鲜血。2005年9月1日；106(5): 1565–1573.
NOD/SCID/IL2受体γ链中功能性人体血液和免疫系统的发育无效的老鼠
来自日本福冈九州大学医学研究生院医学与生物系统科学系；日本Shigenobu爱媛大学医学院第一内科；马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室；日本福冈九州大学医院细胞和分子医学中心；RIKEN过敏与免疫学，日本横滨；马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所癌症免疫与艾滋病部。
重印：明石光一（Koichi Akashi），丹纳法伯癌症研究所癌症免疫与艾滋病科，马萨诸塞州波士顿市宾尼街44号770号，邮编02115；电子邮件：ude.dravrah.icfd@ihsaka_ihciok; 或莱昂纳德·舒尔茨（Leonard D.Shultz），杰克逊实验室，600 Main St，Bar Harbor，ME 04609。 - 补充资料
【补充表】
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摘要
在此，我们报道了一种新的非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠系，其共同细胞因子受体γ链（NOD/SCID/白细胞介素2受体[IL2r]γ无效的)有效支持功能性人类造血的发展。纯化人（h）CD34+或hCD34+hCD38型–将脐血（CB）细胞移植到NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿通过面部静脉。在所有接受注射105hCD34型+或2×104hCD34型+hCD38型–CB细胞、人类造血细胞以大约70%的嵌合体进行重建。高比例的人类造血细胞嵌合体在移植后持续24周以上，hCD34+初次受者骨髓移植可重建继发性NOD/SCID/IL2rγ的造血功能无效的表明该系统可以支持人类造血干细胞的自我更新。hCD34型+hCD38型–CB细胞分化为成熟血细胞，包括骨髓单核细胞、树突状细胞、红细胞、血小板和淋巴细胞。通过发育中间产物（如普通淋巴祖细胞和普通髓系祖细胞）分化为每个谱系，重现稳态人类造血。B细胞进行正常的类别转换，并产生抗原特异性免疫球蛋白（Igs）。T细胞表现出人类白细胞抗原（HLA）依赖的细胞毒性功能。此外，在肠粘膜中发现了分泌人类IgA的B细胞，表明人类粘膜免疫功能得到了重建。因此，NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿系统可能是研究人类血淋巴系统的重要实验模型。
介绍
为了分析人体免疫和造血在体内的发育和功能，许多研究尝试在小动物异种移植模型中复制人类造血。120世纪80年代末，首次报道利用纯合子严重联合免疫缺陷（C.B.17-SCID）小鼠在免疫受损小鼠中成功移植人类造血组织。在SCID小鼠人源化淋巴系统的第一个模型（SCID-hu模型）中，McCune等人同时将人类胎儿组织，包括胎肝造血细胞、胸腺和淋巴结移植到SCID小鼠中，并诱导成熟的人类T细胞和B细胞发育。2Mosier等人通过将人血单个核细胞转移到SCID小鼠中，成功地重建了人T和B细胞。三这些初步研究表明，免疫缺陷小鼠在从人类骨髓造血干细胞（HSC）重建人类淋巴系统中的作用。
在这些初步报告之后，人们提出了一些改进的SCID模型，以尝试重建人类免疫力。4此外，重组激活基因（RAG）缺陷株已被用作异种移植的受体：T细胞和B细胞缺陷株Prkdc公司科学情报部，第1页–/–，或抹布2–/–突变小鼠5-7能够支持人类细胞的植入。然而，这些模型中的植入水平仍然很低，可能是由于宿主动物的剩余先天免疫性。1非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠比BALB/c/SCID或c.B.17/SCID小鼠支持更高水平的人类祖细胞移植。8用抗唾液酸神经节苷脂GM1抗体治疗NOD/SCID小鼠可进一步提高人类细胞移植水平9可以消除自然杀伤（NK）细胞活性。最近，NOD/SCID小鼠在β2-微球蛋白基因（NOD/SCID/β2m–/–)10或缺失细胞质区的截短的常见细胞因子受体γ链（γc）突变体（NOD/SCID/γc（c）–/–)11,12已开发。在这些小鼠中，NK细胞以及T细胞和B细胞的发育和功能受到破坏，因为β2m是主要组织相容性复合体（MHC）I类介导的先天免疫所必需的，并且因为γc（最初称为IL-2Rγ链）是许多淋巴相关细胞因子（即IL-2、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15和IL-21）受体异二聚体不可或缺的成分。13将人类骨髓或脐血（CB）细胞注射到这些小鼠中，成功地生成了人类T细胞和B细胞。在我们手中，CB细胞移植的效率以循环人（h）CD45的百分比表示+NOD/SCID/β2m的细胞数显著增加（2-5倍–/–新生儿比成人多（F.I.、M.H.和L.D.S.，未公布的数据，2003年4月）。最近，hCD34的移植+CB电池进入Rag2–/–γc–/–由功能性T细胞和B细胞介导的新生儿再生适应性免疫，14建议加强对异种移植的支持，尤其是在新生儿期。然而，在这些模型中，人类造血重建的效率可能仍不理想，因为人类细胞的嵌合体在每个实验中都不稳定。11,12,14此外，在这些异基因模型中，关于人类骨髓红细胞成分重建的信息很少。
