Nestin-GFP报告基因表达定义骨骼肌卫星细胞的静止状态

摘要

介绍

肌肉的生长和修复依赖于卫星细胞，即位于肌纤维质膜和基底层之间的肌源性干细胞(Collins等人，2005年). 在出生后的生长过程中，卫星细胞增殖并产生成肌细胞，与增大的肌纤维融合。在成熟肌肉中，卫星细胞通常处于静止状态，除非受到肌肉创伤激活。当需要微小的修复时，卫星细胞可能会与现有的肌纤维融合，在大规模损伤后，它们可以产生更大的肌原细胞池以形成新的肌纤维(Grounds and Yablonka-Reuveni，1993年;霍克和加里，2001年). 常规肌肉活动期间发生的轻微肌肉损伤会导致终身对功能性卫星细胞的持续需求。卫星细胞性能受损可能导致肢体肌肉老化(Conboy等人，2003年;Shefer等人，2006年). 相反，与其他肌肉相比，眼外肌常驻卫星细胞的表现似乎没有下降(McLoon等人，2004年;波特等人，2003年). 综上所述，从不同解剖来源深入了解卫星细胞的分子特征可能有助于阐明卫星细胞在肌肉维持中的不同作用。

静止的卫星细胞通常表达配对homeobox转录因子Pax7，而其增殖子代共同表达Pax7和肌肉特异性转录因子MyoD(Seale等人，2000年;Shefer等人，2006年). Pax7的下降以及肌生成素的诱导标志着成肌细胞已进入分化阶段。在来源于卫星细胞的培养物中出现表达Pax7但不表达MyoD的细胞可能会划分出一个自我更新的群体(Halevy等人，2004年;Zammit等人，2004年). 当Myf5的一个等位基因被修饰为直接在Myf5中表达lacZ时，静止的卫星细胞也表现出表达β-半乳糖苷酶（β-gal）^{nlacZ公司/+}老鼠(Beauchamp等人，2000年). 然而，到目前为止，尚未确定静止卫星细胞中内源性Myf5的表达。

细胞培养和体内研究发现了来自不同肌肉的卫星细胞后代之间的差异，这增加了卫星细胞不一定包含同种祖细胞的可能性(Zammit等人，2006年). 然而，这些类型的研究只提供了卫星细胞异质性的间接证据，因为没有分析祖细胞本身。例如，来自不同肌肉类型的分化卫星细胞后代表现出独特的肌聚肌球蛋白亚型，这表明卫星细胞具有纤维类型特异性(达斯特霍夫特和佩特，1993年;Hoh和Hughes，1991年;Kalhovde等人，2005年;Rosenblatt等人，1996年). 与四肢肌肉相比，一些头部的肌源性祖细胞的不同增殖模式也被报道，这可能反映了这些肌肉类型的不同个体发生(McLoon等人，2004年;Noden和Francis-Wes，2006年;Pavlath等人，1998年). 修改小鼠Pax3基因座以驱动lacZ或GFP表达为卫星细胞异质性提供了直接证据；报告基因在膈肌和一些躯干肌肉的卫星细胞中普遍表达，但在后肢肌肉中表达较少(Relaix等人，2006年). 然而，这种异质性的基础尚不清楚，不能仅仅归因于肌肉个体发育或纤维类型组成。

阐明卫星细胞遗传蓝图并进一步了解其异质性，对于提高我们对衰老和疾病期间卫星细胞功能变化的理解至关重要。例如，在衰老过程中，与比目鱼肌（慢开关）相比，趾长伸肌（EDL；快抽搐）卫星细胞数量下降的不同速度可能反映了常驻卫星细胞的肌型依赖性异质性(Shefer等人，2006年). 同样，观察到的卫星细胞子代与营养不良（mdx）肌肉的加速分化可能反映了祖细胞的固有变化(Yablonka Reuveni和Anderson，2006年). 然而，如果不对祖细胞进行详细的分子分析，就不能排除卫星细胞的性能受到宿主肌肉特定特征的影响，而不是静止卫星细胞内在差异的结果。

确定导致肌肉退化的条件下卫星细胞的内在变化需要有效的方法从多种肌肉类型中分离卫星细胞。通常，卫星细胞通过酶消化从肌肉中释放出来(Yablonka-Reuveni，2004年). 我们之前用于表征新分离的卫星细胞中基因表达的方法依赖于Percoll密度离心法对细胞分离物进行亚分离，以从细胞制备中去除碎片和非肌源性细胞(Kastner等人，2000年). 流式细胞术基于排除表达某些表面抗原（如CD45、CD31和Sca1）的细胞，同时包括表达其他表面抗原的细胞，在提高假定卫星细胞纯度方面取得了一些成功(Sherwood等人，2004年). 然而，由于蛋白水解消化对细胞表面抗原的不同影响、用于检测表面抗原的抗体的不同质量以及卫星细胞和其他共分离细胞类型（即间质细胞）之间重叠的抗原表达，分类方法受到了限制。最近利用GFP表达对活细胞进行分类，从Pax3分离卫星细胞^GFP公司/+老鼠。然而，该模型的局限性在于其仅适用于卫星细胞表达报告基因的肌肉，如隔膜(Montaras等人，2005年).

