱（H NMR），因为它可以立即跟踪葡萄糖代谢，以响应BCR的参与，而生化分析用于未表现出必要的敏感性，无法在抗-Ig刺激反应早期（即0至8小时）重复监测葡萄糖利用率的变化。正常情况下几乎没有可检测到的差异1在最初的8小时内，静态和抗Ig刺激的B细胞之间的H谱，通过将乳酸甲基和谷氨酸甲基的共振积分为抗Ig激发后时间的函数来量化（数据未显示）。然而，使用1D-HMQC序列选择连接到13在静止和抗Ig刺激的B细胞中，C可以充分跟随葡萄糖代谢(分别）。集成13C型联轴器1H共振表明，乳酸甲基和谷氨酸甲基烯均表现出增加13C内容作为[1-13C] 在抗-Ig刺激的最初8小时内，葡萄糖被代谢(). The specific increase in13可以通过将13C型联轴器1H共振对总积分1H共振积分(). 这些数据表明，葡萄糖利用率提高13C从[1并入乳酸的甲基-13C] 血糖在BCR介入后2小时内明显升高。谷氨酸池也增加了13C含量对BCR连接的反应。值得注意的是13TCA循环中间产物α-酮戊二酸转氨作用生成谷氨酸C-4的C标记反映了[1-13C] TCA循环中的葡萄糖。谷氨酸的C-3也变成13标记为物质的C重复经过TCA循环和对称的中间产物琥珀酸。在未显示的数据中，我们观察到13谷氨酸C标记物在12小时前适度增加，24小时后下降至与静止的B细胞类似的水平。
1B细胞葡萄糖代谢物的核磁共振波谱。B细胞在含有10 mM[1的培养基中培养-13C] 在不存在（A）或存在（B）10μg/mL抗-Ig的情况下持续8小时。然后按照“材料和方法”中的描述，用1D-HMQC分析细胞13[1中的C-13C] 葡萄糖代谢为乳酸甲基和谷氨酸甲基。（C-D）成立[1-13C] 葡萄糖转化为乳酸甲基(▪) 和谷氨酸C4H（H）2（•）和C三H（H）2（○）抗Ig刺激的B细胞池。（C） 耦合到的质子的积分强度13C在1D-HMQC实验中选择。（D） 特定13BCR交联后乳酸和谷氨酸池中的C含量随时间变化。（E） 成立[1-13C] BCR交联（8小时）后，在没有（对照组）和使用10μM LY294002（+LY）、50 nM沃特曼（+麦芽汁）或20 nM雷帕霉素（+rap）预处理（30分钟）的情况下，将葡萄糖转化为B细胞中的代谢物。增加了13C含量（与静止B细胞中的相同代谢物相比，其中13乳酸甲基（黑条）和谷氨酸亚甲基（开条）的C含量为1.0）13显示了每种谷氨酸亚甲基碳的C摄取）和柠檬酸亚甲基（灰色条）作为对照。（F）13在指定时间（h）内，B细胞抗-Ig刺激后，C葡萄糖并入乳酸并代谢为乳酸；[1-13C] 甲基的葡萄糖标记（•）；[2-13C] 甲基葡萄糖标记(▪) 和蛋氨酸组（○）。（G）戊糖磷酸途径产生的乳酸分数基于13CH中的C标签分布三组作为用[2孵育的B细胞抗-Ig刺激后时间的函数-13C] 葡萄糖。每种谱中的积分尺度都是任意的。
我们进行了类似的1D-HMQC实验，以评估PI-3K活性在BCR诱导的13C从【1】成立-13C] 葡萄糖转化为乳酸的甲基。在经BCR刺激8小时的B细胞中，掺入13C标记比静止的B细胞增加约3.5倍(，控制）。成立13谷氨酸碳中的C标记也增加了约2.7至2.8倍。柠檬酸盐池，其中大部分来自组织培养基，在激活期间没有明显标记。阻断沃特曼或LY294002预处理B细胞13C掺入乳酸盐和谷氨酸盐()而雷帕霉素对13C固定到乳酸或谷氨酸中(，+说唱）。
