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美国国家科学院院刊。2007年6月12日；104(24): 10158–10163.
2007年6月4日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0703478104
预防性维修识别码：项目经理1891215
PMID：17548814

人结直肠癌干细胞的表型特征

皮耶罗·达勒巴,*† 斯科特·戴拉,‡ In-Kyung公园,‡ 刘瑞（Rui Liu）,* 王新浩,‡ 罗伯特·W·赵,§ 蒂莫西·霍伊,‡ 奥斯汀·格尼,‡ 艾米娜·H·黄, 戴安·西蒙, 安德鲁·谢尔顿,‖ 乔治·帕米亚尼,** 奇亚拉·卡斯特利,**和迈克尔·克拉克*††‡‡
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

最近的观察表明，在几种类型的人类癌症中，每个肿瘤中只有癌细胞的一个表型子集能够启动肿瘤生长。这种癌细胞的功能子集在操作上被定义为“癌症干细胞”（CSC）子集。在这里，我们开发了一个用于人类结直肠癌（CRC）研究的CSC模型。固体CRC组织，无论是从手术标本中采集的原代组织还是在非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内建立的异种移植物，都被分解为单细胞悬浮液，并通过流式细胞术进行分析。选择在上皮癌细胞中显示肿瘤内异质表达的表面标记物进行细胞分选和致瘤性实验。纯化单个表型癌细胞亚群，并通过注射NOD/SCID小鼠研究其致瘤特性。我们的观察表明，在六分之六的人类CRC测试中，移植能力体内在免疫缺陷小鼠中，仅限于上皮细胞粘附分子（EpCAM）的少数亚群高的/CD44细胞+上皮细胞。肿瘤起源于EpCAM高的/CD44细胞+细胞保持分化表型，并再现其亲代病变的完整形态和表型异质性。EpCAM表面分子库分析高的/CD44细胞+细胞导致CD166被鉴定为一个额外的差异表达标记，有助于在三分之三的受试CRC中分离CSC。这些结果验证了人类CRC中干细胞的工作模型，并为CRC干细胞分离提供了一个高度稳健的表面标记轮廓。

关键词：CD44、CD166/ALCAM、肿瘤分化、肿瘤异质性

越来越多的证据支持人类癌症可以被视为干细胞疾病的观点(1–三). 根据“癌症干细胞”（CSC）理论，肿瘤不应被视为转化细胞的简单单克隆扩增，而应被视为复杂组织，其中异常生长是由少数病理性CSC库驱动的，一方面，已获得肿瘤相关特征，如不受控制的生长和形成转移的能力，另一方面，保持其固有的自我更新能力，并分化为表型异质性，尽管异常的后代。最初对人类急性髓细胞白血病进行的三项关键实验观察支持了这一假设(4)后来扩展到人体实体肿瘤(5,6): (我)当移植到免疫缺陷小鼠体内时，每个肿瘤中只有少数癌细胞具有致瘤潜能(二)致瘤癌细胞具有独特的表面标记特征，可以通过流式细胞术从非致瘤细胞中进行差异性和重复性分离，以及(三)由致瘤细胞生长的肿瘤包含致瘤和非致瘤癌细胞的混合群体，从而重新产生母体肿瘤的完全表型异质性。

目前，选择性地具有致瘤潜能的癌细胞亚群在操作上被定义为CSC，并已从选定类型的人类实体癌（如乳腺癌）中前瞻性地鉴定出来(5)，大脑(6,7)，冒号(8,9)、头部和颈部(10)和胰腺癌(11). 然而，CSC的工作模式仍然受到激烈的争论(12)和发表于结直肠癌（CRC）的数据表明，原发性CRC的一个亚组对于目前用于分离结直肠癌CSC（Co-CSCs）的标记物可能是阴性的(9). 在本研究中，我们开发了一种用于分离人类Co-CSC的替代性、非常健壮的协议。

