Polycomb组基因鄂尔多斯2防止造血干细胞衰竭

MEF公司

第14天，将受精后胚胎机械分离成单个细胞，并在含有10%FCS、青霉素和链霉素的DMEM中培养（荷兰布雷达Invitrogen）。MEF每3-4天传代一次，用台盼蓝排斥法计数活细胞数。根据Todaro和Green计算人口倍增。³³

基因阵列分析

用RNeasy迷你试剂盒从第1代（年轻的p1）和第5代（老化的p5）MEF中分离出总RNA（荷兰文洛市齐根）。在cDNA合成过程中，样品被标记为[³³P] -脱氧胞苷三磷酸（dCTP；MP生化，加利福尼亚州欧文）。对小鼠滤过基因阵列（GF400a；研究遗传学，Invitrogen）进行杂交，并按照前面所述进行分析。³⁴通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证表达模式。

逆转录病毒载体

这个MIEV公司载体（纽约州罗切斯特市罗切斯特大学C.Jordan教授馈赠的礼物）包含一个内部核糖体进入位点（IRES）序列和增强型绿色荧光蛋白基因（eGFP）.这个MIEV公司作为克隆鄂尔多斯2IRES上游要创建的cDNAMIEV-Ezh2公司矢量(图1D).

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图1。

的表达式鄂尔多斯2在中小企业中。（A） 起初，MEF表现出快速增殖，但经过8次种群倍增后出现衰老。（B） 年轻（p1）和老年（p5）MEF的RT-PCR分析。（C） 第1代和第9代未处理MEF中Ezh2的蛋白质水平。（D） 用于过度表达的逆转录病毒载体示意图鄂尔多斯2（E）检测与对照组和对照组转导的MEF中的Ezh2蛋白鄂尔多斯2转导后不同传代的载体。（F） 的相对表达式鄂尔多斯2用控制载体转导的MEF中的mRNA(▪) 或使用包含鄂尔多斯2()在转导后的不同时期。的表达式级别鄂尔多斯2通过定量PCR测定，并计算转导后第1代与对照转导的MEF。（G） 逆转录病毒转导后MEF的生长（对照，▪；鄂尔多斯2,.

在电镀3×10后24小时，将2μg质粒DNA和Fugene 6（瑞士巴塞尔罗氏）转染生态凤凰包装细胞（加州斯坦福诺兰实验室）⁵6孔板中的细胞/孔。将转染的嗜生态凤凰包装细胞的含病毒上清液用于感染MEF和HSC。

逆转录病毒过度表达鄂尔多斯2在MEF中

MEF的电镀密度为10⁵细胞/孔在转导前24小时放置在6孔板中。在转染后48和72小时收集病毒上清液，并添加8μg Polybrene（Sigma，St Louis，MO）到MEF中。三天后GFP⁺使用MoFlo流式细胞仪（科罗拉多州柯林斯堡DakoCytomation）筛选细胞。实验分三次进行。

逆转录病毒过度表达鄂尔多斯2HSC中

如前所述，原代骨髓（BM）细胞经一些调整后转导。³⁵简言之，4天前腹腔注射150 mg/kg 5-氟尿嘧啶（5-FU；荷兰哈勒姆哈勒姆Pharmachemie Haarlem）从小鼠（CD45.1）中提取BM细胞。细胞在StemSpan（StemCell Technologies，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市）中培养48小时，补充10%FCS、300 ng/mL PEG-rrSCF（安进，千橡树，加利福尼亚州）、20 ng/mL rmIL-11（明尼阿波利斯研发系统公司）、10 ng/mL Flt3配体（安进）、青霉素和链霉素。在转染嗜生性Phoenix细胞后24和48小时收集病毒上清液，并接种在涂有50μg反转录连接素的6孔板中（日本京都高原市）。将含有病毒上清液的平板在800℃下旋转1小时克在室温下。4小时后取出病毒上清液，7.5×10⁵每孔接种培养的BM细胞和4μg Polybrene（Sigma）。在第二次转导时，添加了2μg聚brene。四天后，通过流式细胞术（FACSCalibur；Becton Dickinson，Palo Alto，CA）测定转导效率。