由于来自戊糖磷酸途径的几个葡萄糖衍生代谢物可以进入烯醇化酶上游的糖酵解途径，因此本文使用的2-磷酸甘油酯的脱水反应可以反映通过糖酵化和戊糖磷酸路径的葡萄糖分解代谢。为了监测葡萄糖向磷酸戊糖途径的转移，用[2-13C] 葡萄糖。如果[2]-13C] 用葡萄糖代替[1-13C] 葡萄糖，就没有了13通过糖酵解途径将C并入乳酸甲基；然而，如果戊糖磷酸途径可以运行，13C将并入乳酸的甲基。[1-13C] BCR参与后葡萄糖迅速标记乳酸甲基(, •). 与[2培养的B细胞平行-13C] 葡萄糖，无显著性13BCR交联24小时前，在乳酸甲基组中检测到C掺入(, ▪). 作为13来自[2]的C标签-13C] 葡萄糖出现在乳酸甲基组，它从乳酸的甲基组耗尽(，○），这一发现与糖酵解途径降低葡萄糖分解代谢和戊糖磷酸途径增加分解代谢相一致。48小时内，[2-13C] 通过戊糖磷酸途径的葡萄糖流量约占总乳酸生成量的60%(). 这些结果表明，受刺激的B细胞通过G1/S转变，葡萄糖代谢发生转变，从最初的糖酵解转变为包括戊糖磷酸途径。
条件激活Akt可增加B细胞的葡萄糖利用率
使用表达肉豆蔻酰化Akt-ER融合蛋白（Myr-Akt-ER）的小鼠A20 B细胞来确定葡萄糖利用是否取决于PI-3K的下游靶点Akt活化。Myr Akt-ER在A20细胞中组成性表达，但在缺乏4-羟基三苯氧胺（4-HT）的情况下仍然不活跃。23表达Myr Akt-ER的A20 B细胞在单独培养基中培养或用抗-Ig刺激后，未检测到Myr Act-ER Ser473磷酸化；4-HT的加入导致Ser473磷酸化增加，这是一种与催化活性相关的修饰(). 与未经处理的A20 B细胞相比，经4-HT处理的A20B细胞的葡萄糖摄取量增加(). Myr-Akt-ER融合蛋白的激活也导致了比未处理的A20 B细胞更高的糖酵解通量(). 在未显示的数据中，表达空载体的A20 B细胞对4-HT的反应没有表现出葡萄糖利用率的变化。与未处理的A20 B细胞相比，暴露于4-HT并没有改变表达Myr Akt-ER的A20 C细胞的增殖，这表明总大分子合成是等效的（数据未显示）。这些发现表明Akt激活足以增加A20B细胞的葡萄糖利用率。
A20 B细胞中Akt的条件性激活增加了葡萄糖利用率。（A） 在不存在或存在4μM 4-HT或10μg/mL抗-Ig（α-Ig）的情况下培养组成性表达Akt-mER融合蛋白的A20细胞5分钟和30分钟。然后采集细胞，通过Western blot监测Ser473上Akt-mER（Myr-Akt-ER）的磷酸化。组成性表达Akt-mER融合蛋白的A20细胞在没有或存在4μM 4-HT的情况下培养24小时，然后摄取2-[三H] 脱氧葡萄糖（B）和糖酵解（C）的测量如“材料和方法”所述。在面板B-C中，误差条反映了与三次测量平均值的标准偏差。
BCR和FcγRIIB的结合阻断葡萄糖利用
FcγRIIB是Ig的Fc部分的低亲和力受体，以IgG免疫复合物作为其生理配体。32BCR与FcγRIIB的聚集激发了一个主要的抑制信号，阻止BCR参与诱导的B细胞生长，最终导致凋亡。33-35FcγRIIB通过减少磷脂酰肌醇3-激酶产物的积累，并将含有SH2-的肌醇-5-磷酸酶补充到FcγRAIB中，水解PIP，从而抑制BCR信号传导三，并抑制远端Akt激活。36,37因此，我们测试了FcγRIIB的协同作用是否抑制BCR交联诱导的葡萄糖利用。与F（ab′）相比，与BCR和FcγRIIB共聚的完整抗Ig显著降低了Ser473的Akt磷酸化水平2抗-Ig片段(). 抑制Akt磷酸化需要FcγRIIB参与，因为与完整抗-Ig+单抗2.4G2孵育的B细胞显示出与BCR单独交联相当的Ser473磷酸化水平。与仅通过BCR刺激的B细胞相比，BCR和FcγRIIB的共聚集导致葡萄糖摄取减少约82%(). 完整的抗-Ig抗体还阻断BCR诱导的谷氨酸1表达和糖酵解(分别）。中描述的1D-HMQC实验还显示，用完整抗-Ig处理的B细胞表现出减少13C并入乳酸和谷氨酸(). 这些结果表明，限制葡萄糖利用可能是FcγRIIB抑制B细胞生长的重要机制。