在这里，我们提出了一种新的方法，基于巢蛋白（NES）基因调控元件驱动的GFP表达，对来自不同肌肉群的卫星细胞进行定位、分离和基因表达分析。巢蛋白是一种中间丝蛋白，最初被确定为神经祖细胞的标记物。然而，随后在多种祖细胞中检测到其表达(Michalczyk和Ziman，2005年;Wiese等人，2004年). 巢蛋白也通过卫星细胞的增殖和分化后代表达，但其在静止卫星细胞中的表达尚未见报道(Kachinsky等人，1994年;Shefer等人，2004年). 对常驻NES-GFP卫星细胞的分析表明，肢体和膈肌中表达的基因之间存在异质性，并为卫星细胞的分子特征提供了新的见解。此外，卫星细胞激活后NES-GFP表达的下降，以及不分裂后代对转基因表达的重新获得，揭示了静止卫星细胞的独特状态及其自我更新潜力。NES-GFP小鼠提供了第一个直接分离和表征不同肌群卫星细胞的模型，无论其胚胎来源或纤维类型组成如何。

材料和方法

结果

分离肌纤维中卫星细胞NES-GFP的表达

我们最近证明卫星细胞的子代表达巢蛋白(Shefer等人，2004年)并假设NES-GFP表达可以提供一种区分增殖成肌细胞与其静止祖细胞的方法。在年轻和成年NES-GFP小鼠EDL和比目鱼肌分离的肌纤维培养物中监测卫星细胞及其子代。出乎意料的是，位于肌纤维上的卫星细胞本身显示出强烈的GFP荧光。在调查NES-GFP/Myf5的肌纤维时^{nlacZ公司/+}小鼠，大多数GFP⁺卫星细胞β-gal阳性(图1A-A“和B-B”)或Pax7(图1C-C“和D-D”). 许多卫星细胞表现出不同外观的短膜延伸(图1A“–D”），尽管细胞核占据了细胞质的绝大多数。

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图1

NES-GFP/Myf5分离肌纤维卫星细胞内GFP的表达^{nlacZ公司/+}老鼠。相位对比显微照片与DAPI染色核（A–D）的图像合并。箭头指向基于GFP表达（A'-D'）和核β-半乳糖染色（A“-B”）或Pax7免疫染色（C“-D'）的单个卫星细胞。比例尺，30μm。

我们基于GFP和Pax7的表达量化了NES-GFP小鼠单个肌纤维内其生态位内的卫星细胞数量(图2A,表1). 无论年龄大小，绝大多数卫星细胞对GFP和Pax7均呈阳性。然而，与成年（4-10个月大）小鼠的肌纤维相比，幼年（1-2个月大）小鼠的肌纤维显示出更多的单标记细胞（仅GFP或Pax7）。如所示表1、双标记GFP的比例⁺/第7页⁺幼年和成年小鼠肌纤维中卫星细胞分别约占90%和98%。此外，根据我们之前的报告，结果显示，幼年小鼠每根肌纤维的卫星细胞平均数量高于成年小鼠，每根比目鱼肌纤维的星状细胞数量范围更广(Shefer等人，2006年). 成年NES-GFP/Myf5 EDL肌纤维中的卫星细胞^{nlacZ公司/+}小鼠表现出Pax7和GFP表达（94%）比β-gal和GFP（80%）更一致(图2B,表1). 同样，NES-GFP x Myf5的室友^{nlacZ公司/+}只携带Myf5的繁殖对^nlacZ公司等位基因显示β-gal和Pax7表达之间的一致性降低（数据未显示）。在这里使用的所有小鼠模型中，表达Pax7或GFP的卫星细胞数量始终大于表达β-gal的卫星细胞⁺/GFP公司⁻或β-gal⁺/第7页⁻记录了个细胞(图2B,表1). 即使在对四个成年Myf5的89根肌纤维进行的大规模分析中^{nlacZ公司/+}小鼠，只有一个β-半乳糖⁺/第7页⁻根据546 Pax7记录细胞⁺卫星细胞记录。综上所述，这些数据表明，NES-GFP表达为常驻卫星细胞提供了一个良好的标记，并表明幼年和成年肌肉卫星细胞中存在一些分子异质性。

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图2

从NES-GFP（A）和NES-GFP/Myf5分离的免疫标记比目鱼肌和EDL肌纤维中卫星细胞的定量^{nlacZ公司/+}（B） 老鼠。每个鼠标组的年龄显示在x轴下方。从同一只小鼠身上分离出B组左右两侧的纤维。每个条形图描述每个肌纤维的卫星细胞数量。在每个条形图中，灰色部分表示共表达Pax7和GFP（A和B）或GFP和β-gal（B）的卫星细胞数量。绿色和红色部分分别表示GFP、Pax7或βgal阳性的卫星细胞数量；β-加仑⁺只有细胞未被观察到，因此面板B中未显示黄色片段。

表1

不同小鼠品系肌纤维中卫星细胞的频率

	雀巢GFP			雀巢GFP x Myf5lacZ公司/+
年龄（月）	1–2		4–10	4–5
	索莱乌斯	老挝国家电力公司	老挝国家电力公司	老挝国家电力公司	老挝国家电力公司
老鼠	三	2	6	2	2
纤维	33	15	51	25	26
细胞	431	177	462	217	206
每根光纤的卫星蜂窝
中值的	12	12	9	8	7
平均	13.06	11.8	9.06	8.68	7.92
东南方	6.74	4.07	3.97	3.32	3.2
阳性细胞百分比
GFP和Pax7	90.02	88.7	97.62	94	---
GFP和β-半乳糖	---	---	---	---	80.58
仅GFP	3.25	7.91	1.95	0.46	19.42
仅Pax7	6.73	3.39	0.43	5.53
仅β-gal	---	---	---	---	0

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此表中所示的值基于图2.