两种具有截断或完全空γc突变体的小鼠系15-17已报告。NOD/SCID/γc（c）–/–和Rag2–/–γc–/–小鼠菌株含有一个缺失细胞内结构域的截短γc突变体，15因此，在这些模型中，γc相关细胞因子与每个受体的结合应该是正常的。18例如，γc突变为空的IL-2R是一种αβ异二聚体复合物，其亲和力大约比具有截断γc突变的小鼠的高亲和力αβγ异三聚体复合物低10倍。19γc还通过IL-4、IL-7和IL-15的受体显著增加了其对配体的亲和力。20-23先前的研究表明，γc相关受体包括IL-2Rβ链和IL-4Rα链，在γc胞外区存在的情况下，可以在一定程度上激活janus-activated kinases（JAKs），而不依赖于γc胞质区。24,25因此，为了更完全地阻断γc-相关细胞因子受体的信号传导，我们使NOD/SCID小鼠携带γc-完全零突变16（NOD/SCID/IL2rγ无效的应变）。使用NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿，我们通过高效注射人CB或高富集的CB HSC成功地重建了骨髓红细胞和淋巴成熟。人类造血重建持续了很长一段时间。发育中的淋巴细胞具有产生免疫球蛋白（Ig）和人类白细胞抗原（HLA）依赖性细胞毒活性的功能。我们的数据表明NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿系统为复制人类血淋巴发育提供了宝贵的工具。
材料和方法
老鼠
节点。Cg公司-Prkdc公司科学情报部IL2毫克tmlWjl公司/Sz（NOD/SCID/IL2rγ无效的)和NOD/LtSz-Prkdc公司科学情报部/200万无效的（NOD/SCID/β2米无效的)小鼠是在杰克森实验室（马萨诸塞州巴尔港）培育的。NOD/SCID/IL2rγ无效的通过在γc基因座上回交一个完全零突变建立菌株16到NOD上。Cg公司-Prkdc公司科学情报部应变。这种小鼠系的建立在其他地方也有报道。26所有实验均按照九州大学动物学会的指导方针进行。
细胞制备和移植
CB细胞取自日本福冈红十字会血液中心。在书面知情同意后采集CB细胞。Lin的单核细胞被耗尽+细胞使用小鼠抗hCD3、抗hCD4、抗hCD 8、抗hC D11b、抗hD D19、抗h CD20、抗h CD 56和抗人糖蛋白A（hGPA）单克隆抗体（BD免疫细胞术，加利福尼亚州圣何塞）。样品富集hCD34+细胞使用抗hCD34微球（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）。这些细胞进一步用抗hCD34和hCD38抗体（BD免疫细胞术）染色，并纯化Lin–CD34型+CD38型–FACSVantage的HSC（加州圣何塞Becton Dickinson）。林–人CD34+单元格（105)或2×104林–hCD34型+hCD38型–将细胞移植到照射过的（100 cGy）NOD/SCID/IL2rγ中无效的或NOD/SCID/β2m无效的新生儿经面部静脉27出生后48小时内。
造血嵌合体检查
移植后3个月，从受体小鼠采集外周血、骨髓、脾脏和胸腺样本。根据hCD127（IL-7受体α链）和hCD10在Lin（hCD3、hCD4、hCD8、hCD11b、hCD19、hCD20、hCD56和hGPA）中的表达分析人类常见淋巴祖细胞–人CD34+hCD38型+分数。28,29根据人骨髓祖细胞中hCD45RA和hCD123（IL-3受体α链）的表达，分析了人髓系祖细胞-CD10型–CD34型+CD38型+分数。为了分析巨核细胞/红细胞（MegE）谱系，使用了抗hCD41a（HIP8）、抗hGPA（GAR-2）、抗mCD41a抗体（MW Reg30）和抗mTer119抗体（Ter-119）。样品用氯化铵处理以消除成熟红细胞，并通过设置有核细胞散射门进行分析。对于循环红细胞和血小板的分析，未经处理的血样通过设置特定于每个细胞分数的散射门进行分析。根据LeBien提出的标准评估人类B淋巴细胞祖细胞。30
甲基纤维素培养分析
用抗hCD34、hCD38、hCD45RO、hCD123和血统抗体对受体小鼠的骨髓细胞进行染色。根据表型定义纯化人类HSC、CMP、GMP和MEP28,29使用FACSVantage（Becton Dickinson）。在添加了10%牛血清白蛋白（BSA）、20μg/mL钢因子、20 ng/mL IL-3、20 ng/mL IL-11、20 ng/mL Fms-like酪氨酸激酶3（Flt3）配体、50 ng/mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、，4 U/ml促红细胞生成素（Epo）和50 ng/ml血小板生成素（Tpo）。培养第14天计数菌落数。
