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生理学杂志。2006年12月1日；577（第2部分）：705–716。
2006年9月14日在线发布。 数字对象标识：10.1113/jphysiol.2006年11月14日33
预防性维修识别码：项目经理1890436
PMID：16973705

杂合HIF-1α缺乏对间歇性缺氧小鼠颈动脉体介导的系统反应和活性氧生成的影响

英杰鹏,1 袁国祥,1 Deviprasadh罗摩克里希南,2 苏雷什·D·夏尔马,2 Marta Bosch-Marce公司,三 加内什·K·库马尔,2 格雷格·塞门扎,三和Nanduri R Prabhakar公司1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

慢性间歇性缺氧（CIH）发生于睡眠呼吸暂停患者，对多种生理功能产生不利影响。先前的研究表明，颈动脉体产生的反射介导了CIH引起的心肺反应，而活性氧（ROS）在引起对CIH的全身反应中发挥着重要作用。对于CIH的分子机制知之甚少。转录激活物低氧诱导因子-1（HIF-1）介导广泛的细胞和全身缺氧反应，HIF-1在接触IH的细胞培养物中被激活。在本研究中，我们检测了CIH是否激活HIF-1，如果是，它是否有助于小鼠的心脏呼吸反应和ROS生成。实验在雄性同窝出生的野生型（WT）和杂合型（HET）小鼠上进行，这些小鼠部分缺乏HIF-1α2HIF-1复合物的调节亚单位。两组小鼠均暴露于10天的CIH（缺氧15秒，然后常压5分钟，缺氧9次−1，每天8小时−1)或达到10天21%O2（控件）。颈动脉体对缺氧的反应增强，急性间歇性缺氧（AIH）诱导CIH暴露WT小鼠化学受体活性的感觉长期促进（sLTF）。与此形成鲜明对比的是，缺氧感觉反应未受影响，AIH对CIH暴露的HET小鼠诱导sLTF无效。对CIH暴露的WT小鼠的心肺反应分析显示，缺氧通气反应增强，呼吸LTF增加，血压升高，血浆去甲肾上腺素增加。与此形成鲜明对比的是，暴露于CIH的HET小鼠中，这些反应要么缺失，要么减弱。在CIH暴露的WT小鼠中，ROS升高，而HET小鼠中没有这种反应。五氯化锰（III）四（1-甲基-4-吡啶基）卟啉是一种有效的超氧物清除剂，不仅可以阻止CIH诱导的ROS增加，还可以阻止CIH-诱导的WT小鼠HIF-1α上调。这些结果表明：（a）HIF-1激活对激发CIH诱导的颈动脉体介导的心肺反应至关重要；（b） CIH增加ROS；和（c）CIH的作用涉及HIF-1和ROS之间复杂的正相互作用。

睡眠呼吸障碍导致反复窒息（暂时停止呼吸）的患者经历慢性间歇性缺氧（CIH）。颈动脉体是检测动脉血氧变化的感觉器官。最近的研究表明，CIH选择性地增强颈动脉体对缺氧的感觉反应(Peng和Prabhakar，2004年;雷伊等。2004)急性间歇性缺氧（AIH）导致CIH的感觉长期易化（sLTF），但在对照颈动脉体中没有(彭等。2003). 这种影响对CIH具有选择性，因为持续缺氧的时间相当，既不会增加缺氧感觉反应，也不会诱导sLTF(彭等。2003;Peng和Prabhakar，2004年). 对反复发作性呼吸暂停患者和接触CIH的实验动物的研究表明，颈动脉体产生的反射对于引起CIH引起的血压升高、交感神经活动增强和呼吸神经化学控制异常至关重要(弗莱彻等。1992;Cistulli&Sullivan，1994年;卡拉等。2003). 然而，对CIH的分子机制知之甚少。

转录激活物低氧诱导因子1（HIF-1）是O2控制多种生理过程并调节数百个基因表达的体内平衡(马纳洛等。2005;温格等。2005;Hirota&Semenza，2006年). HIF-1是一种异二聚体蛋白，由组成性表达的HIF-1β亚单位和O2-调节HIF-1α亚单位(王等。1995). HIF-1α完全缺乏导致妊娠中期胚胎死亡，而Hif1a型+/−部分缺乏HIF-1α表达的杂合（HET）小鼠发育正常，在常氧条件下与野生型（WT）同窝出生的小鼠无法区分(Iyer公司等。1998;于等。1999). 然而，成年HET小鼠的颈动脉体对缺氧的反应选择性受损，表明HIF-1在O2颈动脉体感应(克莱恩等。2002). 最近，我们报道了IH通过一种新的钙/钙调素-蛋白激酶依赖机制增加嗜铬细胞瘤（PC12）细胞中HIF-1α的表达和HIF-1介导的转录(元等。2005). 然而，在接触CIH的动物中HIF-1α的表达是否增加，如果增加，HIF-1是否有助于CIH诱发的心脏再呼吸反应，尚不清楚。因此，本研究的第一个目的是研究CIH对成年WT和HET小鼠HIF-1α表达以及颈动脉体和外周化学受体介导的心脏呼吸反应的影响。