新分离的肌纤维中的卫星细胞含有强烈的NES-GFP荧光，但在培养的第4天，即使肌纤维与抗GFP抗体反应，也不再检测到GFP。为了更具体地确定NES-GFP强度的下降是否与卫星细胞增殖相关，用BrdU对培养物进行18小时的脉冲处理，以确定在此初始时间段内进入S期的细胞(图3A-A“). 在肌纤维培养物中，大多数细胞在24-48小时内开始增殖(图3B-B“). 即使对于已经进入增殖期的细胞，GFP荧光强度在培养的第一天仍然很强(图3A-A“”). 然而，在培养2天后，GFP强度在增殖、MyoD中降低⁺留在纤维上的卫星细胞后代(图3B-B“')而那些发自肌纤维的(图3C-C“”). 培养4天后，未检测到GFP。原代成肌细胞培养也显示出同样的GFP荧光降低（数据未显示）。

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图3

EDL肌纤维培养中卫星细胞的子代在激活后迅速失去NES-GFP荧光，但在进入保留状态后恢复表达。相位对比显微照片与DAPI染色核（A）或BrdU合并核（B）的图像合并。在培养一天后（A-A“'），只有罕见的Pax7⁺卫星细胞（红色），掺入BrdU（蓝色）；这些罕见的增殖细胞像静止的（Pax7）一样保持着强烈的GFP荧光⁺/溴化铀⁻)卫星电池。GFP荧光在第二个培养日显著降低，如仍与亲本肌纤维（B-B“）相关或发自肌纤维（C-C”）的成肌细胞所示。这些细胞表达MyoD（红色）（B“，C”），即增殖卫星细胞及其子代的特征。比例尺，30μM（A-A'“），40μM（B-C”“）。

NES-GFP由多种肌肉中的卫星细胞表达

我们研究了肢体、头部和躯干肌肉的卫星细胞表达NES-GFP，以评估转基因是否在体内表达，而不管宿主肌肉类型如何。从青少年和成人NES-GFP/Myf5中取出TA、EDL、股四头肌、舌头、咬肌、眼外肌、膈肌和肋间肌进行组织学检查^{nlacZ公司/+}和NES-GFP小鼠。在所有检查的肌肉中，如EDL和舌头所示(图4A–C')，卫星细胞NES-GFP阳性。通过GFP荧光结合Myf5-lacZ的表达（用X-gal反应检测）和肌纤维基底膜下的位置（用层粘连蛋白免疫标记检测）鉴定卫星细胞。这些发现与我们在孤立肌纤维中的观察结果一致。如EDL肌肉、GFP所示⁺卫星细胞与一系列肌纤维大小相关(图4A-A“和B-B”)这一范围可能反映了不同的纤维类型。

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图4

卫星细胞在NES-GFP/Myf5 EDL肌横切面上强烈表达NES-GFP^{nlacZ公司/+}小鼠（A-A“'、B-B”'）或NES-GFP小鼠（C-C'）的舌肌。GFP公司⁺层粘连蛋白免疫标记（红色）和DAPI免疫标记（蓝色）显示位于肌纤维基底膜下的细胞（箭头）也呈β-gal阳性，X-gal染色（箭头）和相位对比（A“，B”）的合并图像显示。还显示了DAPI染色细胞核的平行合并图像和X-gal染色的相位图像（A“'，B”'）。面板A和B中的图像表明，NES-GFP卫星细胞与同一肌肉标尺的大直径和小直径肌纤维相关，5μm（A–B“'，C-C'），10μm（C-C“'）。

在消化过程中，我们还观察到粗肌块中的NES-GFP荧光，以释放单个肌纤维或单个细胞。GFP在整个肌肉中的结构中检测到表达，这些结构类似于密集的毛细血管网络，其中表达强烈的细胞体具有相互连接的过程(图5A和B，分别描绘了EDL和膈肌）。血管内皮细胞标记物CD31的肌肉横截面免疫标记(图5C-C“)与isolectin B4平行染色(图5D-D“)证实了表达GFP的细胞是内皮细胞，并证实了在与相邻肌纤维密切接触的毛细管网络中发现了GFP的表达。

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图5

骨骼肌微血管和卫星细胞（AD“）中NES-GFP的表达与微血管（E–I”）中Sca1-GFP的表示。GFP代表⁺胶原酶（EDL）（A、E、F）或蛋白酶（隔膜）（B）处理的部分消化肌肉中显示出毛细血管网络；高倍镜下，Sca1-GFP肌肉的毛细血管结构清晰可见。NES-GFP公司⁺TA肌肉的横截面上还显示了细胞（C-C“'和D-D”）；一个NES-GFP⁺卫星细胞（箭头）位于肌纤维基底层（由层粘连蛋白显示）（红色，从远红色转换而来）和DAPI染色的细胞核（蓝色）（C-C'）下方，而NES-GFP⁺毛细血管细胞（如箭头所示）位于肌纤维层外，与内皮细胞标记物CD31（红色）（C“-C”’）和异凝集素B4（红色）共同定位。EDL肌肉横截面显示Sca1-GFP⁺肌纤维间的细胞，但不在肌纤维基底膜下的卫星细胞位置（G-G'）。在代表性TA横截面（H–I“）中，所有Sca1-GFP⁺细胞共表达CD31（红色）（H'-H“）和isolectin B4（红色）。比例尺，100μm（A，E），10μm（C-C“’），25μm（B，D-D”，G-G'，H-H“，I-I”）。