移植

转导后，3×10⁶将CD45.1 BM细胞移植到致命照射（9.5Gy，IBL 637¹³⁷Csγ源；CIS Biointernational，Gif-sur-Yvette，法国）受体（CD45.2）。绿色荧光粉⁺由于转导方案后没有选择细胞，所以移植包括转导细胞和非转导细胞的混合物。移植后的几个时间点，从器官后丛抽取血液，并使用Coulter计数器（加利福尼亚州Fullerton的Beckman Coulter）计算白细胞（WBC）数量。GFP百分比⁺CD45.1型⁺白细胞通过流式细胞术（FACSCalibur；Becton Dickinson）进行评估。进行了两个独立的实验。主要受试者总数为11名对照组和11名受试者鄂尔多斯2.

系列移植

初次移植后4个月，对照组和鄂尔多斯2杀死组，并通过冲洗2条后腿分离BM细胞。将未分离的BM细胞移植到致死性照射（9.5 Gy）的二级受体（CD45.2）中，限制稀释10⁶新分离的C57BL/6竞争性骨髓细胞（CD45.2）。通过外周血细胞嵌合体分析，在连续移植3个月后评估每个受体转导HSC的重建情况。GFP超过1%的动物⁺骨髓和淋巴系的移植被认为是由转导的HSC重建的。计算竞争性重新填充指数（CRI）和主要受体长期重新填充细胞的频率（LTRA）。计算CRI的公式为：CRI=[（%CD45.1⁺绿色荧光粉⁺细胞/%CD45.1⁺绿色荧光粉^-细胞）/（CD45.1比率⁺绿色荧光粉⁺/CD45.1型⁺绿色荧光粉^-细胞移植）]。整个实验重复了两次。总共有35名二级受体接受了移植鄂尔多斯2-过度表达细胞和35个受体的对照细胞。此外，还进行了二次移植，未与竞争对手共移植。总计2×10⁶将BM细胞移植到10个受致命照射（9.5Gy）的受者体内。

二次移植四个月后，进行了与二次移植相同的三次移植。对于控制和鄂尔多斯2-在过度表达细胞的情况下，共有28只受体被用于竞争性再填充分析，12只动物在没有竞争性BM细胞额外支持的情况下进行移植。

分类造血细胞群

如上所述，使用流式细胞术对不同群体的造血细胞进行分选。³⁴4个不同的种群（林^-Sca-1型^-c试剂盒^-，林^-Sca-1型⁺c试剂盒^-，林^-Sca-1型^-c试剂盒⁺，林^-Sca-1型⁺c试剂盒⁺)直接在RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）的RNA裂解缓冲液中进行分类，使用MoFlo流式细胞仪（DakoCytomation）进行基因表达分析。此外，林^-Sca-1型⁺c试剂盒⁺对细胞进行分选，以便进一步培养。

为了评估初次移植后纯化干细胞组分中的克隆形成活性，如前所述进行鹅卵石区域形成细胞（CAFC）分析。³⁶早期出现的CAFC第7天对应于相对稳定的祖细胞，而晚期出现的CAFCs第35天则反映了更原始的细胞亚群。

纯化HSC的体外分化

纯林^-Sca-1型⁺c试剂盒⁺（LSK）细胞在含有100 ng/mL PEG-rrSCF（Amgen）和10 ng/mL GM-CSF（Behringwerke，Marburg，Germany）的IMDM（Invitrogen）中培养，以刺激体外快速分化。用台盼蓝排除法测定细胞总数。在培养过程中的不同时间点分离RNA用于基因表达分析。

蛋白质印迹

细胞在PBS中重新悬浮，通过添加十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液进行裂解，并进行超声处理。蛋白质通过10%SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素。在封闭3%脱脂牛奶后，用1:100稀释的小鼠抗Ezh2单克隆抗体（M18EZH2，由荷兰阿姆斯特丹大学Swammerdam生命科学研究所的a.P.Otte教授提供^37,38)用抗鼠辣根过氧化物酶结合二级抗体（英国白金汉郡Amersham Biosciences）洗涤并孵育。使用增强化学发光（ECL）试剂（Amersham Biosciences）开发膜。用兔抗γ-微管蛋白（Sigma）验证了膜的等负荷性。