最近的研究表明，CIH增加了活性氧物种（ROS），如顺乌头酸酶活性降低所示(彭等。2003;元等。2004;古玛等。2006)以及蛋白质氧化增加，以硫代巴比妥酸反应物质（TBARS；拉马纳坦等。2005). 据报道，反复窒息导致CIH患者ROS生成增加(Dyugovskaya公司等。2002). 在实验模型中，抗氧化剂可以防止CIH引起的颈动脉体活动的变化(彭等。2003)，增强发射器分泌(基姆等。2004)，血压升高(古玛等。2006)，以及立即早期基因激活(元等。2004). 这些研究表明，ROS的增加是引发对CIH的系统和细胞反应的重要信号。本研究的第二个目标是检查CIH是否增加小鼠的ROS，如果是，HIF-1是否有助于这种反应。

方法

动物的一般准备

实验由凯斯西储大学动物护理和使用委员会批准，并在雄性、年龄匹配（10-15周龄）的WT和HET小鼠上进行(Iyer公司等。1998;于等。1999;克莱恩等。2002)被不知道基因型的个体所控制。HET和WT小鼠的平均重量分别为29±0.6和28±1.1 g(P（P）>0.05，方差分析）。实验在清醒、自由和麻醉的小鼠上进行。

在需要镇静的实验中，通过腹腔注射氨基甲酸乙酯（1.2 g kg）对小鼠进行麻醉−1，西格玛）。选择氨基甲酸乙酯是基于实验动物动脉血的酸碱状态保持良好的报告(比尔凯·萨姆等。1978). 当角膜反射和脚趾夹伤反应持续时，给予初始剂量10%的补充剂量的麻醉剂。在麻醉动物中，常规手术包括气管插管和股动静脉插管。通过动脉导管采集血样进行血气分析。必要时，通过静脉导管完成液体的全身给药。允许小鼠自发呼吸。核心体温由直肠热敏电阻探头监测，并通过加热垫保持在37±1°C。实验结束时，通过心内注射（0.1 ml）安乐死溶液（Beuthanasia-D Special，Schering-Plough，Kenilworth，NJ，USA）杀死小鼠。

慢性暴露于间歇性缺氧（CIH）

将饲养在饲养笼中的自由活动的无约束小鼠暴露于CIH方案中，该方案包括15 s 5%的激发O2然后是5分钟的室内空气（常氧），9集h−1每天8小时−1如前所述持续10天(Peng和Prabhakar，2004年). 简单地说，小鼠被放在一个专门的房间里，用纯氮和压缩空气交替循环冲洗。缺氧时，激发O2水平达到5%O2（最低点）在50±2 s内，并保持在该水平15 s。随后，房间空气达到21%O2在55±4 s内保持5 min。气体流量由定时器控制的电磁阀调节。试验箱中的环境氧气水平由O连续监测2分析仪（Beckman；OM-11型）。灵感来源CO2用红外分析仪连续监测试验箱中的气体，并将其保持在0.2%至0.5%之间（Beckman；LB-2型）。对照实验是在小鼠身上进行的，这些小鼠在同一个室内暴露于压缩空气的交替循环中，而不是缺氧。除非另有说明，否则在终止10天的CIH或常压后3小时测量通气量、血压、颈动脉体活性和血浆去甲肾上腺素（NA）。

颈动脉体感觉活动的记录

颈动脉体的感觉活动体外如前所述进行了记录(彭等。2003). 简单地说，从麻醉小鼠身上采集颈动脉体和窦神经，将其置于记录室（容量为250μl）中，并以2ml min的速率过量使用温热生理盐水（35°C）−1培养基成分为（m米)：氯化钠（125）、氯化钾（5）、氯化钙2（1.8），硫酸镁4（2） ，NaH2人事军官4（1.2），NaHCO三(25),d日-葡萄糖（10）、蔗糖（5），用95%的O冒泡溶液2–5%一氧化碳2为了便于记录可清楚识别的动作电位，用0.1%胶原酶处理窦房神经5分钟。用吸引电极从其中一根神经束记录动作电位（2-5个活动单位），并通过a/D转换板存储在计算机中（澳大利亚AD仪器有限公司PowerLab/8P）。化学受体活性的标准包括对持续缺氧的反应增加感觉活性（即中断灌注5分钟），并在恢复灌注后恢复到基线水平。”使用尖峰辨别程序（尖峰直方图程序，功率实验室，AD仪器），根据个体动作电位的高度和持续时间选择单个单位。在每个颈动脉体中，至少分析了两个化学受体单位。这个P（P）O（运行）2和P（P）一氧化碳2通过血气分析仪（ABL 5，辐射计，哥本哈根，丹麦）测定超灌注培养基的含量。