先前的研究表明，干细胞抗原-1（Sca1）在肌肉和其他组织的毛细血管中表达，但在卫星细胞中不表达(Kotton等人，2003年;扎米特和波尚，2001年). 我们假设Sca1-GFP转基因小鼠可作为内皮细胞内GFP表达的阳性对照，以与NES-GFP肌肉毛细血管中观察到的表达水平进行比较。事实上，GFP网络⁺Sca1-GFP小鼠肌肉中也可见毛细血管。部分消化的肌肉(图5E–F)显示Sca1-GFP+微血管和标记CD31的切片(图5H-H“)和isolectin B4(图4I-I“)进一步证实内皮细胞特异性表达Sca1-GFP。与巢蛋白驱动的GFP相比，Sca1-driven GFP在微血管中的表达强度更高，能够精确检测内皮细胞结构，这与GFP密切相关⁺NES-GFP小鼠的毛细血管。无GFP⁺在Sca1-GFP肌肉切片的肌纤维层下观察到细胞(图5G和G')与NES-GFP小鼠卫星细胞表达GFP相反(图1,​,44和​和5）。5). 此外，在68个新分离的肌纤维（从2只成年Sca1-GFP小鼠的EDL肌肉中制备）中，没有一个肌纤维显示GFP⁺可以被分类为卫星小区的小区（数据未示出）。因此，在本研究中分析的肌肉的背景下，Sca1-GFP转基因表达由内皮细胞而不是卫星细胞显示。

分选的NES-GFP细胞产生肌源性细胞

接下来，我们询问NES-GFP表达是否可以用作FACS直接分离卫星细胞的手段。通过我们的酶消化标准方案，从NES-GFP小鼠的后肢肌肉池中释放细胞，然后剪切肌肉块以释放肌源性祖细胞。然后根据GFP强度和活的Hoechst染色对细胞进行分类，以区分GFP⁺和GFP⁻死细胞和碎片中的细胞(图6A和A'). 从野生型肌肉中分离的细胞作为阴性对照(图6B和B'). 根据Hoechst和GFP门控，只有GFP的边际人群⁺细胞呈G型₂(图6A'和B'，闸门R4）。

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图6

散点图描述了从NES-GFP后肢肌肉分离的细胞的荧光激活细胞分类。根据红色自体荧光绘制的GFP荧光图描绘了最强烈的GFP阳性事件（R1）和阴性事件（R2）（A和B）的门控。NES-GFP后肢的分类产生了总数（A）中4%的GFP事件，而野生型后肢没有产生GFP荧光（B），如R1门所示。如R2门所示，NES-GFP和野生型肌肉的阴性事件数量相似（29-32%）。根据GFP绘制的Hoechst 33342描绘了NES-GFP分类的双重Hoechst-GFP标记细胞，而R4门（A'和B'）所示的野生型对照中未检测到GFP荧光。

为了确定NES-GFP阳性和阴性细胞的潜能，将分选好的细胞接种在有利于成肌细胞、内皮细胞和神经元生长的培养基中。我们推断，表达GFP的一些非肌源性细胞类型（如组织学所示的内皮细胞）可能与GFP衍生的成肌细胞共同分离并生长⁺卫星电池。此外，以前的研究表明GFP的存在⁺NES-GFP小鼠的神经祖细胞，尽管这些是从大脑中分离出来的，尚未在肌肉中鉴定(Mignone等人，2004年). 无论培养基类型如何，培养物均来自GFP⁺如Pax7和MyoD表达所示，细胞产生了高度富集的肌原性培养物，并在培养7天后融合到肌管中(图7A–C'). 相比之下，绝大多数GFP⁻在不同的培养基中，细胞没有贡献成肌细胞，这表现在缺乏肌管(图7D–F)Pax7和MyoD的免疫染色（数据未显示）。有趣的是，GFP⁺接种到神经生长培养基中的细胞迅速融合到肌管中，在培养第7天时，单个肌源性细胞很少(图7C和C'). 总体而言，培养的GFP⁺细胞完全进入肌发生，而不考虑补充的培养基。

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图7

NES-GFP公司⁺后肢肌肉的细胞致力于肌生成。GFP公司⁺和GFP⁻将分选的细胞平行接种到肌源性（A、A'和D）、内皮性（B、B'和E）和神经性（C、C'和F）培养基中，并生长1周。GFP的培养⁺无论介质类型（A-C）如何，细胞产生多核肌管，而GFP⁻如DAPI和相位对比叠加（D-F）所示，细胞培养具有非肌源性表型。Pax7（绿色）和MyoD（红色）（A'-C'，合并免疫荧光图像）的双重免疫染色进一步证明了GFP的一致肌源性⁺子代细胞。比例尺，50μm。

四肢和膈肌分选NES-GFP细胞的基因表达

表征分选GFP中的基因表达⁺卫星细胞，我们从后肢肌肉收集阳性和阴性细胞，用于总RNA的制备。由于我们观察到Sca1-GFP转基因在内皮细胞中的强烈表达，我们推断分类的Sca1-GFP细胞可以作为对照，通过我们的原代肌细胞制备方案来确定内皮细胞恢复的效率。尽管Sca1-GFP肌肉毛细血管中的GFP表达高于NES-GFP肌肉（参见图5F与5B相比），回收Sca1-GFP的比例⁺成年后肢肌肉的细胞数略低于NES-GFP⁺使用相同选通参数时的单元格(图8A). 这些分类的Sca1-GFP⁺细胞被用作CD31基因表达的阳性对照(图8B).