结果

原发性正常和恶性结肠上皮的表面标记表达谱。

首先，我们决定研究体内人CRC细胞的表面标记物表达谱，从直接从接受手术的患者身上采集的新鲜原发肿瘤组织开始[支持信息（SI）表2]. 同时，作为正常对照，我们还分析了在结肠切除术中常规切除肿瘤旁的健康自体上皮。我们的第一次筛选集中在两个标记物的表达上，这两个标记先前被描述为在分离人类乳腺CSC中有用：CD44和上皮细胞粘附分子（EpCAM），也称为上皮特异性抗原（ESA）(5). 原始组织，包括正常和恶性标本，被分解成单细胞悬浮液，并通过流式细胞术进行分析(图1). 基于上述两个标记，我们能够区分上皮细胞的两个主要群体：EpCAM高的/CD44细胞+和EpCAM低的/CD44细胞−原发性CRC肿瘤和正常结肠上皮细胞都含有相同的细胞群，尽管一些肿瘤的EpCAM百分比增加高的/CD44细胞+单元格(图1). 总的来说，在正常大肠粘膜中(n个=15），EpCAM的频率高的/CD44细胞+细胞范围为活组织细胞总数（DAPI）的0.15%至5%（平均值=1.6%）−)活上皮细胞总数（DAPI）的0.16%至10%（平均值=2.6%）−，林−). 原发性CRC肿瘤(n个=12），EpCAM的频率高的/CD44细胞+细胞占总活肿瘤细胞（DAPI）的0.03%至38%（平均值=5.4%）−)活上皮细胞总数（DAPI）的0.20%至58%（平均值=11.4%）−，林−).

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原发性CRC肿瘤和正常结肠组织中的EpCAM/CD44表达谱。对原发组织中EpCAM/CD44表达的分析显示，原发性CRC肿瘤中的表达相似(A–C)和正常大肠上皮(D–F型). 正常组织和恶性组织都包含两个主要的细胞亚群：EpCAM高的/CD44细胞+和EpCAM低的/CD44细胞−为了最小化实验变异性和遗传背景的贡献，将原发性肿瘤与自体正常粘膜进行比较，并在同一天进行分析。通过使用B29.1抗ESA单克隆抗体（Biomeda，Foster City，CA）分析EpCAM的表达。流量图中报告的百分比表示闸门P5中包含的细胞百分比。

CRC表型亚群的差异致瘤性。

接下来，我们决定评估前两个表型群体（EpCAM高的/CD44细胞+和EpCAM低的/CD44细胞−)具有不同的致瘤特性。为了确保实验程序设置的一致性和再现性，我们决定首先在我们实验室从新鲜的原发肿瘤样本中新建立的人类CRC异种移植系小组中解决这个问题(SI表2). 所有异种移植物系最初植入，随后作为实体瘤传代，从未培养或扩增在体外在组织学检查中，肿瘤异种移植物生长为腺癌，形成腺体样结构，结肠特异性分化标记物如细胞角蛋白-20（CK20）和中性上皮粘蛋白表达阳性(SI表2和SI图6). 值得注意的是，在流式细胞术分析中，CRC异种移植物的EpCAM/CD44表达谱与原发性肿瘤的表达谱相一致(图2)，在每种异种移植物和其来源的单个自体原发肿瘤之间观察到最高程度的相似性(SI图7). 最有趣的是，这两个种群的相对比例在不同的异种移植物系之间有所不同，但在每个系内连续保持稳定体内移植(SI图8). 因此，两个种群的相对比例是每个异种移植物的独特特征。总之，在CRC异种移植中(n个=8），EpCAM的频率高的/CD44细胞+细胞占全部活上皮癌细胞（DAPI）的0.8%至38%（平均值=15.2%）−，林−).