组织学分析
组织样品用4%多聚甲醛固定，并用分级酒精脱水。在用加热的柠檬酸盐缓冲液进行抗原回收处理后，用小鼠抗hCD19、抗人IgA、抗hCD3、抗hCD4、抗hCD 8和抗hCD11c抗体（Dako Cytomation，Carpinia，CA）对含有副甲醛的石蜡包埋切片进行免疫染色。通过共焦显微镜观察染色标本（LSM510 META显微镜；德国Oberkochen卡尔蔡司）。使用LSM5软件进行图像采集和数据分析。所用物镜（PlanApochro×63）的数值孔径为1.4。
酶联免疫吸附试验
使用人免疫球蛋白检测试剂盒（白细胞介素州蒙哥马利市贝瑟尔）测量受体血清中的人Ig浓度。为了检测卵清蛋白（OVA）特异性人类IgM和IgG抗体，每2周用100μg OVA（西格玛，圣路易斯，密苏里州）在氢氧化铝（西格马）中乳化，免疫5只受体小鼠两次。第二次免疫后2周，从OVA处理的小鼠中获取血清。将OVA以20μg/mL的s浓度在4°C下放置在96微米孔上过夜。用牛血清白蛋白清洗和封闭后，将血清样本在平板中培养1小时。然后通过标准酶联免疫吸附试验（ELISA）测量结合OVA的抗体。
同种异体抗原特异性人CD4的细胞毒性+和CD8+T细胞系
同种抗原特异性人CD4+和CD8+根据报道的方法建立了T细胞系。31用从健康个体（TAK-LCL）建立的爱泼斯坦-巴尔病毒转化的B淋巴细胞母细胞系（TAK-LC）刺激6天后，100 hCD4+T细胞或hCD8+T细胞被镀上3×104TAK-LCL细胞在10 U/mL人IL-2（Genzyme，马萨诸塞州波士顿）的作用下(51Cr）释放试验。效应细胞的限制数量和104 51培养Cr标记的异基因靶细胞。与效应细胞或TAK-LCL不共享HLA的KIN-LCL被用作阴性对照。在存在或不存在抗HLA I类或抗HLA-DR单克隆抗体的情况下测试细胞毒性活性。
结果
人类造血重建在NOD/SCID/IL2rγ中实现无效的老鼠
NOD/SCID/IL2rγ无效的通过荧光激活细胞分选（FACS）评估，小鼠缺乏成熟的小鼠T或B细胞，NK细胞活性极低。31这种老鼠线可以存活15个月以上31因为它不会发展为胸腺淋巴瘤，通常是NOD背景免疫受损小鼠的致命疾病。32
林–hCD34型+CB细胞包含HSC、髓系祖细胞和淋巴祖细胞。28,29我们和其他人已经报道，植入含有造血干细胞和祖细胞的人CB细胞，对NOD/SCID/β2m有效–/–和Rag2–/–/γc（c）–/–小鼠，尤其是新生期移植细胞时。14,33因此，我们移植了纯化的林–hCD34型+CB细胞转化为亚致死剂量辐照的NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿通过面部静脉。27
我们首先移植了10个5林–hCD34型+3个独立供体的CB细胞转化为5个NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿，发现NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿系统对于支持人类造血祖细胞的移植非常有效。显示hCD45的百分比+移植后3个月这些小鼠的细胞。引人注目的是，骨髓和外周血的平均植入水平约为70%。与4个对照NOD/SCID/β2m相比–/–接受来自相同供体的移植的小鼠，hCD45的植入水平+NOD/SCID/IL2rγ中的细胞无效的小鼠显著高于().
表1。
人CD45嵌合+NOD/SCID/β2m中的细胞无效的小鼠和NOD/SCID/IL2ry无效的老鼠
| %有核细胞
|
|---|
| 小鼠编号（供者编号） | PB（聚丁二烯） | BM公司 | 脾脏 |
|---|
| NOD/SCID/IL2rγ无效的 |
| 1 (1) | 71.2 | 70.9 | 66.8 |
| 2 (1) | 81.7 | 81.4 | 47.1 |
| 3 (2) | 50.1 | 58.8 | 49.5 |
| 4 (3) | 68 | 83.1 | 51.1 |
| 5 (3) | 73.3 | 70.1 | 58.1 |
| 平均值±标准偏差 | 68.9 ± 11.6* | 72.9 ± 9.8* | 54.5 ± 8.0* |
| NOD/SCID/β2m无效的 |
| 1 (1) | 10.4 | 46.1 | 22 |
| 2 (2) | 11.6 | 31.5 | 24.3 |
| 3 (3) | 6.9 | 18.1 | 20.7 |
| 4 (3) | 20.7 | 30.4 | 31.2 |