BCR和FcγRIIB的共交联抑制BCR诱导的葡萄糖利用。（A） B细胞在单独培养基（Med）或10μg/mL F（ab′）中培养2抗鼠IgG（αIg）片段15分钟。在存在或不存在10μg/mL 2.4G2 mAb的情况下，用10μg/mL完整的抗鼠IgG（wIg）培养平行B细胞。然后通过Western blot评估细胞对Ser473和β-actin的Akt磷酸化。（B） B细胞在10μg/mL F（ab′）的单独培养基（Med）中培养2抗小鼠IgG（IgG）片段或10μg/mL完整的抗小鼠IgG（wIg）12小时。然后分析细胞2-[三H] 脱氧葡萄糖摄取如所述（C）通过流式细胞术监测在单独培养基（Med）中培养并用10μg/mL F（ab′）刺激的B细胞中Glut1的表达2抗鼠IgG（anti-Ig）片段12小时或与10μg/mL完整抗鼠Ig（wIg）碎片12小时。对照抗体显示用10μg/mL F（Ab′）刺激的B细胞的同型匹配对照染色2抗鼠IgG片段12小时。在未显示的数据中，B细胞的抗MHC抗体染色在所有条件下都是相似的。（D） 在如面板B所述培养的B细胞中测量糖酵解。在面板B和D中，误差条反映了与三次测量平均值的标准偏差。这些数据代表了3个独立实验。（E） 成立[1-13C] 用10μg/mL F（ab′）刺激B细胞将葡萄糖转化为代谢物2抗鼠IgG片段（对照）8小时，如同时，用10μg/mL完整的抗鼠Ig（FcR）培养B细胞。增加了13C含量（与静止B细胞中的相同代谢物相比13乳酸甲基（黑条）、谷氨酸亚甲基（开条）的C含量为1.0）13图中显示了每个谷氨酸亚甲基碳的碳吸收）和柠檬酸亚甲基（灰色条）。
讨论
本文的结果表明，BCR通过增加葡萄糖摄取和促进的谷氨酸转运体的表达来调节小密度B细胞中的葡萄糖利用。这种信号诱导反应的重要性得到了强调，因为静止的B细胞不含有显著的糖原储备。因此，针对抗原挑战发出葡萄糖转运增加信号的能力提供了一种机制，可以快速获取支持生长所需的葡萄糖衍生能量和生物合成前体。我们的结果还表明，BCR参与导致葡萄糖代谢的快速持续增加。1D-HMQC的结果显示，在BCR结扎后2小时内，糖酵解增加，之前细胞大小增加并进入细胞周期。1,2,15我们的结果还表明，B细胞与2-DOG孵育，2-DOG是一种有效的糖酵解抑制剂，是磷酸葡萄糖异构酶竞争性抑制和己糖激酶II耗竭的结果，31防止BCR触发的细胞大小和蛋白质合成增加，这表明糖酵解通量增加是B细胞生长的必要条件。
这些结果还表明，在进入S期之前，葡萄糖分解代谢从最初的糖酵解转变为包括戊糖磷酸途径。磷酸戊糖途径介导的葡萄糖分解代谢转变的生物学意义目前尚不清楚。该途径有几个目的，包括为还原生物合成提供还原辅酶NADPH，为核苷酸生物合成提供核糖5-磷酸。戊糖磷酸途径活性升高与S期进入的开始相一致，这可能反映了对5-磷酸核糖支持核酸合成的需求。然而，值得注意的是，生长因子刺激伴随着细胞内H的升高2O（运行）238-40最近的报告有力地支持了NADPH而非5-磷酸核糖对细胞增殖的需求，推测这是为了维持细胞增殖的最佳氧化还原状态。41,42
BCR参与后糖酵解的快速增加伴随着乳酸生成的增加，B细胞消耗的80%以上的葡萄糖转化为乳酸。我们计算中的一个重要警告是，非葡萄糖来源可能有助于乳酸的产生，鉴于谷氨酰胺氧化占活化T细胞中乳酸产生的33%，这一点可能非常重要。43在这个关头，我们无法消除非葡萄糖来源对乳酸生产的贡献；然而，在一个初步的1D-HMQC实验中[13C] 抗Ig刺激的B细胞（15小时）中的谷氨酰胺代谢没有伴随可测量的13C并入乳酸中（数据未显示）。这些结果表明，尽管存在完整的TCA循环，抗Ig刺激的B细胞仍进行有氧糖酵解，其特征是葡萄糖产生的乳酸增加。