通气量、代谢变量和动脉血压（BP）的测量

如前所述，使用全身体积描记器监测未接受麻醉的动物的通气情况(克莱恩等。2002). 简单地说，将动物放在一个600毫升的Lucite室中，该室中有一个气体给药入口，并允许它们在室内空气中适应1小时。将腔室连接到高增益差压传感器（Valydine MP45，Validyne，North Ridge，CA，USA）。当动物呼吸时，压力的变化被转换为代表潮气量的信号(V（V）T型)经放大（BMA 830；CWE，Ardmore，PA，USA），通过a/D转换板（PowerLab/8P）记录并存储在计算机中，以供进一步分析。氧气消耗量(V（V）˙O（运行）2)和一氧化碳2生产(V（V）˙一氧化碳2)通过以下描述的开路方法测定弗拉佩尔等。(1992)。使用以下方程式计算V（V）˙O（运行）2和V（V）˙一氧化碳2:

方程式图像

和

方程式图像

其中i表示进气，e表示排气，V（V）流量和F类分数浓度(弗拉佩尔等。1992). 在分析中监测并排除了叹息、嗅闻和运动引起的呼吸和代谢变量的变化。所有记录均在25±1°C的环境温度下进行。

使用无创血压系统（AD仪器）通过尾袖法监测未麻醉小鼠的血压。小鼠被放置在制造商提供的限制器中。在测量血压之前，允许小鼠适应至少1小时。

在麻醉动物中，监测膈神经传出综合活动，作为中枢呼吸神经元输出的指标。在C3和C4脊髓节段水平单侧分离膈神经。将神经远端切开，置于双极不锈钢电极上。单侧切断膈神经的一个小分支对自发呼吸没有明显影响。电活动被过滤（带通0.3–1.0 kHz）、放大并通过Paynter滤波器（时间常数100 ms；CWE Inc.）以获得移动平均信号。数据存储在计算机中以供进一步分析。

血浆去甲肾上腺素（NA）的测量

通过心脏穿刺从麻醉小鼠中采集血样（～300μl），并将其置于肝素化（30 U ml−1血液）冰镇微型离心管。血浆通过离心分离并储存在−80°C。以二羟基苄胺为内标物，采用高压液相色谱结合电化学检测（HPLC-ECD）测定血浆NA(基姆等。2004). NA水平根据恢复损失进行校正，并表示为NA纳克（100毫升血浆）−1.

HIF-1α和HIF-1β蛋白的分析

将麻醉小鼠的脑组织（皮层区域）取出，冷冻在液氮中并储存在−80°C。免疫印迹分析HIF-1α和HIF-1β蛋白(贝杰隆等。2000). 使用了以下抗体：抗HIF-1α单克隆抗体H1α67(钟等。2000)1:500稀释和HIF-1β单克隆抗体H1β234(扎扎格等。1999)1:1500稀释。使用增强化学发光（ECL）检测系统（Amersham Biosciences）观察膜上的抗体复合物。

硫代巴比妥酸反应性的测定秒物质（TBARS）

将皮质组织均匀化为10个20 m的体积米磷酸盐缓冲液（pH 7.4）在4°C下，所得匀浆在500℃下离心克在4°C下保持10分钟。如前所述，对上清液中的TBARS进行分析(拉马纳坦等。2005). 简单地说，将100μl样品或标准溶液添加到50μl 8.1%（w/v）SDS、375μl 20%（v/v）乙酸和375μl 0.8%（w/v）硫代巴比妥酸中。样品在沸水浴中加热60分钟，然后在冰浴中孵育10分钟，并在3000℃下离心克15分钟。去除上清液，并在532 nm处监测溶液的吸光度。丙二醛（MDA）被用作标准，TBARS的水平以每毫克蛋白质形成的MDA纳米数表示。

实验协议

系列1

短暂高氧（100%O2; Dejour试验）对接触CIH或常氧10天（WT；n个=每种情况下5只小鼠；HET；n个=6常氧，n个=7（对于CIH）。记录动物呼吸21%O时的基线膈肌活动25分钟，然后100%O2持续20秒。在21%O期间分析膈神经活动1分钟2在100%O之前2暴露和最后15s的高氧（最初5s因气管导管内有死腔而被排除）。实验结束时，采集动脉血样进行血气分析。在另一组实验中，颈动脉体对分级缺氧、氰化钠（NaCN，3μg ml）的反应−1)测定sLTF。对6只WT小鼠的12个颈动脉小体和7只HET小鼠的14个颈动脉体进行了实验；7只WT小鼠的14个颈动脉小体和6只HET小鼠的12个颈动脉体暴露于CIH。

系列2

在未麻醉的HET和WT小鼠中测定动脉血压(n个=8只）在CIH前后，每只动物作为自己的对照。当小鼠呼吸室内空气时，记录基础血压。测量血压后，在同一小鼠中测定缺氧和高碳酸通气反应。为了测量低氧通气反应（HVR），小鼠分别暴露于100、21和12%O2–余额N2每次气体激发持续5分钟。在20分钟间隔后重复方案。O（运行）2消耗和CO2在每次5min挑战结束时测量产量。为了测量高碳酸血症的通气反应，小鼠激发了100%O2持续5分钟，然后加入5%CO2–余额O2。该方案重复两次，每次方案之间间隔20分钟。

系列3

对未麻醉的WT和HET小鼠的长期呼吸促进（LTF）进行了分析(n个=8个），如结果所述。

系列4

分析接触CIH或常氧的麻醉WT和HET小鼠血浆NA的变化(n个=7个）。

系列5

通过免疫印迹法分析接触CIH或常氧的麻醉WT和HET小鼠皮层组织中HIF-1α和HIF-1β蛋白水平(n个=每组5只小鼠）。

在相同的组织样本中分析TBARS。在另一组实验中，对CIH和正常小鼠进行了TBARS和HIF-1α的分析(n个=5个）用超氧化物歧化酶模拟锰（III）四（1-甲基-4-吡啶基）卟啉五氯化物（MnTMPyP，Alexis Chemicals，5 mg kg−1白天−1腹腔注射。)，一种有效的O清除剂2•−.