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图8

基于NES-GFP表达的从后肢和膈肌分选的卫星细胞中基因表达的RT-PCR分析。Sca1-GFP后肢肌肉作为CD31基因表达的对照，产生2.16%的GFP事件（A）。NES-GFP后肢和膈肌的分类产生了类似的GFP事件(图6). 使用GFP阳性（+）和阴性（−）分选细胞制备的cDNA进行反应，每个反应包括阳性对照（con）。从NES-GFP和Sca1-GFP小鼠（B和D）或NES-GFP膈肌（C）的后肢肌肉中制备细胞。除Myf5、MyoD、GFP和c-met反应外，每个对照反应均使用大脑总RNA，这些反应使用从生长5天的原代成肌培养物中分离的总RNA。

如RT-PCR分析所示，NES-GFP⁺从后肢肌肉分离的细胞特异性表达Pax3、Pax7和Myf5，而结蛋白和c-met（HGF受体）在GFP阳性和阴性人群中都表达，尽管在GFP中表达水平较高⁺分数(图8B). NES-GFP中也检测到非常微弱的MyoD表达⁺细胞（在放大周期中未看到图8B)符合罕见的MyoD⁺新分离的肌纤维上的细胞（即活化的卫星细胞）（数据未显示）。NES-GFP型⁺从隔膜中分选的细胞(图8C)与Pax7和Myf5相比，Pax3表达更高，与GFP中观察到的表达水平相似⁺后肢肌肉细胞。GFP中Pax7的低水平表达⁻来自NES-GFP肌肉的细胞与我们鉴定的一些Pax7一致⁺/GFP公司⁻单个肌纤维中的卫星细胞(图2).

在Sca1-GFP分类中，Pax3、Pax7和Myf5转录物仅在GFP中表达⁻单元格(图8B). 这进一步证明卫星细胞不表达Sca1-GFP。此外，在Sca1-GFP分类中，CD31表达严格定位于GFP⁺单元格(图8B). 组织学检查结合Sca1-GFP在内皮细胞中的表达(图5)CD31表达表明一些内皮细胞从我们的分离方案中存活下来。值得注意的是，GFP⁺和GFP⁻来自NES-GFP肌肉的分选细胞表达类似水平的CD31，但该水平远低于Sca1-GFP细胞中观察到的CD31表达(图8B). 因此，NES-GFP中存在一些CD31表达细胞（推测为内皮细胞）⁺细胞分数，但其贡献远低于Sca1-GFP⁺细胞数量。总的来说，我们的分析表明，分类的NES-GFP⁺卫星细胞丰富了人群，而Sca1-GFP⁺人口不是。

先前的报告表明，NES-GFP结构中存在的大鼠巢蛋白基因的第二内含子包含一个神经增强子元件，该元件负责驱动神经祖细胞中巢蛋白的表达(Johansson等人，2002年;Tanaka等人，2004年;Zimmerman等人，1994年). 然而，我们对单个纤维和肌肉组织的分析表明，先前未报告的NES-GFP在卫星细胞中的表达。RT-PCR显示内源性巢蛋白在NES-GFP阳性和阴性细胞中均表达(图8B和D). 根据分选细胞的预测，转基因在GFP中强烈表达⁺GFP中基本mRNA表达水平的人群⁻人口(图8D). 我们推断，先前显示的通过与nestin基因第二内含子增强子区域结合来促进nestin表达的转录因子可能是引导nestin转基因在卫星细胞中表达的原因。具体而言，分析GFP阳性和阴性分选细胞中POU域转录因子Brn2和sry-HMG盒相关基因Sox2的水平。在NES-GFP中检测到Brn2⁻但不在NES-GFP中⁺细胞，而Sox2在两个群体中的表达均低于检测水平(图8D). 我们还分析了据报道在卫星细胞中表达的Sox基因8和9(Schmidt等人，2003年). Sox8和Sox9在NES-GFP阳性和阴性分选细胞中均表达，表明这两种转录因子并非卫星细胞独有(图8D).

NES-GFP在长期肌纤维培养中再次表达

如所示图3在肌纤维培养的卫星细胞增殖子代中，NES-GFP荧光减弱。肌纤维培养物通常在10–14天后形成精心构建的肌管网络，但也含有残余的单核Pax7⁺/MyoD公司⁻单元格(Shefer等人，2006年). 鉴于我们的假设，不扩散的Pax7⁺/MyoD公司⁻细胞代表更新的祖细胞群体，我们询问他们是否也可能在长期肌纤维培养和肌源性克隆中重新获得NES-GFP表达。

在培养3周后，我们观察到GFP的表达再次出现。细胞在2周时几乎无法区分，但随着GFP荧光强度增强，细胞变得更加明显，并且在培养中数量增加了3-4周(图9). GFP公司⁺细胞均匀地显示出细长的胞体，两端都有薄的延伸部分，并含有可与肌管内相对圆的细胞核清晰区分的长圆形细胞核。此类GFP⁺细胞位于发育良好、致密的肌管区域，它们占据肌管之间的空间(图9). 只有长得很大、肌管密度高的克隆才能产生GFP⁺细胞。