| 平均值±标准偏差 | 12.4 ± 5.9* | 31.5 ± 11.5* | 22.6 ± 4.7* |
显示了对接受人Lin移植的小鼠的人类造血细胞子代的分析–hCD34型+CB电池。在外周血中，hCD45+细胞包括hCD33+髓系，hCD19+B细胞和hCD3+分析所有小鼠的T细胞(和). 然后我们分析了这些小鼠红细胞生成和血栓形成的重建。抗人糖蛋白A（hGPA）抗体识别人红细胞，而mTer119抗体34分别在小鼠红细胞上识别GPA相关蛋白(). 人和小鼠血小板也可以分别用抗人和抗鼠CD41a染色(). 循环hGPA+红细胞与hCD41a+分析的3只小鼠均检测到血小板(，右侧面板）。高平均成绩+成红细胞和hCD41a+巨核细胞分别为有核骨髓细胞的9.5%±6.2%（n=5）和1.64%±0.42%（n=5%）。因此，移植了人林–hCD34型+NOD/SCID/IL2rγ诱导CB细胞分化为成熟红细胞和血小板无效的收件人。
NOD/SCID/IL2r中人造血细胞的分析γ无效的 收件人。（A） 在有核细胞的散射门中，抗hCD45和抗mCD45抗体（Abs）分别与人类和小鼠白细胞发生特异性反应。在受体血液中，大多数有核细胞是人类白细胞（顶行）。hCD33高水平植入+骨髓单核细胞，hCD19+B细胞和hCD3+在接受Lin移植的受体小鼠的外周血中获得T细胞–hCD34型+CB电池（最下面一行）。（B） NOD/SCID/IL2rγ中循环红细胞（顶行）或血小板（底行）的分析无效的收件人。在血液中，Ter119+小鼠红细胞和hGPA+检测人红细胞。mCD41a型+小鼠血小板也被重组。（C） 人细胞在NOD/SCID/IL2rγ中的多系移植无效的小鼠骨髓。hCD33型+骨髓单核细胞，hCD19+B细胞和hCD3+出现T细胞。人平均绩点+红细胞与hCD41a+骨髓有核细胞门也可见巨核细胞。（D，左）HLA-DR+hCD11c型+用流式细胞仪检测脾脏中的树突状细胞。（右）脾脏CD11c免疫组织化学染色。CD11c公司+细胞呈树突状细胞形态。
表2。
移植NOD/SCID/IL2rγ组织中的细胞数量和组成无效的老鼠
| | %有核细胞（%hCD45+单元格）
|
|---|
| 注射的细胞、小鼠和组织类型 | 电池总数 | CD33型 | CD19编号 | CD3（CD3） | CD11c公司 |
|---|
| 1 × 105林-CD34型+ |
| 1号小鼠/1号供体 |
| BM公司 | 2.4 × 107 | 8.2 (11.6) | 54.8 (77.6) | 10.7 (15.1) | 1.1 (1.6) |
| 脾脏 | 4.1 × 107 | 4.3 (6.4) | 33.5 (50.1) | 26.1 (39.1) | 2.2 (3.3) |
| 胸腺 | 3.1 × 105 | 氖 | 1.3 (1.3) | 96.2 (98.7) | 氖 |
| PB（聚丁二烯） | 氖 | 4.0 (5.6) | 35.1 (49.3) | 19.8 (27.8) | 氖 |
| 2号小鼠/1号供体 |
| BM公司 | 1.8 × 107 | 5.5 (6.8) | 56.5 (67.6) | 9.9 (12.2) | 2.9 (3.6) |
| 脾脏 | 3.2 × 107 | 2.1 (4.5) | 27.7 (58.8) | 15.9 (33.8) | 1.3 (2.8) |
| 胸腺 | 4.5 × 105 | 氖 | 1.1 (1.2) | 90.4 (98.8) | 氖 |
| PB（聚丁二烯） | 氖 | 6.1 (7.5) | 53.8 (65.9) | 21.6 (40.1) | 氖 |
| 4号小鼠/3号供体 |
| BM公司 | 1.9 × 107 | 9.4 (11.3) | 52.9 (63.7) | 15.9 (19.1) | 0.62 (0.75) |
| 脾脏 | 4.4 × 107 | 3.5 (6.8) | 24.2 (47.4) | 20.8 (40.7) | 1.5 (2.9) |
| 胸腺 | 0.8 × 105 | 氖 | 0.88 (1.1) | 78.2 (98.9) | 氖 |
| PB（聚丁二烯） | 氖 | 3.2 (4.7) | 61.3 (90.1) | 5.3 (7.8) | 氖 |
| 5号小鼠/3号供体 |
| BM公司 | 2.1 × 107 | 10.2 (14.6) | 48.8 (82.0) | 9.4 (13.4) | 1.3 (1.9) |
| 脾脏 | 2.7 × 107 | 6.6 (11.4) | 30.4 (52.3) | 18.6 (32.0) | 1.1 (1.9) |
| 胸腺 | 1.1 × 105 | 氖 | 3.1 (3.7) | 81.1 (96.3) | 氖 |
| PB（聚丁二烯） | 氖 | 9.8 (13.4) | 40.4 (55.1) | 16.8 (22.9) | 氖 |
| 2 × 104林-CD34型+CD38型- |
| 6号小鼠/4号供体 |