数据分析

在未感知的小鼠中分析以下变量：潮气量(V（V）T型; μl）；呼吸频率（RR min−1); 分钟通风(V（V）˙E类; ml最小值−1（克体重）−1); O（运行）2消费(V（V）˙O（运行）2; ml最小值−1); 一氧化碳2生产(V（V）˙一氧化碳2; ml最小值−1); 收缩压、舒张压和平均动脉血压（mmHg）。呼吸变量（RR和V（V）T型)平均连续15次呼吸，持续5分钟2和CO2挑战。V（V）T型和V（V）˙E类根据动物的体重标准化。每个数据点代表给定动物针对给定气体挑战的两次试验的平均值。对麻醉动物的下列呼吸变量进行了分析：呼吸频率（RR；膈肌破裂min−1)膈神经综合活动幅度（a.u.，任意单位）和分钟神经呼吸（膈肌爆发次数min−1，RR×综合膈神经活动的幅度，a.u.）。颈动脉体感觉活动（“单个”单元的放电）在基线检查的3分钟和气体激发的3分钟内平均，并表示为脉冲−1除非另有说明。所有数据均表示为平均值±s.e.m.公司。通过双向方差分析和重复测量以及Tukey检验评估统计显著性。P（P）值<0.05被认为是显著的。

结果

CIH对颈动脉体活动的影响

急性高氧通气反应（Dejour试验）

短暂高氧暴露引起的短暂通气功能下降的幅度被用作外周化学感受器，特别是颈动脉体敏感性的指标(Dejour，1962年). 与接触CIH的HET小鼠相比，CIH暴露的WT小鼠表现出明显更大的分钟神经呼吸抑制(图1). 这些观察结果表明，CIH增加了WT小鼠的外周化学受体敏感性，但在HET小鼠中没有。

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短暂高氧（Dejour试验）对分钟神经呼吸（MNR）的影响

A类，膈神经传出对短暂（20 s）暴露于100%O的反应2（如箭头所示）处于麻醉状态，自主呼吸Hif1a型+/+（WT，顶部面板）和Hif1a型+/−（HET，底部面板）小鼠接触CIH 10天博士，综合传出膈神经活动。A.U.，任意单位。B类，平均值（±s.e.m.公司。)MNR变化[（MNR21%–MNR100%)/MNR公司21%].N个，小鼠数量*P（P）< 0.05; N.S.，不显著。

颈动脉体对分级缺氧的感觉反应

为了直接确定CIH对化学受体缺氧反应的影响，从体外颈动脉体。WT和HET小鼠颈动脉体对缺氧的感觉反应（“单一”纤维反应）示例和平均数据图见图2CIH-暴露WT小鼠的颈动脉体表现出比对照组（即正常毒性WT小鼠颈动脉体）更大程度的缺氧感觉反应。对照HET小鼠表现出低氧感觉反应迟钝，CIH对增强低氧敏感性几乎没有作用(图2B类). 然而，两组小鼠的颈动脉体对氰化物（3μg ml−1)CIH前后感觉活动增加相当（CIH前：WT，+8.1±1脉冲s−1和HET，+8.6±0.9脉冲s−1; IH:WT后，+9.6±2.3脉冲s−1和HET，+8.7±1.7脉冲s−1).

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CIH对颈动脉体感觉活动的影响

A中，缺氧的感觉反应（黑条）Hif1a型+/+（WT，左侧面板）和Hif1a型+/−（HET，右面板）小鼠暴露于常氧（对照）或CIH 10天。P（P）O（运行）2，O分压2在灌流液中。数据来源的“单个”纤维的叠加动作电位如图所示（插图）。B类，对分级缺氧的平均感觉反应表现为脉冲s的变化−1（低氧-基线）。所示数据为平均值±s.e.m.公司。*P（P）< 0.05. 方法中给出了每组动物的数量。

颈动脉体的感觉长期易化（sLTF）

先前的研究表明，急性间歇性缺氧（AIH）仅在CIH后才会导致颈动脉体的sLTF(彭等。2003). 我们研究了HIF-1在诱发颈动脉体sLTF中是否起作用。AIH对对照WT和HET小鼠的sLTF诱导无效。然而，AIH在WT中容易诱发sLTF，但在接触CIH的HET小鼠中不易诱发(图3).