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图9

NES-GFP在长期肌源性培养中恢复表达。肌原性克隆（A–D“）和肌纤维培养物（E–F”）分别生长至3周和4周。所有检测抗原均显示GFP荧光（绿色）和免疫染色（红色）的合并图像，以及平行合并相和DAPI染色图像；显示细胞质蛋白的未融合免疫染色图像，以区分GFP荧光（D、E和F）的免疫标记。所有GFP⁺Pax7（A）阳性细胞，MyoD阴性细胞，但仅表达低水平GFP的细胞中很少有MyoD表达（B，箭头）。GFP公司⁺细胞不表达肌生成素（C）或肌萎缩性肌球蛋白（D和D’）。GFP公司⁺与GFP（E和E’）相比，细胞表现出nestin的极化定位，结蛋白与GFP的分布均匀（F和F’）。平行面板中的箭头指向GFP中发现的典型椭圆形核⁺细胞。比例尺，50μm（A–D“），25μm（E–F”）。

GFP公司⁺细胞范围从克隆中的少数细胞到肌纤维培养中的20-50个，并表达Pax7(图9A和A'). 这些Pax7⁺/GFP公司⁺根据18小时脉冲的BrdU标记，细胞没有增殖（数据未显示；少于0.5%的细胞为BrdU⁺在21天的培养基中，没有GFP⁺掺入BrdU的细胞）。这些细胞通常不表达MyoD(图9B和B')，但在某些情况下，在微弱的GFP中检测到低水平⁺单元格(图9B，箭头）。此外，GFP⁺细胞不表达分化标记物肌生成素(图9C-C')或肌凝肌球蛋白(图9D-D“). Myf5分离肌纤维和克隆的培养^{nlacZ公司/+}小鼠在这些椭圆形细胞核内也有β-gal的表达（数据未显示）。这些NES-GFP⁺细胞表达中间丝蛋白nestin和desmin。巢蛋白的免疫染色显示它通常集中在细胞核的一侧(图9E-E')而结蛋白则更均匀地分布在整个细胞中(图9F-F').

讨论

在这里，我们研究了静止卫星细胞及其自我更新群体，我们能够在基于NES-GFP表达的活的肌源性培养物中识别这些细胞。此外，卫星细胞分离和培养后的基因表达分析为静止卫星细胞的转录活性和分子异质性提供了新的见解。

卫星细胞的肌内异质性

对NES-GFP小鼠分离肌纤维中的卫星细胞进行Pax7表达分析表明，卫星细胞之间存在一些肌内变异。大多数卫星细胞同时表达GFP和Pax7，而一些仅表达Pax7或GFP。这些单标记卫星细胞在幼年肌纤维中的数量较高，因此，Pax7和NES-GFP的共表达可能反映卫星细胞的成熟。

本研究揭示了静止卫星细胞表达Myf5的情况。首先，RT-PCR分析显示在分类的GFP中Pax7的表达相对较低，而Myf5没有表达⁻人口，表明存在一些Pax7⁺/我的5⁻GFP中的细胞⁻分数。这个Pax7⁺/我的5⁻/GFP公司⁻所有β-gal阳性的卫星细胞也是GFP，这一观察证实了亚群的存在⁺NES-GFP/Myf5中^{nlacZ公司/+}肌纤维。其次，免疫标记分析表明，15-20%的GFP⁺卫星细胞为β-gal⁻NES-GFP/Myf5的肌纤维^{nlacZ公司/+}老鼠。这表明Myf5占主导地位⁺人口和未成年人Myf5⁻GFP内的人口⁺卫星电池。最后，当分析Myf5肌纤维中的卫星细胞时^{nlacZ公司/+}小鼠品系，仅1 Pax7⁻/β-加仑⁺与546 Pax7相比检测到细胞⁺记录细胞；在这些Pax7+细胞中，6%是β-半乳糖⁻根据这一观察，基本上所有β-半乳糖⁺细胞为Pax7⁺在Myf5中^{nlacZ公司/+}小鼠，我们推断所有β-gal⁺/GFP公司⁺NES-GFP/Myf5中观察到的细胞^{nlacZ公司/+}肌纤维也表达Pax7。

总的来说，这项研究验证了一个显性群体的存在，该群体表达所检查的所有三个基因（即Pax7⁺/我的5⁺/GFP公司⁺细胞）和表达Pax7但不表达Myf5的少数群体，并且GFP表达不是所有细胞（即Pax7）的统一属性⁺/我的5⁻/GFP公司^±). 可以想象，这种表型范围代表了卫星细胞的动态状态，即使在可能处于静止状态的种群中也是如此。Myf5中的卫星细胞^{nlacz公司/+}由于β-半乳糖、M-钙粘蛋白和CD34的共表达，肌纤维也表现出一些变化(Beauchamp等人，2000年). 卫星细胞之间的肌内异质性可能反映了提示更新或分化的不同腔室。为了研究这一假设，我们目前正在开发分离Myf5的方法⁺和Myf5⁻人群（基于β-gal表达），以研究Myf5在卫星细胞更新中的可能作用。