| BM公司 | 2.6 × 107 | 3.1 (5.3) | 46.1 (78.7) | 8.1 (13.8) | 1.3 (2.2) |
| 脾脏 | 3.9 v107 | 1.3 (2.7) | 40.2 (83.9) | 5.9 (12.3) | 0.54 (1.1) |
| 胸腺 | 1.9 × 105 | 氖 | 2.1 (2.3) | 89.4 (97.7) | 氖 |
| PB（聚丁二烯） | 氖 | 5.4 (12.4) | 28.9 (66.3) | 9.3 (21.3) | 氖 |
| 7号小鼠/5号供体 |
| BM公司 | 1.4 × 107 | 7.2 (14.2) | 39.6 (78.1) | 3.1 (6.1) | 0.82 (1.6) |
| 脾脏 | 2.2 × 107 | 2.4 (5.1) | 37.2 (79.3) | 6.8 (14.5) | 0.52 (1.1) |
| 胸腺 | 1.3 × 105 | 氖 | 0.6 (0.7) | 85.1 (99.2) | 氖 |
| PB（聚丁二烯） | 氖 | 2.3 (41.7) | 49.3 (89.5) | 3.5 (6.4) | 氖 |
| 8号小鼠/6号供体 |
| 宝马 | 1.1 × 107 | 6.1 (11.7) | 36.8 (70.6) | 7.7 (14.8) | 2.5 (4.8) |
| 脾脏 | 2.9 × 107 | 2.9 (4.6) | 33.8 (53.1) | 24.6 (38.6) | 2.4 (3.8) |
| 胸腺 | 1.9 × 105 | 氖 | 1.1 (1.2) | 94.1 (97.0) | 氖 |
| PB（聚丁二烯） | 氖 | 8.1 (11.9) | 50.2 (73.5) | 10.0 (14.6) | 氖 |
在所有移植小鼠的骨髓和脾脏中都含有大量hCD11c+树突状细胞和hCD33+髓细胞，hCD19+B细胞和hCD3+T细胞(和). hCD11c型+树突状细胞共表达HLA-DR对T细胞抗原递呈至关重要(). 相反，在胸腺中，大多数细胞由hCD3组成+T细胞和罕见的hCD19+B细胞().
显示循环hCD45百分比的变化+另一组NOD/SCID/IL2rγ中的细胞无效的新生儿注射2×104林–hCD34型+hCD38型–CB电池。令人惊讶的是，hCD45的水平+血液中的细胞没有变化，即使在移植后24周也保持在较高水平。小鼠没有发生淋巴恶性肿瘤或其他并发症。此外，我们测试了人类HSC在主要受体中的可移植性。我们在hCD34初次移植后24周处死小鼠+细胞，纯化1至5×104hCD34型+来自原代受体骨髓细胞的细胞，并将其重新移植到NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿。在所有三个实验中，二级受体至少在移植后12周成功重建人类造血，当时我们杀死小鼠进行骨髓分析(). 因此，NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿系统可以长期支持人类造血。
纯林–hCD34型+hCD38型– CB细胞通过生理中间产物重建造血，并在NOD/SCID/IL2r中显示长期重建γ无效的 新生儿系统。（A） 2×10注射受体小鼠外周血人细胞嵌合的系列评价4林–hCD34型+hCD38型–CB电池。白色、灰色和黑色圆点代表3个收件人。（B） hCD34型+从初级受体骨髓（左）中纯化的细胞成功植入次级新生受体。人CD19+B细胞（中间）和hCD3+图中显示了具有代表性的二级受体中的T细胞（右）。（C） 林先生–含有hCD34的骨髓细胞+hCD38型+hCD10+hCD127（IL-7Rα）+CLP（上排）。在林中–hCD10–分数，hCD34+hCD38型+人CD45RA–hCD123（IL-3Rα）低CMP、hCD34+hCD38型+人CD45RA+hCD123型低GMP，hCD34+人CD38+人CD45RA–hCD123型–议员们出席了会议。祖细胞的每个数字表示hCD45的百分比+细胞。SSC表示侧面散射。（D） 甲基纤维素分析中纯化髓系祖细胞群体的集落形成活性。显示了三个收件人中的一个的代表性数据。误差线表示标准偏差。
人脐血造血干细胞通过NOD/SCID/IL2rγ中的发育中间产物产生髓细胞和淋巴细胞无效的骨髓
林先生–hCD34型+CB组分包含早期髓系和淋巴祖细胞以及HSC。28验证NOD/SCID/IL2rγ中的人类HSC可以启动向所有造血细胞的分化无效的新生系统，我们移植了林–hCD34型+hCD38型-包含小鼠长期HSC对应群体的CB细胞，35并对人类HSC高度富集。36,37hCD34型+CB细胞（15%-20%）为hCD38–（未显示数据）。小鼠接受2×10的移植4林–hCD34型+hCD38型–与用1×10重组的小鼠相比，细胞成功重组的比例与人细胞相似5林–人CD34+移植后12周的细胞(). 在另一个实验中，小鼠注射2×104林–hCD34型+hCD38型–即使在移植后24周（未显示），细胞仍表现出循环人血细胞的高嵌合体（>50%），这表明自我更新的人造血干细胞长期植入。