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颈动脉体的感觉长期易化（sLTF）

上面板，颈动脉体的sLTFHif1a型+/+（WT，左侧面板）和Hif1a型+/−（HET，右面板）小鼠接触CIH 10天。五次短暂（30 s）的急性缺氧（箭头所示）可诱导感觉性LTF。连续的白线表示基线感觉活动。数据来源的“单个”纤维的叠加动作电位如图所示（插图）。底部面板，平均值(+s.e.m.公司。)感官活动表示为基线活动的百分比。急性缺氧后，急性间歇性缺氧后。方法中给出了每组动物的数量。

CIH的通气和血压反应

缺氧通气反应（HVR）

两组小鼠的HVR和平均数据作为百分比对照的示例如下所示图4.呼吸变化和代谢变量的绝对值(V（V）˙O（运行）2,V（V）˙一氧化碳2,V（V）˙E类/V（V）˙O（运行）2，对流需求的一种衡量标准）表1在CIH之前，两组小鼠对21%O和12%O的反应都增加了通气量2而且增长幅度相当。V（V）˙E类/V（V）˙O（运行）221和12%O期间2HET的发病率往往高于WT，但差异无统计学意义(P（P）> 0.05).

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CIH对低氧通气反应的影响

A、，呼吸100、21和12%O时的通风2在里面Hif1a型+/+（WT，左侧面板）和Hif1a型+/−（HET，右面板）小鼠在CIH前（对照）和10天后。V（V）T型，潮气量。B、，平均呼吸频率（RR），V（V）T型和分钟通风(V（V）˙E类)表示为基线活动的百分比（100%O2). 开条和闭条分别表示CIH之前和之后的响应。所示数据均为平均值+s.e.m.公司。每组八只动物*P（P）< 0.05.

表1

WT和HET小鼠CIH前后的缺氧通气反应

CIH之前CIH之后
100%O221%O212%O2100%O221%O212%O2
重量(n个= 8)
 RR（最小呼吸次数−1)167 ± 7176 ± 4265 ± 12153 ± 6189 ± 7284 ± 13*
 V（V）T型（微升克−1)1.64 ± 0.151.71 ± 0.141.86 ± 0.141.82 ± 0.171.94 ± 0.142.22 ± 0.17
 V（V）˙E类（毫升克−1最小值−1)0.27 ± 0.020.30 ± 0.020.49 ± 0.040.28 ± 0.020.37 ± 0.03*0.64 ± 0.06*
 V（V）˙O（运行）2（毫升克−1最小值−1)0.09 ± 0.010.07 ± 0.0050.04 ± 0.0040.11 ± 0.010.08 ± 0.0080.04 ± 0.004
 V（V）˙一氧化碳2（毫升克−1最小值−1)0.04 ± 0.0040.05 ± 0.0050.03 ± 0.0020.04 ± 0.0030.05 ± 0.0030.03 ± 0.002
 V（V）˙E类/V（V）˙O（运行）23.22 ± 0.304.63 ± 0.4514.7 ± 2.132.87 ± 0.364.85 ± 0.5917.7 ± 1.73*
HET公司(n个= 8)
 RR（最小呼吸次数−1)156 ± 7174 ± 5253 ± 14157 ± 12169 ± 9249 ± 14
 V（V）T型（微升克−1)1.86 ± 0.131.99 ± 0.122.00 ± 0.141.93 ± 0.132.08 ± 0.092.18 ± 0.15
 V（V）˙E类（毫升克−1最小值−1)0.28 ± 0.010.34 ± 0.020.50 ± 0.030.30 ± 0.030.35 ± 0.020.53 ± 0.03
 V（V）˙O（运行）2（毫升克−1最小值−1)0.10 ± 0.0080.06 ± 0.0040.03 ± 0.0020.09 ± 0.0050.06 ± 0.0050.03 ± 0.004
 V（V）˙一氧化碳2（毫升克−1最小值−1)0.05 ± 0.0060.04 ± 0.0020.03 ± 0.0030.05 ± 0.0060.05 ± 0.0040.03 ± 0.003
 V（V）˙E类/V（V）˙O（运行）23.09 ± 0.325.63 ± 0.3815.63 ± 1.633.48 ± 0.276.11 ± 0.3616.5 ± 1.24

所示数据均为平均值+s.e.m.公司。 n个=小鼠数量。

*P（P）与CIH前的反应相比，<0.05。

CIH后，WT小鼠的反应是V（V）˙E类21和12%O期间2与CIH之前相比。这增加了V（V）˙E类主要是因为RR显著增加(图4和表1). 然而V（V）˙E类/V（V）˙O（运行）221%O期间2保持不变，但在12%的O期间显著增加2(P（P）< 0.05). 相反，通气反应（RR，V（V）T型,V（V）˙E类)和V（V）˙E类/V（V）˙O（运行）221和12%O期间2与CIH前对照组相比，CIH暴露的HET小鼠几乎保持相同(图4和表1). 中的更改V（V）˙一氧化碳2(表1)和动脉血气(表2)在CIH前后HET和WT小鼠中具有可比性。

表2

WT和HET小鼠CIH前后动脉血气的变化

重量HET公司
CIH之前(n个= 5)CIH之后(n个= 5)CIH之前(n个= 5)CIH之后(n个= 4)
P（P）美国航空公司2129 ± 5134 ± 4133 ± 6135 ± 3
P（P）aCO公司236 ± 337 ± 337 ± 338 ± 3
酸碱度7.27 ± 0.027.26 ± 0.057.28 ± 0.027.27 ± 0.01

所提供的数据为平均值+s.e.m.公司。 n个=小鼠数量。

高碳酸通气反应

在CIH之前，两组小鼠都对5%的CO产生反应2随着RR的增加，V（V）T型和V（V）˙E类(图5). 与HVR不同，CIH后WT和HET小鼠对CO的通气反应增强2(表3).