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人CRC异种移植物的EpCAM/CD44表达谱与在原发性CRC肿瘤中观察到的结果一致。(A–D)对NOD/SCID小鼠中生长的人CRC异种移植物中EpCAM/CD44表达的分析证实存在两种主要的癌细胞亚群：EpCAM高的/CD44细胞+和EpCAM低的/CD44细胞−两个亚群的相对频率在不同的异种移植物中不同。使用B29.1抗ESA单克隆抗体（Biomeda）分析EpCAM的表达。流量图中报告的百分比表示闸门P5中包含的细胞百分比。

在对六种不同的异种移植物系进行的几项独立实验中，两个群体通过FACS纯化，并注射回非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠(SI图9). 结果表明，在致瘤性方面存在显著差异。注射200到500 EpCAM后经常发生肿瘤高的/CD44细胞+单元格，而104EpCAM公司低的/CD44细胞−细胞始终不能形成肿瘤(表1和SI表3). 最重要的是，EpCAM产生的肿瘤高的/CD44细胞+细胞保持分化表型，并再现其母细胞病变的形态和表型异质性，包括上皮腺体样结构的形成、中性上皮粘蛋白的产生以及分化标记物（如CK20）的异质性表达(SI图6). 此外，当用流式细胞仪分析时，它们同时含有EpCAM高的/CD44细胞+和EpCAM低的/CD44细胞−与母体病变比例相似的人群(图3). 综上所述，这些观察结果表明，在人类CRC异种移植物中，基于EpCAM和CD44，具有干样特性的人群可以被重复且一致地分离出来。

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从分类的EpCAM生长的肿瘤中重建亲代EpCAM/CD44表达谱高的/CD44细胞+细胞。分类EpCAM注射后肿瘤生长分析高的/CD44细胞+单元格(B和E类)显示亲代表达谱的重建(A类和D类)，包括EpCAM的类似相对频率高的/CD44细胞+和EpCAM低的/CD44细胞−种群（UM-CLON#4；C类). NOD/SCID小鼠的肿瘤形成能力仅限于EpCAM高的/CD44细胞+细胞群（MICOL-69；F类，箭头）。注射EpCAM时通常未观察到肿瘤生长低的/CD44细胞−同一只动物相对两侧的细胞（圈出的区域）。使用B29.1抗ESA单克隆抗体（Biomeda）分析EpCAM的表达。流量图中报告的百分比表示闸门P5中包含的细胞百分比。

表1。

不同CRC表型亚群致瘤细胞剂量的比较

林−表型亚群*细胞剂量与肿瘤形成†
10,0008,0006,0005,00040002,0001,000800400200150
CD44细胞+2/5‡——————————
CD44细胞−0/5‡——————————
欧洲安全局高的/CD44细胞+———4/5—17/1913/152/516/2021/28—
所有其他（主要是CD44−/欧洲航天局低的)0/3§0/50/5—0/51/300/19—0/100/20—
CD44细胞+/CD166型+——————6/10————
CD44细胞−/CD166型+——————1/10————
CD44细胞+/CD166型−——————0/7————
CD44细胞−/CD166型−0/10——————————
欧洲安全局高的/CD166型+————3/5‖——————
所有其他（主要是ESA低的/CD166型−)————0/5‖——————
欧洲安全局高的/CD44细胞+/CD166型+——————————1/2‖
欧洲安全局高的/CD44细胞+/CD166型−——————————0/2‖
所有其他（主要是ESA低的/CD44细胞−)————————0/2‖——

*所有种群的非上皮谱系标记表达均为阴性（Lin−).

†细胞剂量，每次注射的细胞数；肿瘤形成、肿瘤形成数量/注射次数；随访5个月未发现肿瘤肿块时，认为取瘤不成功。另请参见SI表2和表3.