定量聚合酶链反应

使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并进行标准cDNA合成。定量PCR（qPCR）一式三份。使用SYBR Green在iCycler热循环器（加利福尼亚州Hercules，Bio-Rad）中的96 well微量滴定板上进行PCR扩增。将样本cDNA与家政基因的表达进行比较Gapdh公司和肌动蛋白使用相对定量ΔΔC_T型技术。³⁹不同LSK群体中的相对表达水平是通过首先计算达到C时形成的分子数量来估算的_T型通过校正初始使用细胞数的该值，确定相对表达。

搜索的假定目标或合作伙伴鄂尔多斯2

寻找假定的目标或合作伙伴鄂尔多斯2，我们使用了在线干细胞数据库GeneNetwork。⁴⁰我们最近描述了这个数据库的建立。⁴¹选择了GNF造血细胞U74Av2（Mar04）RMA数据库鄂尔多斯2检索了不同BXD菌株的表达水平。随后，在GeneNetwork中实现了链接分析⁴⁰用于确定鄂尔多斯2受到监管。此外，还可以确定哪些干细胞转录物表现出类似或相反的表达谱鄂尔多斯2跨越30个BXD菌株。这些成绩单是潜在的合作伙伴或目标鄂尔多斯。前100个最佳关联转录本被选中并导入WebGestalt(http://genereg.ornl.gov/webgestalt/，一个在GeneNetwork中实现的基于web的基因集分析工具包⁴⁰).

鄂尔多斯2HSC中的表达

PcG基因家族的不同成员最近被认为在HSC自我更新中起作用。^6-8相反鄂尔多斯2长期以来，还没有对HSC的再填充进行研究。量化鄂尔多斯2在不同的造血细胞群体中表达，分离BM细胞，并用血统（Lin）特异性抗体的混合物进行染色，以检测干细胞标记物Sca-1和c-kit。5%的最负血统分数(图2A)根据Sca-1和c-kit的表达在4个不同的人群中进一步亚组化(图2B)和级别鄂尔多斯2通过qPCR测定所有4个组分(图2C). 在两个单独的实验中，Lin的表达水平最高^-Sca-1型^-c试剂盒⁺人口，这是众所周知的丰富的祖先。⁴³林先生^-Sca-1型⁺c试剂盒⁺对于最原始的HSC，（LSK）种群高度富集。^44-47

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图2。

的表达式鄂尔多斯2在造血细胞中。（A） 分离不同的阴性谱系（Lin^-)来自BM的人口，林最多的5%^-选择了个细胞。（B） 林中的细胞^-根据Sca-1和c-kit表面标记对种群进行分类。（C） 的表达式鄂尔多斯2与Sca-1相关的不同Sca-1和c-kit人群中的qPCR测定结果^-c试剂盒^-骨髓细胞。（D） 林的成长^-Sca-1型⁺c试剂盒⁺细胞在GM-CSF和SCF存在下培养。（E） 的相对表达式鄂尔多斯2在用GM-CSF和SCF诱导分化后的不同时间点用qPCR监测。第0天设置为1。插入物显示扩增RT-PCR产品的凝胶分析。

接下来，纯化LSK细胞，并在GM-CSF和SCF存在下通过培养诱导分化。正如预期的那样，LSK细胞在培养的前几天表现出快速生长，并在第7天停止增殖(图2D)伴随着形态的变化（数据未显示）。在分化开始后的几个时间点鄂尔多斯2通过定量PCR进行评估。鄂尔多斯2分化时表达迅速下调(图2E).