肌群间卫星细胞分子特征和异质性

本研究中描述的细胞分离和分选方法导致卫星细胞富集，如GFP中卫星细胞识别标记的高表达水平所示⁺与GFP相比⁻人口。此外，对NES-GFP进行了排序⁺当细胞在支持非肌源性细胞类型生长的不同细胞培养基中培养时，只能产生肌源性的细胞。基于进一步的免疫组织学特征和CD31表达的RT-PCR，我们得出结论，肌肉血管内的一些内皮细胞也表达NES-GFP转基因。这与利用同一转基因小鼠创建者的其他研究一致(Amoh等人，2005年). 然而，存活内皮细胞对分类的NES-GFP的贡献⁺NES-GFP中CD31的表达水平低得多，表明该种群处于边缘状态⁺与Sca1-GFP相比⁺细胞。此外，我们发现CD31仅在Sca1-GFP中表达⁺在NES-GFP中表达⁺和NES-GFP⁻结果表明，与Sca1-GFP相比，表达NES-GFP的内皮细胞更少。Sca1-GFP⁺根据我们观察到毛细血管中Sca1-GFP荧光较强，而卫星细胞中没有表达，细胞是分离内皮细胞的良好对照。

尽管CD31在新分离的NES-GFP+细胞中有一些表达，但NES-GFP+细胞培养物中内皮细胞生长缺失可能是因为分选的内皮细胞无法按照我们的分离方案存活。Sca1-GFP培养物的初步研究⁺分选的细胞显示出一些非肌源性细胞生长，可能是内皮细胞的后代。因此，预计NES-GFP中至少应检测到一些非肌源性细胞⁺如果在分类的NES-GFP中检测到CD31信号，则为培养基⁺细胞反映了内皮细胞的贡献。然而，也可以想象CD31在排序的NES-GFP中的表达⁺人种反映了成肌细胞自身内的表达，如最近在人类胎儿成肌细胞中所示(Cerletti等人，2006年). 早期的研究还确定了卫星细胞表达的其他内皮细胞标记物(De Angelis等人，1999年;Beauchamp等人，2000年;扎米特和波尚，2001年).

虽然人们普遍认为卫星细胞不表达Sca1，但一些研究已经鉴定出罕见的Sca1表达细胞可以进入肌发生(Gussoni等人，1999年;Mitchell等人，2005年;Qu-Petersen等人，2002年;Tamaki等人，2002年). 根据这些报道，我们在分选的Sca1-GFP中观察到Myf5的表达水平非常低⁺PCR扩增周期较高的细胞（即35-40）。此外，同意Mitchell等人（2005），我们注意到分离的肌纤维培养物产生的一些增殖的成肌细胞中Sca1-GFP表达增强；然而，静止的卫星细胞总是Sca1-GFP阴性。

Pax7在NES-GFP中以可比水平表达⁺后肢和膈肌的细胞群，而膈肌细胞中的Pax3表达水平更高。在NES-GFP分类的后肢细胞中观察到的Pax3低表达可能代表表达该基因的卫星细胞亚群，而在膈膜中Pax3表达的卫星细胞最为普遍。这些专注于内源性Pax3基因表达的数据与研究一致，研究表明Pax3驱动的lacZ或GFP表达细胞在膈肌中丰富，而在后肢肌肉中不丰富(Montaras等人，2005年;Relaix等人，2006年).

Pax3表达增加在卫星细胞中的意义尚不清楚。通过移植到宿主肌肉中，后肢和膈肌的卫星细胞的增殖或分化潜能没有差异(Montaras等人，2005年)或通过免疫荧光分析在原代细胞培养中分化和融合成肌管(Yablonka-Reuveni等人，1999年). 不同的卫星细胞来源，如不同的肌细胞亚结构域、常驻肌肉内的各种诱导事件或环境信号、增殖史和招募率，都可能是导致Pax3表达差异的因素。一些卫星细胞群体的Pax3表达水平较高也可能反映出维持基本功能所需的特殊肌肉群的进化出现（即支持肺部呼吸所需的隔膜）。Pax3可能在启动卫星细胞以持续修复这些经常使用的肌肉方面发挥作用。

自从Myf5卫星细胞中β-gal的表达以来，有丝分裂不活跃祖细胞对Myf5的表达一直存在争议^{nlacZ公司/+}小鼠不符合Myf5仅在卫星细胞激活时表达的报告(科内利森和沃尔德，1997年). 我们在这里证明，分离自后肢和膈肌的静止卫星细胞表达Myf5。MyoD在NES-GFP中的最低表达⁺分类后的细胞证实，这些细胞中Myf5的表达不能仅仅归因于活化的卫星细胞。卫星细胞的Myf5基因表达与Myf5的β-gal表达非常一致^{nlacZ公司/+}老鼠。与增殖细胞相比，静止的卫星细胞可能表达较低水平的Myf5，因此以前用于静止卫星细胞基因表达分析的方法不够敏感，无法识别低丰度的信息(科内利森和沃尔德，1997年).

结蛋白在NES-GFP中的高水平表达⁺与Pax7和Myf5平行的细胞表明，静止的卫星细胞表达结蛋白。早期研究表明，结蛋白在所分析的所有物种的肌原分化和一些物种的增殖成肌细胞中表达(考夫曼和福斯特，1988年;Yablonka Reuveni和Nameroff，1990年;Yablonka-Reuveni等人，1999年). 然而，结蛋白在静止卫星细胞中的表达先前尚未报道。分化状态下结蛋白的表达受MyoD调节(Paulin和Li，2004年). 然而，鉴于MyoD在分类的NES-GFP中的表达可以忽略不计，静止卫星细胞中结蛋白的表达不能归因于MyoD⁺上文讨论的细胞。Desmin表达在分类的NES-GFP中也很明显⁻人口，尽管低于NES-GFP⁺细胞。NES-GFP中最有可能出现这种表达⁻这些细胞是由血管平滑肌细胞贡献的，这些细胞通常在酶消化过程中从骨骼肌中释放出来，也表达结蛋白(Costa等人，2004年;Yablonka-Reuveni等人，1998年).