‡细胞剂量为14000。

§细胞剂量为12.000。

对2500个细胞进行了5次注射，对2000个细胞进行14次注射。

‖原发肿瘤细胞。

Co-CSC表面标记库的特征。

为了更好地表征Co-CSC表面标记库，并评估是否可以通过EpCAM的亚组分进一步富集Co-CSC高的/CD44细胞+人群中，我们开始对其他干细胞模型中已描述为差异表达的标记进行系统评估，如CD49f、CD133和醛脱氢酶（ALDH）(6,8,9,13,14). CD49f表达分析显示出与EpCAM相似的一致且可重复的模式：CD49f在大多数肿瘤细胞上检测到，CD44上的水平较高+亚群(SI图10)CD133的表达表现出更为多变的模式，一些肿瘤评分为均匀阴性，一些主要为阳性，而另一些则为阳性和阴性细胞的混合(SI图11). CD133的仔细研究−肿瘤，如UM-COLON#4，显示CD133在原发肿瘤中不表达，并且在序列中仍然不表达体内NOD/SCID小鼠的移植(SI图12). CD44和CD133表达的联合分析表明，当CD133被表达时，CD44+细胞通常为CD133+然而，在大多数情况下，CD133+人口大于CD44+一个，和CD44+细胞代表CD133的少数亚群+人群，在CD133主要阳性的肿瘤中清晰可见(SI图11).ALDH酶活性分析表明，EpCAM高的/CD44细胞+细胞具有较高的ALDH水平。然而，ALDH活性对于分离某些（但不是所有）CRC异种移植物中的致瘤细胞是有用的(SI图13).

CD166作为候选Co-CSC标记的鉴定。

然后，我们决定将研究重点放在表面标记物上，这些标记物的表达先前已通过免疫组织化学方法在原发性肿瘤上进行了评估，并且被描述为在CRC细胞中具有异质性。在再次通过流式细胞术进行的第二次筛选中，我们的注意力被CD166分子所吸引，CD166是一种显示CRC上皮细胞异质表达模式的间充质干细胞标记物(15,16)并且其表达水平的增加先前与CRC患者的不良临床结果相关(16). 我们观察到CD166分子在上皮性癌细胞中有差异表达，并且所有分析的肿瘤都含有一个独特的EpCAM高的/CD44细胞+/CD166型+单元子集(图4和​和5）。5). CD166在所有异种移植物、原发肿瘤和正常结肠上皮中的差异表达是一致且可重复的(图4和​和55和SI图14). 总的来说，在正常大肠粘膜中(n个=7），EpCAM的频率高的/CD166型+细胞在活组织细胞总数（DAPI）的0.5%至7%（平均值=2.8%）之间−)以及占总活上皮细胞（DAPI）的0.5%至10%（平均值=3.7%）−，林−). 原发性CRC肿瘤(n个=6），EpCAM的频率高的/CD166型+细胞占总活肿瘤细胞（DAPI）的1.2%至16%（平均值=6%）−)活上皮细胞总数（DAPI）的1.5%至24%（平均值=10%）−，林−). 为了评估CD166作为Co-CSC标记物的作用，我们在UM-COON#4异种移植细胞系上进行了第二轮致瘤性实验，根据CD44和CD166的表达对癌细胞进行分类(图4B). 结果表明，在这种肿瘤中，致瘤细胞仅限于CD44+/CD166型+群体，表明CD166可以作为一个额外的Co-CSC标记物，与CD44无关且具有协同作用(表1和SI表4).

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CD44和CD166在人CRC异种移植物中的共表达。(A–D)对人CRC异种移植物中CD166表达的分析表明，CD166在癌细胞群中有差异表达，并且所有分析的肿瘤都含有不同的CD44+/CD166型+双阳性细胞亚群。

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正常和恶性原发性结直肠组织中CD44/CD166和EpCAM/CD166的表达谱。原发组织CD44/CD166表达谱分析证实正常大肠上皮中CD44/CD166共表达(E类和G公司)和原发性CRC肿瘤(C类)外形与CRC异种移植物相似(A类). 如预期，CD166+细胞主要是EpCAM高的(B,D类,F类，以及H（H）). 使用B29.1抗ESA单克隆抗体（Biomeda）分析EpCAM的表达。流量图中报告的百分比表示闸门P9中包含的细胞百分比。