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CIH对高碳酸血症通气反应的影响

A、，呼吸时通风100%O2和5%CO2在里面Hif1a型+/+（WT，左侧面板）和Hif1a型+/−（HET，右图）小鼠在CIH之前（对照）和之后10天。V（V）T型，潮气量。B、，平均呼吸频率（RR），潮气量(V（V）T型)和分钟通风(V（V）˙E类)表示为基线活动的百分比（100%O2). 开放栏和填充栏分别表示CIH之前和之后的响应。所示数据均为平均值+s.e.m.公司。每组八只动物*P（P）< 0.05.

表3

CIH前后WT和HET小鼠对高氧高碳酸血症的通气反应

CIH之前CIH之后
100%O25%一氧化碳2100%O25%一氧化碳2
重量(n个= 8)
 RR（最小呼吸次数−1)167 ± 7254 ± 9153 ± 6265 ± 14
 V（V）T型（微升克−1)1.64 ± 0.152.09 ± 0.191.82 ± 0.172.57 ± 0.23
 V（V）˙E类（毫升克−1最小值−1)0.27 ± 0.020.52 ± 0.030.28 ± 0.020.67 ± 0.05*
HET公司(n个= 8)
 RR（最小呼吸次数−1)156 ± 7238 ± 15156 ± 12274 ± 10*
 V（V）T型（微升克−1)1.86 ± 0.132.6 ± 0.21.93 ± 0.132.93 ± 0.27
 V（V）˙E类（毫升克−1最小值−1)0.28 ± 0.010.61 ± 0.050.30 ± 0.030.81 ± 0.09*

所示数据均为平均值+s.e.m.公司。

*P（P）与CIH前的反应相比，<0.05。

呼吸的长期促进（LTF）

采用以下策略检查CIH对未麻醉小鼠呼吸LTF的影响。如果呼吸LTF是由CIH引起的，则应在终止CIH后立即提高基线呼吸，并应在将小鼠置于室内空气中数小时内恢复到控制水平。为了测试这种可能性，在终止CIH后的～2小时（上午）和～8小时（下午）内监测WT和HET小鼠的基线通气。在相同的小鼠上进行对照实验，在上午和下午测定通气量，然后将其暴露于10天的CIH中。这些实验的结果显示在图6在CIH之前的控制状态下，基线V（V）˙E类在上午或下午测量时，在HET和WT小鼠之间具有可比性。然而，在CIH暴露的WT小鼠中，V（V）˙E类终止CIH（上午）后的～2小时显著高于～8小时（下午）后监测的通气量。基线的增加V（V）˙E类是由于RR显著升高(P（P）< 0.01). 另一方面，在HET小鼠中，基线水平没有显著增加V（V）˙E类终止CIH后约2小时出现(图6).

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呼吸的长期促进（LTF）

呼吸21%O时的平均分钟通气量（标准化为体重（BW））2没有审美感Hif1a型+/+（重量）和Hif1a型+/−（HET）小鼠在完成10天的CIH后2小时（上午）和8小时（下午）进行监测。终止CIH（早上）后不久测得的分钟通气量增加被视为呼吸LTF。控制，CIH前分钟通风。所示数据均为平均值+s.e.m.公司。每组8只小鼠*P（P）< 0.05.

动脉血压和血浆NA水平

为了测试HIF-1在CIH诱导的心血管改变中的作用，我们测量了WT和HET小鼠的动脉血压。结果总结如下图7A类CIH前，两组小鼠的收缩压、舒张压和平均血压具有可比性。CIH后，WT小鼠的血压显著升高，但HET小鼠的血压没有显著升高。WT小鼠血压升高是由于收缩压和舒张压升高所致(图7A类). 由于CIH增加交感神经活动(卡拉等。2003)测定血浆NA水平作为交感神经激活的指标。HET小鼠血浆NA的基础水平往往低于WT小鼠，但差异无统计学意义(P（P）> 0.05). 然而，CIH后，WT小鼠的NA水平显著升高，而HET小鼠则没有升高(图7B类).

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CIH对血压（BP）和血浆去甲肾上腺素（NA）水平的影响

A、，平均BP inHif1a型+/+（WT，开杆，n个=8）和Hif1a型+/−（HET，填充钢筋，n个=8）小鼠，在CIH前（对照组）和10天后测量。MBP，平均血压；收缩压；舒张压，舒张压（mmHg）。B、，接触常氧（对照组）或10天CIH的WT和HET小鼠的平均血浆NA。N个，小鼠数量。数据显示于A类和B类都是卑鄙的+s.e.m.公司。*P（P）< 0.05.