本文观察到的对原代B淋巴细胞抗-Ig刺激的高有氧糖酵解反应反映了肿瘤细胞的情况。这可能反映了正常B细胞线粒体氧化降解能力有限的情况。Fitzpatrick和同事们很感兴趣14据报道，B细胞杂交瘤中丙酮酸脱氢酶水平较低，这可能是糖酵解中间产物进入TCA循环的屏障。我们注意到，为了应对细胞外葡萄糖的限制，B细胞通过增加糖酵解而不是氧气消耗进行补偿（数据未显示）。或者，遇到抗原的B细胞可以快速过渡到高糖酵解速率，以便在需要ATP和合成代谢前体支持生长、克隆扩增和Ig合成的时间内进行精确控制。44,45这将为B细胞提供将葡萄糖碳流导向磷酸戊糖途径的能力，以提供NADPH和5-磷酸核糖或将糖酵解终产物丙酮酸导向截断的TCA循环。已经证明柠檬酸盐可以被输出到细胞液中，从而作为ATP柠檬酸裂解酶的底物，生成乙酰辅酶a和草酰乙酸46; 前者是脂肪酸和胆固醇合成的前体，至少在一定程度上起到促进膜生物生成的作用。47
我们的结果还表明，葡萄糖利用率的增加是由BCR产生的初级PI-3K信号通路引起的。LY294002和沃特曼宁阻断BCR诱导的葡萄糖摄取和糖酵解的结果支持这一结论。此外，缺乏1A类PI-3K调节亚单位p85α的小鼠脾B细胞（像素3r1），表现出BCR-耦合PI-3K激活受损，28,29不能增加谷氨酸1表达和糖酵解。我们不能排除对与生长相关的ATP和/或糖酵解代谢产物减少的稳态反应，以及PI-3K信号输入，有助于糖酵解增加；然而，我们发现在没有增加生长的情况下，有条件地激活Akt足以刺激A20B细胞的葡萄糖利用。综上所述，这些发现表明，B淋巴细胞中的PI-3K/Akt信号具有调节葡萄糖利用的功能，从而为B细胞提供满足与生长相关的生物能量需求的能力。
就下游Akt效应器信号成分而言，我们的研究结果未能明确表明mTOR参与BCR诱导的葡萄糖代谢，因为雷帕霉素治疗并未显著减轻B细胞葡萄糖转运和糖酵解的增加。鉴于Akt和mTOR信号在调节造血细胞营养吸收中的重要作用，这是令人惊讶的。12,24有趣的是，据报道，雷帕霉素仅部分抑制脾脏B细胞的生长，而LY294002完全阻断了B细胞的增长。16在本研究中，NF-κB依赖性c-myc公司转录被证明对抗Ig刺激的B细胞生长至关重要。许多糖酵解基因直接受c-Myc调控的观察结果强调了该途径对本文研究结果的潜在意义。18-20此外，最近在体外脾B细胞中的基因表达谱显示，BCR参与上调了几个编码糖酵解途径酶的基因。48这些发现共同提高了PI-3K可能通过糖酵解酶编码基因的c-Myc依赖性转录将BCR与糖酵化增加联系起来的可能性。此外，葡萄糖利用增加可能通过翻译后机制进行调节。糖酵解中的关键速率限制步骤是1-磷酸果糖激酶（PFK）催化的果糖-6-磷酸磷酸化。49,50Akt已被证明能磷酸化PFK-2，PFK-2是一种生成果糖-2,6二磷酸的酶，是PFK的变构调节剂。49根据这些线索，非典型蛋白激酶C（PKC）亚型，PKCλ和PKCζ，以及Akt，与胰岛素刺激的Glut4向质膜的易位有关。50-51
总之，我们的结果首次证明了促生长BCR信号和生长抑制FcγRIIB信号都直接调节葡萄糖能量代谢。这些结果也增加了这样一种可能性，即操纵参与葡萄糖获取和分解代谢的BCR相关通路可能被证明在治疗由正常B淋巴细胞克隆性扩增引起的淋巴增殖性疾病方面有效。
致谢
我们感谢David Fruman博士（加利福尼亚大学欧文分校分子生物学和生物化学系免疫学中心）提供的有益建议。
笔记
在线预发布为血液第一版论文，2006年1月31日；DOI 10.1182/血液-2005-12-4788。
由美国公共卫生署（USPHS）拨款AI-49994（T.C.C.）支持。
M.F.R.和T.C.C.设计研究并撰写手稿，所有作者都进行了研究。
内部血液本文的分析出现在这个问题的前面。
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节，特此将本文标记为“广告”。
工具书类
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