的过度表达鄂尔多斯2HSC中

初次移植。因为鄂尔多斯2在新分离的HSC中表达，但在分化诱导培养过程中表达下调，我们希望评估强制过度表达鄂尔多斯2在HSC中。5-FU处理的BM细胞（CD45.1）与对照或鄂尔多斯2向量和3×10⁶移植细胞时未进行GFP分选⁺细胞，在致命照射的CD45.2受体中。这样鄂尔多斯2-过度表达（CD45.1⁺绿色荧光粉⁺)干细胞与相同处理但未转导的干细胞（CD45.1⁺绿色荧光粉^-)可以确定。移植后不久，外周血白细胞计数稍高(P（P）=.15）给药小鼠鄂尔多斯2骨髓细胞，但在移植后100天恢复到正常水平，并保持与对照值相似(图3A). 移植后，通过量化GFP的百分比来评估嵌合体⁺供体CD45.1内的细胞⁺细胞部分(图3B). 转导（CD45.1）的贡献没有明显的倾斜⁺绿色荧光粉⁺)观察细胞。

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图3。

的过度表达鄂尔多斯2在HSC中。（A） 对照转导BM细胞的移植小鼠的白细胞计数(▪) 或鄂尔多斯2()载体（n=每组11个受体，2个独立实验）。显示了平均值加上或减去平均值标准误差（SEM）。（B） 移植后不同时间点的嵌合现象。供体衍生的转导CD45.1的百分比⁺绿色荧光粉⁺显示WBC。显示了2个独立实验的平均值±1 SEM。（C） 对照组或对照组初次移植后约120天脾脏中Ezh2蛋白的表达鄂尔多斯2CD45.1 BM细胞。（D） 分类LSK GFP的CAFC频率⁺初次移植后120天的细胞（对照组，▪；鄂尔多斯2,). （E） 移植后3个月，分析以不同比例（2:1，⋄1:1，○；1:2，□；1:5，𕮨）竞争性移植的转导/非转导和新鲜分离骨髓细胞的二级受体嵌合水平。数值显示了两个独立实验中单个受试者的数据（n=35/组）。（F） 计算CD45.1的CRI⁺绿色荧光粉⁺（转导）与CD45.1⁺绿色荧光粉^-（非转导）细胞（见插入物）。根据第一次和第二次实验中的11只和24只小鼠（对照组，▪;鄂尔多斯2,). （G） 计算转导细胞（CD45.1）的CRI⁺绿色荧光粉⁺)与新分离的BM细胞（CD45.2⁺; 参见插入部分）。显示了第一次和第二次实验中11只和24只小鼠的平均值（+1 SEM）（对照组，▪;鄂尔多斯2,). （H） CD45.1中的LTRA频率⁺绿色荧光粉⁺在2个独立实验（对照组，▪;鄂尔多斯2,).

二次移植。原发性受体在移植后4个月死亡（在CD45.1没有偏斜的时间点⁺绿色荧光粉⁺观察到贡献）。此时点的蛋白质水平鄂尔多斯2在脾脏中进行分析。正如预期，鄂尔多斯2在接受移植的小鼠中存在较高水平的鄂尔多斯2-与对照组相比过度表达的细胞(图3C). LSK GFP公司⁺从主要受体中分离细胞并检测CAFC活性。的过度表达鄂尔多斯2导致CAFC第7天和第14天的频率显著增加，并对以后出现的子集产生更微妙的影响(图3D).