在所有注射林的小鼠中–hCD34型+hCD38型–细胞，hGPA+红细胞与hCD41a+存在巨核细胞（未显示）。然后我们测试了Lin的分化–hCD34型+hCD38型–NOD/SCID/IL2rγ中的HSC无效的小鼠的微环境可以重现人类骨髓的正常发育过程。我们和其他人已经报道，两种小鼠稳态正常骨髓中都存在表型可分离的髓系和淋巴祖细胞38,39和人类。28,29 显示了受体骨髓细胞的典型FACS分析数据。在所有3只受试小鼠的骨髓中，都含有hCD34+hCD38型–HSC公司36,37和hCD34+hCD38型+祖细胞组分。28hCD34+hCD38型+hCD10+hCD127（IL-7Rα）+普通淋巴祖细胞（CLP）群29检测到(，顶部面板）。根据人类髓系祖细胞的表型定义，28hCD34+hCD38型+祖细胞部分被分为hCD45RA–hCD123（IL-3Rα）低普通髓系祖细胞（CMP），hCD45RA–hCD123型–巨核细胞/红细胞祖细胞（MEP）和hCD45RA+人CD123低粒细胞/单核细胞祖细胞（GMP）群体(，底部面板）。然后我们纯化了这些髓系祖细胞，并测试了它们的分化潜能。如所示纯化的GMP和MEP分别产生粒细胞/单核细胞（GM）和巨核细胞/红细胞（MegE）相关的菌落，而CMP和HSC除了GM和MegE菌落外，还产生混合菌落。这些数据强烈表明hCD34+hCD38型–人类HSC分化为所有髓系和淋巴系，追踪NOD/SCID/IL2rγ内稳态人类造血的正常发育步骤无效的小鼠骨髓。
人体NOD/SCID/IL2rγ系统和粘膜免疫系统的发育无效的老鼠
我们进一步评估了人类免疫系统在NOD/SCID/IL2rγ中的发育无效的收件人。在胸腺中，胸腺细胞主要由hCD3组成+分散hCD19的T细胞+B细胞(). 这是合理的，因为正常小鼠胸腺除T细胞外还含有少量B细胞。40胸腺细胞由未成熟的hCD4组成+hCD8型+双阳性（DP）T细胞()以及少量的hCD4+或hCD8+单阳性（SP）成熟T细胞(，顶部面板），而hCD3+脾脏中的人T细胞主要由hCD4或hCD4组成+或hCD8+单个阳性T细胞(，底部面板）。这些数据表明，T细胞发育的正常选择过程可能发生在受体胸腺中。
移植NOD/SCID/IL2r淋巴器官的组织学研究γ无效的 收件人。（A） 胸腺重组后细胞数增加。（B） 胸腺用抗hCD3（绿色）和抗hCD19（红色）抗体染色。（C） 胸腺用抗hCD4（绿色）和抗hCD8（红色）抗体染色。大多数胸腺细胞对hCD4和hCD8呈双重阳性。（D-E）受体脾脏中的淋巴滤泡样结构。（F） 淋巴滤泡主要含有hCD19+被分散的hCD3包围的B细胞（红色）+T细胞（绿色）。（G） 移植NOD/SCID/IL2rγ的肠道组织学无效的收件人（左）。（H） 在肠道，DAPI+（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）有核细胞（蓝色）含有分散的hCD3+T细胞（绿色）和人IgA+单元格（红色）。（一） 同一节的DIC图像显示IgA+B细胞主要分布于肠粘膜层间质区。面板内的白色条表示80μm（C）、100μm（F）和20μm（I）。
NOD/SCID/IL2r中淋巴细胞的发育γ无效的 收件人。（A） 受体中人类T细胞的流式细胞术分析。胸腺中的大多数细胞是hCD4+hCD8型+双阳性胸腺细胞（顶部）。CD3+含有hCD4的脾细胞+或hCD8+单个阳性成熟T细胞（底部）。（B） hCD34型+人CD19+B前体，hCD10+人CD19+前B和hCD19+hCD20型你好在受体小鼠的骨髓和脾脏中可以看到不同比例的成熟B细胞。数字表示有核细胞总数中的百分比。（C） 在骨髓、外周血（PB）或移植NOD/SCID/IL2rγ的脾脏中可见表达各类人类免疫球蛋白重链的B细胞无效的老鼠。数字表示有核细胞的百分比。
脾脏中可见淋巴滤泡样结构()，其中主要hCD19+B细胞与周围分散的hCD3相关+T细胞(). 还观察到肠系膜淋巴结的发育，其中存在由人类B细胞和T细胞组成的类似滤泡状结构（未显示）。在骨髓和脾脏中，每个器官中的有核细胞都含有hCD34+人CD19+B前细胞，hCD10+人CD19+未成熟B细胞和hCD19+hCD20型+成熟B细胞().显示人免疫球蛋白在hCD19上的表达+B细胞。hCD19的重要部分+B细胞在其表面表达人类IgM。在血液和脾脏中也观察到一部分表达IgD的细胞，这表明这些发育中的B细胞发生了类别转换。正如Rag2报道的那样–/–γc–/–鼠标模型，10,12,14人CD19+免疫球蛋白A+NOD/SCID/IL2rγ在骨髓和脾脏中检测到B细胞无效的收件人。然后，我们评估了接受人Lin移植的小鼠血清中人免疫球蛋白的浓度–hCD34型+通过ELISA检测CB细胞。在3 NOD/SCID/IL2rγ的所有血清中无效的受试者可检测到大量IgG（257±76μg/mL）和IgM（600±197μg/mL–/–小鼠的IgM水平较低（76±41μg/mL），很少或没有IgG（表S1，见血液网站；请参阅在线文章顶部的补充表格链接）。这些数据共同表明，在NOD/SCID/IL2rγ中可以有效地发生类别切换无效的老鼠。