最后，为了证明EpCAM高的/CD44细胞+/CD166型+人口代表Co-CSC的原始水库体内在人类患者中，由于异种移植（例如，由于小鼠皮下环境中表面标记物表达的调节），Co-CSC未富集，我们根据EpCAM、CD44和CD166的表达，直接从原发性CRC组织中分选和注射Co-CSC。与异种移植物相比，原发性手术标本的致瘤性实验更难标准化，因为其体积更小，细胞产量更低。然而，我们能够首先证明致瘤细胞仅限于EpCAM高的/CD166型+并随后将其表型进一步指定为EpCAM高的/CD44细胞+/CD166型+使用两个独立的原发肿瘤(表1和SI表4). 目前正在调查这些发现在一系列较大病例中的再现性。

讨论

综上所述，我们的发现将人类肿瘤干细胞工作模型扩展到了CRC，并为Co-CSC分离提供了一个可靠且可重复的表面标记图谱。我们的研究结果表明，在一些结肠肿瘤中，EpCAM和CD44作为Co-CSC的标志物比最近报道的标志物CD133更强大(8,9)因为CD44在不表达CD133的肿瘤中具有信息性，并且允许在CD133中进一步富集Co-CSC+子集。此外，我们的数据表明，在一些CRC肿瘤中，包括异种移植瘤和原发性肿瘤，CD166可以用于在EpCAM中进一步富集Co-CSC高的/CD44细胞+人口。

我们的发现具有许多潜在的生物学和治疗意义(1–三,17,18). 从生物学角度来看，CSC模型引入了一个额外的概念框架和一层复杂性来解释肿瘤内异质性（即同一肿瘤病灶内癌细胞之间的异质性），这是原发性和转移性CRC的一个共同特征(19). 根据CSC模型，肿瘤内异质性不仅是由不同基因突变积累而产生的多个独立的肿瘤亚克隆在同一质量内共存的结果，而且也是由细胞混合而成，尽管起源于基因单克隆，它们的分化功能状态不同。事实上，本研究中使用的Co-CSC分离（CD44）标记之一是人类结肠粘膜中一个成熟的、不成熟的分化标记(20).

基于这一观点，CSC模型可能有助于解释CRC生物学中意外的观察结果，例如在原发性和转移性CRC病灶中存在异质模式和非结构性端粒酶激活机制(21). 此外，CSC模型可以阐明转移瘤的生物学，并解释为什么尽管存在广泛的肿瘤内异质性，但对同一患者的原发肿瘤和自体转移瘤的配对样本进行比较，往往会显示出高度的相似性(19,22–24). 这一观察结果在CRC中得到了很好的证实，涵盖了不同的参数，如组织形态学(19,25)，体细胞基因突变库(26,27)抑癌和免疫调节蛋白的表达(28)和整体转录谱(29). 事实上，如果我们假设在每个单独的CRC中，分化模式由特定的基因突变库控制，我们可以预测，如果两个病灶具有相同的遗传背景和相似的遗传异常，它们也将经历相似的分化程序，并在分化标记物的表达中显示出相似的瘤内异质性模式。这一预测与我们的观察一致，即每个CRC异种移植物系都具有独特且恒定的EpCAM比率高的/CD44细胞+与EpCAM对比低的/CD44细胞−细胞群，在连续移植中及时保持。

最后，观察到CRC的生长是由少数具有独特功能特性的肿瘤细胞亚群维持的，这有助于设计新的更有效的预后工具(30)和抗肿瘤治疗(31). 根据CSC模型，不能根除CSC亚群的治疗方法不太可能成功，因为它们可能能够杀死大多数肿瘤细胞并诱导肿瘤病变的消退，但不能防止疾病复发和转移扩散(1,2). 基于这一概念，可以重新评估传统治疗方法并开发新的试验性治疗方法，重点是针对CSC及其特定生化途径的能力(2,三). 同样，CSC模型可以解释为什么尽管进行了广泛的临床前验证，但许多实验治疗方法仍显示出较差的临床效果在体外并可能为其重新设计和升级提供有用的信息，例如在针对CRC的免疫治疗中，可以根据Co-CSC的表达重新评估靶抗原选择(32).