CIH上调HIF-1α蛋白水平

为了测试CIH是否增加HIF-1α蛋白的表达，对接触CIH或常氧（对照）的WT和HET小鼠的大脑皮层进行免疫印迹分析。选择皮层组织是因为它能产生足够的蛋白质，用于对单个小鼠进行蛋白质印迹分析。免疫印迹分析的一个典型示例和从密度分析中获得的平均数据如下所示图8HET小鼠的基础HIF-1α表达显著低于WT小鼠。HIF-1α的表达在CIH暴露的WT小鼠中显著增加，但在接触CIH的HET小鼠中没有显著增加。对照组以及CIH暴露的WT和HET小鼠中HIF-1β的表达相似(图8).

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CIH对HIF-1α蛋白表达的影响

上图，野生型小鼠大脑皮层中HIF-1α和HIF-1β蛋白的免疫印迹(Hif-1a+/+)和HET(Hif-1a+/−)暴露于常氧（C）或CIH的小鼠。底部面板，HIF-1α表达相对于HIF-1β的密度分析平均数据。数据均为平均值+s.e.m.公司。每组5只小鼠**P（P）< 0.01, *P（P）< 0.05.

CIH对ROS水平的影响

先前的研究表明，CIH可增加ROS，抗氧化剂可防止CIH引起的心脏再呼吸反应(Peng和Prabhakar，2003年;古玛等。2006). 我们研究了CIH是否增加小鼠的ROS，如果是，HIF-1是否有助于这种反应。监测皮层组织样本中硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）的水平，作为活性氧的测量(拉马纳坦等。2005). WT和HET小鼠的基础TBARS具有可比性(图9A类). 在CIH暴露的WT小鼠中，TBARS显著(P（P）<0.01）升高70%，MnTMPyP是一种有效的O清除剂2•−，取消了此响应(图9A类和B类). 然而，MnTMPyP对基础TBARS没有影响。相反，CIH暴露HET小鼠的TBARS并没有增加(图9A类). 我们进一步研究了MnTMPyP是否影响接触CIH的WT小鼠HIF-1α蛋白的表达。如所示图9B类，MnTMPyP完全阻止了CIH诱导的WT小鼠HIF-1α的上调，而它对HIF-1β的表达或基础HIF-1α的表达没有影响。

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CIH诱导的ROS生成和HIF-1α表达

A、，分析硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）作为活性氧生成指标。顶部面板，WT大脑皮层中的平均TBARS(Hif1a型+/+)和HET(Hif1a型+/−)暴露于常氧（对照组）或10天CIH的小鼠。底部面板，MnTMPyP处理对对照组和CIH暴露的WT小鼠TBARS的影响。所示数据均为平均值+s.e.m.公司。每组5只小鼠。B中，ROS诱导的HIF-1α表达分析。顶部面板，免疫印迹法检测暴露于常氧（C）或10天CIH的WT小鼠大脑皮层中HIF-1α和HIF-1β蛋白的表达，无论是否同时给予MnTMPyP（5 mg kg）−1白天−1). 底部面板，密度测定数据（平均值+s.e.m.公司。)在每组5只小鼠的免疫印迹分析中显示为HIF-1α/HIF-1β比率。

讨论

本研究的一个主要发现是，在HIF-1α杂合缺陷小鼠中，CIH诱导的颈动脉体介导的心脏再呼吸变化不存在或显著减弱。HET小鼠对CIH的生理反应受损与HIF-1α上调缺失和ROS生成增加有关。

与之前对人类的研究一致(Cistulli&Sullivan，1994年;尔凯维奇等。1999)和实验动物(弗莱彻等。1992;Peng和Prabhakar，2003年;雷伊等。2004;古玛等。2006)在CIH暴露的WT小鼠中，我们观察到HVR增加、BP升高和血浆NA水平升高。尽管在CIH之前，WT和HET小鼠的HVR、BP和血浆NA具有可比性，但CIH对HET小鼠这些生理参数的影响实际上是无效的。先验，HET小鼠缺乏心脏反应可能是因为它们无法感知CIH刺激。然而，这种解释是不太可能的，因为这两组小鼠对一氧化碳的通气反应都增强了2遵循CIH。HET小鼠中HVR的显著缺失并不继发于代谢变量和血气成分的改变，因为V（V）˙一氧化碳2CIH暴露的WT和HET小鼠的血气具有可比性。暴露于CIH的WT小鼠的HVR增加也反映在V（V）˙E类/V（V）˙O（运行）2比率是衡量对流需求的指标，在HET小鼠中未发生变化。体温变化会影响HVR(戈蒂埃，1996年). 在目前的实验中，在HVR期间没有监测体温。然而，之前有报道称，12%O的5分钟2对小鼠体温无明显影响(克莱恩等。1998). 因此，体温的变化不太可能解释CIH暴露的HET小鼠缺乏增强的HVR。呼吸的LTF代表反复缺氧引起的呼吸运动输出的形式可塑性(Mitchell&Johnson，2003年). 接触CIH的WT而非HET小鼠可诱发呼吸LTF，这一事实表明，HIF-1α杂合缺陷不仅损害了CIH诱发的HVR、BP和血浆NA的变化，而且也损害了低氧诱导的呼吸运动输出的可塑性。