肠道是支持宿主抵抗外源性抗原的主要场所之一。自从骨髓和脾脏hCD19+B细胞含有大量表达IgA的细胞，我们测试了NOD/SCID/IL2rγ是否能重建粘膜免疫无效的收件人。免疫组织学分析表明，受体小鼠的肠道中除了hCD3外，还含有大量表达人IgA的细胞+T细胞(). 因此，人CB细胞可以在NOD/SCID/IL2rγ中重建负责全身和粘膜免疫的细胞无效的新生儿系统。
人类适应性免疫在移植NOD/SCID/IL2rγ中的作用无效的老鼠
五个NOD/SCID/IL2rγ无效的移植后3个月，用3个独立的人CB样本重组的小鼠用卵清蛋白（OVA）免疫两次。免疫两周后，从这些免疫小鼠中收集血清，并进行ELISA以定量OVA特异性人IgG和IgM。如所示，在来自免疫小鼠的所有血清样品中检测到显著水平的OVA特异性人IgM和IgG，但在来自未免疫移植小鼠的样品中没有检测到。因此，适应性人类免疫系统在NOD/SCID/IL2rγ中正常运行无效的产生抗原特异性人类IgM和IgG抗体的菌株。
NOD/SCID/IL2r培养的人T细胞和B细胞的功能分析γ无效的 收件人。（A） OVA特异性人类免疫球蛋白的生产。在OVA免疫两周后，对5名独立受体的血清进行取样，并评估OVA特异性人IgM（□）和IgG的浓度(
)ELISA检测。3种非免疫NOD/SCID/IL2rγ血清无效的收件人被用作对照。外径表示光密度。（B） NOD/SCID/IL2rg-null小鼠产生的人类T细胞的细胞毒性活性。人CD4+和hCD8+来自受体脾脏的T细胞克隆与异基因靶细胞（TAK-LCL）共培养。与效应细胞或TAK-LCL（X）没有任何HLA类型的KIN-LCL被用作阴性对照。两种hCD4+和hCD8+T细胞系表现出剂量依赖性的抗TAK-LCL细胞毒活性。在hCD4中+T细胞克隆，这种作用被抗HLA-DR抗体（▴）阻断，而hCD8+T细胞克隆，这种效应被抗HLA I类抗体阻断(▪). ♦ 表明在不添加抗体的情况下对TAK-LCL有细胞毒性反应。
接下来，我们测试了NOD/SCID/IL2rγ培养的人类T细胞的同种抗原特异性细胞毒性功能无效的收件人。人CD3+从NOD/SCID/IL2rγ脾脏分离的T细胞无效的受体与异基因B-LCL（TAK-LCL）培养。我们建立了8 hCD4+和10 hCD8+反应LCL特异性异基因抗原的T细胞克隆。然后，我们评估了这些T细胞克隆在存在或不存在抗HLA-DR和抗HLA-I类抗体的情况下的细胞毒活性。我们随机选择3个CD4和CD8克隆进行进一步分析(). A类51Cr释放试验显示hCD4和+和hCD8+T细胞克隆对同种异体TAK-LCL表现出细胞毒性活性，而对KIN-LCL（一种与TAK-LCL不共享HLA I或II类的细胞系）没有表现出细胞毒性。hCD4的细胞毒性+和hCD8+分别添加抗HLA-DR和抗HLA-I类抗体显著抑制T细胞克隆。这些数据清楚地表明，人类CB-derived T细胞能够以HLA限制的方式表现出细胞毒性活性。
讨论
异种移植模型已被广泛用于体内人类造血研究。1,41,42在本研究中，我们描述了一种新的异种移植系统，该系统能够长期有效地支持人类所有血统的血淋巴发育。
NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿在静脉注射少量CB细胞后，表现出非常有效的人类造血和免疫系统重建。在我们手中，NOD/SCID/IL2rγ无效的与NOD/SCID/β2m相比，新生儿表现出更高的人血细胞嵌合体–/–相同移植环境下的新生儿(). 该结果直接表明IL2rγ无效的突变对β2m以上的人细胞移植有好处–/–突变。
供受体使用的NOD/SCID毒株的一个关键问题是，该小鼠系由于内源性嗜多性前病毒（Emv-30）而易患胸腺淋巴瘤。32因此，NOD/SCID和NOD/SCID/β2m–/–小鼠的平均寿命分别为8.5个月和6个月，而NOD/SCID/IL2rγ无效的存活15个月以上的小鼠未发展为胸腺淋巴瘤，31这允许进行长期试验。