材料和方法

肿瘤组织和异种移植物系。

本研究中使用的人CRC组织列于SI表2以及与相应患者相关的临床信息。2004年至2006年期间，根据密歇根大学和斯坦福大学机构审查委员会批准的方案收集所有初级组织。所有参与研究的患者均获得知情同意。所有CRC异种移植物系都是通过在6-8周龄NOD/SCID小鼠（Charles River Laboratories，Wilmington，MA）中皮下植入固体组织碎片建立的，唯一的例外是MICOL-69，它是在CD1“裸鼠”中建立的（Charles River Laborations）。简单地说，用剪刀将原发性CRC组织标本切成小的（2毫米三)用10号Trochar针穿过动物右背侧翼的一个小切口，将碎片植入皮下。通过静脉注射氯胺酮（75 mg/kg）-甲苯噻嗪（5 mg/kg）混合物麻醉NOD/SCID受体小鼠。一旦建立，实体瘤异种移植物通过使用相同的技术进行连续传代。在本研究中使用的10种异种移植物系中，一种（MICOL-69）起源于意大利米兰国家癌症研究所，五种（UM-COON#4、#6、#8、#13、#21）起源于密歇根大学，两种（SU-COON#29、#43）起源于斯坦福大学，两个（OMP-C5、C8）起源于Oncomed Pharmaceuticals，Inc。密歇根大学和斯坦福大学建立的异种移植物系是14个独立系的一部分，这些系来源于19个不同的初级CRC标本，估计移植率为73%(n个=第14页，共19页）。对肿瘤组织进行组织化学和免疫组织化学分析，如SI材料和方法.

固体组织分解。

如Al-Hajj所述，从初级外科标本或小鼠异种移植物中采集的实体组织，包括正常组织和肿瘤组织，通过机械和酶分解成单细胞悬浮液，并通过流式细胞术进行分析等。(5). 用剪刀将固体组织切成小块（2-mm三)碎片，并在100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中用6.5 mM DTT（溶血素试剂；Calbiochem，加利福尼亚州拉荷亚）在室温下培养15分钟，以去除粘液污染。轻轻取出DTT溶液后，用Hank的平衡盐溶液（HBSS）冲洗组织碎片一次，再悬浮在无血清RPMI培养基1640（2 mmol/L）中我-谷氨酰胺、120μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μg/ml头孢他啶、0.25μg/ml两性霉素-B、20 mmol/l Hepes）和200单位/ml III型胶原酶（沃辛顿，莱克伍德，新泽西州）和100单位/ml DNase I（沃辛斯顿），并在37°C下培养2小时以获得酶解聚。然后通过移液管重新悬浮细胞，并使用无菌纱布和70-μm和40-μm尼龙网进行连续过滤。通过渗透溶解去除污染的红细胞（即在氯化铵-磷酸钾低渗缓冲液中在冰上培养5分钟）。