二级受体接受移植，移植时只需采集供体BM细胞，或以不同比例的新分离CD45.2竞争性重新填充⁺骨髓细胞。在移植后的多个时间点，分析受者是否存在CD45.1⁺绿色荧光粉⁺细胞。在两个独立的实验中，连续传代逆转录病毒转导的对照细胞（CD45.1⁺绿色荧光粉⁺)这些二级受体对外周血的贡献很少或没有，而鄂尔多斯2-干细胞过度表达导致(P（P）<.001）水平(图3E). CRI，比较转导细胞（CD45.1）的干细胞活性⁺绿色荧光粉⁺)具有未转化的细胞（CD45.1⁺绿色荧光粉^-)第二次移植后3个月计算。CRI是对移植细胞重建质量的测量，根据定义，CRI为1表示两个群体的干细胞潜能相等。CRI大约高出12倍(P（P）<.02）英寸鄂尔多斯2-与连续传代但未转导的干细胞（CD45.1）相比，干细胞过度表达⁺绿色荧光粉^-)单元格(图3F). 还计算了转导细胞（CD45.1）的CRI⁺绿色荧光粉⁺)与新分离的CD45.2相比⁺骨髓细胞(图3G). 单次连续移植后，干细胞质量通常会下降10倍（即CRI为0.1）¹并且在对照细胞中确实观察到。引人注目的是鄂尔多斯2在HSC中，由于CRI水平维持在1，因此完全避免了连续移植后干细胞质量的损失(图3G). CRI测量值不一定与实际干细胞频率相关。为了量化干细胞数量，我们对所有二级受体的嵌合体数据进行了限制稀释分析。髓细胞和淋巴细胞的供体细胞贡献均超过1%的动物被视为植入动物。二级受者接受移植后的BM鄂尔多斯2-过度表达的干细胞含有8到14倍数量的干细胞，这些干细胞具有长期再生能力，表明过度表达的鄂尔多斯2导致干细胞池增加(图3H).

三级移植。二次移植四个月后，在第三组接受致命照射的受者中处死受者，并再次连续移植BM细胞，同时添加不同比例的新分离CD45.2⁺竞争对手BM细胞。图4A显示外周血中几乎所有的髓细胞都来源于鄂尔多斯2-HSC过度表达，而大约一半的淋巴系是供体或衍生的。与主要和次要受者类似，三级受者的外周血细胞值正常鄂尔多斯2-干细胞过度表达（数据未显示）。所有受试者的嵌合水平鄂尔多斯2-移植后3个月干细胞过度表达如图所示图4B在接受对照细胞的受体中几乎没有检测到捐赠者的贡献，而嵌合水平很高的来源于鄂尔多斯2-干细胞过度表达。根据协议，接受无竞争细胞连续移植对照细胞的受体均在移植后40天内死亡，而鄂尔多斯2-过度表达的干细胞为第三代受体提供了放射防护和长期再生(图4C). 与二次移植后相似，计算CD45.1的CRI⁺绿色荧光粉⁺CD45.1以上的细胞⁺绿色荧光粉^-细胞。图4D显示了二级和三级受体的这些值，并记录了干细胞转导鄂尔多斯2显示干细胞质量分别提高了10倍和25倍。值得注意的是，当用鄂尔多斯2与新鲜分离的骨髓细胞相比，干细胞质量没有损失(图4E).

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图4。

过度表达的影响鄂尔多斯2在三级受体的HSC中。（A） 代表性荧光激活细胞分选（FACS）图显示了2.5×10移植受体的供者贡献⁶两次连续移植鄂尔多斯2-与5×10竞争的过度表达细胞⁵新分离的CD45.2⁺骨髓细胞。左侧面板显示门控对髓细胞的作用；右侧显示供者对淋巴细胞的贡献。（B） CD45.1的百分比⁺绿色荧光粉⁺三次移植后3个月，所有受者（n=28）外周血中的细胞数。细胞以不同比例（5:1，2:1，⋄；1:1，○）。（C） 接受连续移植BM细胞而不与新鲜分离的BM细胞共移植的三级受体的存活曲线（对照组，▪;鄂尔多斯2,). （D） CRI比较转导的CD45.1⁺绿色荧光粉⁺干细胞与非转导CD45.1⁺绿色荧光粉^-初级、次级和三级受体中的干细胞（对照，▪;鄂尔多斯2,). （E） CRI比较转导的CD45.1⁺绿色荧光粉⁺在1次、2次和3次连续移植（对照组、，▪;鄂尔多斯2,).

作者感谢G.Harms和A.van den Berg对小鼠过滤基因阵列的帮助；C.约旦为我们提供MIEV公司矢量；A.Otte为我们提供了Ezh2抗体；G.Mesander和H.Moes为流式细胞术提供支持；和R.van Os批判性阅读手稿，并就CRI计算提供建议。