在我们的研究中，NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿注射105hCD34型+经面部静脉的CB细胞持续显示人类造血的高嵌合体水平（50%-80%；). 该模型与Rag2相当，或可能比Rag2更有效–/–γc–/–肝内注射0.4～1.2×10的新生儿模型5hCD34型+CB细胞产生不同程度的人类细胞嵌合（5%-65%）。14然而，植入效率的微小差异可以反映HSC通过每种注射途径的归巢效率。NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿模型可能比NOD/SCID/γ模型更有效c（c）–/–成人模型，其中大多数受体在5×10移植后显示约30%的人细胞嵌合4hCD34型+CB电池。11虽然我们没有测试NOD/SCID/γc（c）–/–在本研究中，我们发现新生儿并排植入hCD34的水平+在NOD/SCID/IL2rγ中，新生儿的人类急性髓细胞白血病细胞大约是成人的3倍无效的菌株（F.I.、T.M.、S.Y.、M.Y.、M.H.、K.A.和L.D.S.，正在准备手稿）。因此，目前尚不清楚IL2rγ无效的突变比截断γc突变有显著优势11用于人类细胞移植。仍然有可能提高NOD/SCID/IL2rγ的植入效率无效的新生儿系统与NOD/SCID/γc（c）–/–成人系统反映了异基因屏障的年龄依赖性成熟。
Rag2–/–γc–/–新生儿和NOD/SCID/γc（c）–/–成人模型提供了明确的证据，证明功能性T细胞、B细胞和树突状细胞可以从免疫缺陷小鼠的造血祖细胞发育而来。CB-derived B细胞中免疫球蛋白的类别转换在NOD/SCID/IL2rγ中发生无效的但在NOD/SCID/β2m中没有–/–新生儿（表S1），进一步证实了NOD/SCID/IL2rγ的优势无效的模型。我们还表明，与之前使用Rag2的报告一致–/–γc–/–模型，14NOD/SCID/IL2rγ培养的人T和B细胞无效的小鼠能够产生抗原特异性免疫反应。有趣的是，人类T细胞和B细胞迁移到小鼠淋巴器官和肠道组织中，协同形成淋巴器官结构。此外，我们发现分泌IgA的人类B细胞可以在小鼠肠道中发育，这表明可以产生人类粘膜免疫。因此，在该模型中，细胞相互作用和淋巴细胞归巢至少可以在某种程度上跨越异种屏障发生。有趣的是，胸腺中发育中的人类细胞显示出SP和DP细胞的正常分布()成熟的人类T细胞以HLA依赖的方式显示细胞毒性功能(). 这表明NOD/SCID/IL2rγ中可能发生人类T细胞的阳性和/或阴性选择无效的收件人。在FISH分析中，受者的胸腺上皮细胞与抗鼠而非抗人着丝粒探针发生反应（F.I.和M.H.，未发表的数据，2004年9月），证实了受者的来源。因此，尚不清楚这些人类T细胞是如何在小鼠胸腺中有效培养和发育的。人类成熟T细胞也可能是通过胸腺外教育和选择发育而来的。
我们的数据直接表明，最原始的hCD34+hCD38型–CB细胞除了能产生NOD/SCID/IL2rγ中的免疫系统外，还能产生人类髓系红细胞系统无效的收件人。循环hCD33的出现+NOD/SCID/β2m报告了人CB细胞移植后的骨髓单核细胞–/–新生儿33和NOD/SCID/γc（c）–/–成人11系统。然而，尽管有报道称NOD/SCID小鼠可以支持hCD71的终末成熟，但在以前的模型中尚未获得人类红细胞生成的发展+通过与人细胞因子培养从人HSC体外诱导的成红细胞。43我们首次表明，人类红细胞生成和血栓形成可以在小鼠中从原始hCD34发展+人CD38–细胞，如骨髓中存在成红细胞和巨核细胞，以及NOD/SCID/IL2rγ中存在循环红细胞和血小板无效的收件人。值得注意的是，hCD34+hCD38型–CB HSC群体产生骨髓中的骨髓和淋巴限制性祖细胞群体，如CMP、GMP、MEP和CLP(). 因此，NOD/SCID/IL2rγ无效的微环境可能支持从原始HSC阶段开始的骨髓和淋巴细胞生成的生理步骤。
总之，我们表明NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿系统通过生理发育中间产物有效支持原始人类造血干细胞的血淋巴发育。它还可以支持人类系统免疫和粘膜免疫的发展，因此可能有助于利用人类免疫产生免疫球蛋白或实验性疫苗。NOD/SCID/IL2rγ无效的新生儿系统也可能成为了解人类恶性造血的有效工具，因为人类白血病发生的分析主要依赖于NOD/SCID成年小鼠系统。44-46我们的模型也可能有助于再现人类造血细胞的转化过程，因为移植的小鼠造血祖细胞和干细胞可以通过在同基因小鼠模型中转导致癌融合基因而发展成白血病。47,48因此，该系统的使用应该为分析正常和恶性人类造血开辟一条更有效的途径。
致谢
我们感谢Bruce Gott和Lisa Burzenski提供的出色技术援助，感谢佐藤博士和福冈脐带血库的其他工作人员为CB做准备。
笔记
在线预发布为血液第一版论文，2005年5月26日；DOI 10.1182/血液-2005-02-0516。
由日本科学促进会（F.I.）资助；日本教育、文化、体育、科学和技术部（M.Y.）；日本卫生、劳动和福利部（M.H.）；以及国家卫生研究院拨款A130389和HL077642（L.D.S.）和DK061320（K.A.）。
这篇文章的在线版本包含数据补充。
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节，特此将本文标记为“广告”。
工具书类
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