流式细胞术和细胞分选实验。

为了尽量减少实验变异性和细胞活力的损失，所有实验均在流式细胞术前不久制备的新鲜肿瘤细胞悬浮液上进行。在补充有2%热灭活小牛血清和20 mM Hepes的HBSS中进行抗体染色。为了尽量减少抗体的非特异性结合，首先用0.6%的人免疫球蛋白（Gammagard Liquid；Baxter，Westlake Village，CA）在冰上培养细胞10分钟，细胞浓度为3到5×105/100微升。随后对细胞进行清洗，并用抗体对每个异种移植物系进行滴定实验确定的稀释液进行染色。本研究中使用的抗体包括：抗人ESA-FITC（克隆B29.1；Biomeda）、抗人CD44-APC（克隆G44-26；BD Biosciences，加利福尼亚州圣地亚哥）、抗人类CD166-PE（克隆105902；R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）、抗人体CD49f-PE（克隆GoH3；BD bioscience）和抗人CD133-PE（clone AC133、293C3和AC141；Miltenyi Biotec，加利福尼亚州奥本）。在所有实验中，非上皮谱系标记表达阳性的细胞（Lin+)用PE.Cy5标记的抗体对原代组织和小鼠异种移植采用两种不同的策略进行染色，以排除。在对原代人体组织的实验中，通过同时用抗人CD3-PE.Cy5（克隆UCHT1；BD Biosciences）、CD10-PE.Cy五（克隆HI10a；BD bioscience）、CD16-PE.Cy5（clone 3G8；BD生物科学）、CD18-PE.Cy 5（克隆6.7；BD Biosciences；DakoCytomation，Carpindia，CA）。在CRC异种移植物实验中，通过同时用抗小鼠CD45-PE.Cy5（克隆30-F11；BD Biosciences）和抗小鼠H-2K染色来排除小鼠细胞d日-生物素（克隆SF1–1.1；BD Biosciences）+链霉亲和素-PE.Cy5。在冰上15分钟后，将染色的细胞洗涤掉多余的未结合抗体，并重悬于补充有2%热灭活小牛血清、20mM Hepes和1.1μM DAPI二乳酸盐（Molecular Probes，Eugene，OR）作为活力染料的HBSS中。按照制造商的说明，使用Aldefluor系统（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市StemCell Technologies Inc.）对ALDH酶活性进行分析。使用BD-FACSAria细胞分选仪（加州圣何塞Becton Dickinson）进行流式细胞仪分析。前向散射面积与前向散射宽度剖面用于消除细胞加倍。通过排除DAPI来消除死细胞+细胞，而污染人类或小鼠林+通过排除PE.Cy5消除细胞+细胞。在细胞分选实验中，每个细胞群体都经历了两轮连续的纯化（双重分选），最终平均纯度>95%(SI图9).

致瘤性实验。

通过低速离心（850×克5分钟），并在添加了10%FBS、20 mM Hepes和2 mM的RPMI 1640中重新悬浮我-谷氨酰胺。在所有实验中，使用常规技术（即台盼蓝排除试验），将一小部分细胞放在一边，以确认细胞计数和活力。一旦确认细胞计数和存活率，将细胞稀释至适当的注射剂量，以1:1的比例与BD Matrigel（BD Biosciences）混合，并在NOD/SCID小鼠两侧腹侧注射皮下注射(SI图9). 为了最大限度地减少由于受体小鼠个体差异造成的实验变异性，将接受比较的细胞群注射在同一动物的对侧(SI图9). 对注射的小鼠进行长达5个月的随访，并在肿瘤最大直径达到15 mm时将其杀死。按照SI材料和方法。所有涉及动物使用的实验均按照密歇根大学和斯坦福大学动物福利机构指南进行。

补充材料

支持信息：

致谢

我们感谢David J.Adams在流式细胞术和细胞分类实验方面提供的非凡技术支持，感谢Michael W.Becker博士的宝贵意见，感谢Nancy McAnsh在免疫组织化学方面的帮助，感谢Donna Renner-Chuey在初级组织采集方面的帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院CA104987和CA126524（致M.F.C.）、弗吉尼亚和D.K.路德维希基金会（M.F.C。

缩写

ALDH公司醛脱氢酶
CK20型细胞角蛋白-20
Co-CSC公司结直肠癌干细胞
CRC公司结直肠癌
CSC公司肿瘤干细胞
EpCAM公司上皮细胞粘附分子
欧洲安全局上皮特异性抗原
NOD/SCID编号非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷。

脚注

利益冲突声明：S.J.D.、I.-K.P.、X.W.、T.H.和A.G.是Oncomed Pharmaceuticals，Inc.的员工，该公司是一家生物技术公司，已申请与本研究相关的专利。M.F.C.是Oncomed Pharmaceuticals，Inc.付费咨询委员会的成员，拥有该公司的股票期权。P.D.和M.F.C被列为与本研究相关的专利创新者。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/cgi/content/full/0703478104/DC1.

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院