人类研究(尔凯维奇等。1999)和实验动物(弗莱彻等。1992;Peng和Prabhakar，2003年;雷伊等。2004)表明颈动脉体是检测动脉变化的主要化学受体P（P）O（运行）2，介导CIH引起的HVR、交感神经激活和BP的增加。在本研究中，通过两种方法评估颈动脉体功能：第一，通过记录短暂高氧时的通气反应，这是一种间接测量外周化学感受器功能的方法（Dejour试验），第二，通过直接监测“单个”化学感受器单元的感觉活动体外过度灌注的颈动脉小体，有效地消除了心血管变化对化学受体活性的影响。这两种方法均显示CIH暴露的WT小鼠颈动脉体对缺氧的反应显著增强，这一发现与之前对大鼠的研究一致(Peng和Prabhakar，2004年)和猫(雷伊等。2004). 本研究中观察到的对照WT小鼠高氧诱发的通气抑制（Dejour试验）的程度低于早先报道的水平(克莱恩等。2002). 然而，目前的研究仅使用雄性小鼠，而早期的研究使用了两性小鼠(克莱恩等。2002). 因此，性别差异可能是本研究中高氧导致通气抑制程度较低的原因。

我们还发现对照HET小鼠（即CIH暴露前）的缺氧感觉反应明显减弱。与WT小鼠相比，CIH对HET小鼠缺氧感觉反应的增强作用很小。除了对缺氧感觉反应的影响外，CIH还可以诱导大鼠颈动脉体的功能可塑性，表现为sLTF(彭等。2003). 我们的结果表明，CIH在WT小鼠中有效诱导sLTF，但在HET小鼠中无效。这些观察结果表明，HIF-1除了增强缺氧感觉反应外，在CIH诱导颈动脉体功能可塑性方面也起着关键作用，提示HET小鼠缺乏CIH诱发的心肺反应主要是由于HIF-1α缺乏导致颈动脉体功能受损。

对CIH增强的颈动脉体介导的心肺反应与WT小鼠HIF-1α蛋白表达上调有关。CIH上调HIF-1α的作用类似于大鼠慢性持续缺氧时的报道。随着持续缺氧暴露，HIF-1α表达逐渐减少(查韦斯等。2000). 然而，持续暴露于CIH是否也会出现类似的HIF-1α表达下降，还有待研究。尽管如此，目前的观察结果与公布的数据结合在一起(查韦斯等。2000)表明慢性持续性和CIH均上调完整动物中HIF-1α的表达。

正如预期的那样，HIF-1α杂合缺陷小鼠的HIF-1蛋白基础表达降低了约50%。我们预计暴露于CIH的HET小鼠的HIF-1α水平会增加，尽管与WT小鼠相比幅度较低。与我们的预期相反，我们在CIH暴露的HET小鼠中观察到HIF-1α表达没有增加。这些令人惊讶的结果表明，存在HIF-1依赖性前馈机制，可诱导和/或维持CIH暴露小鼠HIF-1α表达的增加，如下所述。无论潜在机制如何，这些结果表明，HET小鼠完全缺乏CIH诱发的生理反应与诱导HIF-1α表达的完全失败相关，从而为HIF-1β杂合缺陷相关的显著表型提供了基础。

最近的研究报道CIH增加了颈动脉体中的ROS(彭等。2003)，肾上腺髓质(古玛等。2006)以及中枢神经系统(拉马纳坦等。2005). 这些研究表明，ROS增加是诱发CIH心脏再呼吸反应的重要信号(Peng和Prabhakar，2003年,2004;古玛等。2006). 然而，哪些活性氧物种（O2−，H2O（运行）2，或OH−)在CIH诱导的心脏再呼吸反应中发挥作用，其在CIH期间增加生成的分子机制尚不清楚。本研究的以下结果表明，HIF-1在CIH诱导的ROS产生中发挥作用，并且ROS和HIF-1之间存在正的相互作用。首先，接触CIH的WT小鼠ROS水平升高，但HET小鼠的ROS水平没有升高，前者TBARS升高，后者TBARS却没有升高。其次，抗氧化剂治疗可防止CIH暴露的WT小鼠ROS生成增加和HIF-1α表达增加。我们假设CIH最初可能会触发ROS生成，可能与之前报道的线粒体电子传递链活性抑制有关(彭等。2003;元等。2004). 正如在其他实验环境中所描述的那样，ROS水平的增加上调了HIF-1α的表达(Kietzmann&Gorlach，2005年;古齐等。2005). 一旦HIF-1被激活，它可能会维持增加的ROS水平。ROS和HIF-1之间拟议的正相互作用如图所示图10该模型的验证和潜在分子机制的描述需要进一步研究。虽然HIF-1控制数百个基因的表达(马纳洛等。2005)这可能有助于观察到的表型，本研究的数据表明，HIF-1在活性氧生成和CIH的心脏再呼吸反应中起着以前未被认识的重要作用。

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ROS和HIF1之间拟议的积极互动

ROS生成的前馈机制、HIF-1激活颈动脉体基因表达和CIH的心脏呼吸反应。

致谢

这项工作得到了国立卫生研究院HL-25830的资助。

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文章来自生理学杂志由以下人员提供生理学会