分选NES-GFP中desmin和nestin的表达⁺如RT-PCR和重新合并GFP所示⁺通过免疫染色长期培养的细胞表明，这些中间丝在静止的卫星细胞中起作用。缺乏层粘连蛋白A/C的小鼠成肌细胞结蛋白表达降低(Frock等人，2006年)以及我们观察到NES-GFP中nestin在细胞核一侧的“极化”表达⁺细胞可能暗示中间丝和核结构之间可能的相互作用(班维尔，2001). 以前关于其他细胞类型的报告也显示巢蛋白原的定位不均匀(Michalczyk和Ziman，2005年;Sjoberg等人，1994年; Wroblewski等人，1997年）。有趣的是，与肌管内的细胞核相比，更新的卫星细胞具有独特的细胞核形态。我们目前正在寻求可能导致这种形态的潜在结构要求，即NES-GFP⁺细胞离开并重新进入静止状态。

我们还证明了c-met（HGF受体）在卫星细胞（GFP）中的表达⁺人口）如预期(Charge和Rudnicki，2004年). 然而，与Pax7相比，c-met在非肌源性GFP中的表达水平相当⁻人口。这证实了我们之前对啮齿动物卫星细胞的研究结果，这些细胞通过Percoll密度离心分离得到，其中肌源性和非肌源性细胞部分都表达c-met(Kastner等人，2000年). 因此，虽然c-met表达标记了孤立肌纤维上下文中的卫星细胞，但不能将其视为整个肌肉上下文中的特定卫星细胞标记。此外，我们无法证实之前报道的卫星细胞中Sox8和Sox9的限制表达(Schmidt等人，2003年)因为这两个转录因子在NES-GFP阳性和阴性人群中的表达水平相似。

NES-GFP表达式定义卫星单元的静态

巢蛋白基因在第一和第二内含子中含有增强子元件，这些增强子元件被证明可以驱动肌肉、内皮和神经元谱系的选择性表达(Aihara等人，2004年;Mignone等人，2004年;Zimmerman等人，1994年). 然而，在卫星细胞中观察到的强烈NES-GFP荧光是意料之外的。首先，虽然卫星细胞的后代显示表达nestin，但在常驻卫星细胞中这种表达并不明显(Kachinsky等人，1994年;Shefer等人，2004年;Sjoberg等人，1994年;Vaittinen等人，2001年). 其次，在本研究中使用的小鼠系中，驱动NES-GFP转基因的调控元件以前被证明是神经特异性的，尤其在脑室下区和齿状回中有强烈表达(Mignone等人，2004年).

POU域转录因子Brn2的特异和保守结合序列位于nestin神经增强子中其潜在伴侣转录因子Sox2附近(Johansson等人，2002年;Tanaka等人，2004年). 因此，我们假设这些可能参与卫星细胞中NES-GFP的表达。然而，我们的RT-PCR结果不支持Brn2和Sox2在卫星细胞调节NES-GFP表达中的作用，因为这些转录因子的表达水平低于检测水平。似乎也可以合理地假设，在卫星细胞中相对高水平表达的Sox8和Sox9可能有助于NES-GFP的表达。然而，由于Sox8和Sox9也在NES-GFP中表达⁻细胞，可能需要额外的（或完全不同的）因子来增强NES-GFP转基因在卫星细胞中的表达。这些因子可能由多种其他表达NES-GFP的成年祖细胞共同表达(Amoh等人，2005年;大卫杜夫等人，2004年;Gleiberman等人，2005年;Li等人，2003年).

如图所示，来自卫星细胞的培养物中NES-GFP荧光消失。与成肌细胞和肌管中持续内源性巢蛋白表达相比，NES-GFP表达的下降表明，NES-GWP转基因的调控作用与内源性巢基因启动子不同。有趣的是，在一些Pax7中再次出现了强烈的GFP表达⁺培养3周后的单核细胞。这些GFP⁺细胞不增殖，MyoD阴性，不表达肌源性分化标记。相同的GFP⁺/第7页⁺在分选的NES-GFP高密度原代培养物中培养10–14天时也检测到细胞⁺细胞，与含有发育良好的肌管的致密肌纤维培养物非常相似（数据未显示）。GFP表达与MyoD的不相容性可能表明MyoD表达的激活剂也能降低NES-GFP转基因的转录。或者，MyoD可以通过与转基因中可能存在的公认位点结合，直接抑制NES-GFP的表达。总共，Pax7⁺/MyoD公司⁻重新获得静止卫星细胞表型的细胞也重新获得表达NES-GFP转基因的正确转录机制。

关于如何更新卫星小区池，一直存在很多争论。一些研究表明，循环和间质肌细胞（即非卫星细胞来源）可能有助于卫星细胞的补充(Zammit等人，2006年). 然而，将供体肌肉中的单个肌纤维移植到受损的宿主肌肉中，明确证明卫星细胞能够促进肌纤维修复和自我更新(Collins等人，2005年). 然而，控制卫星细胞自我更新的机制仍然未知。我们认为培养中检测到的NES-GFP表达水平的恢复表明卫星细胞自我更新的“成熟”过程。我们只观察到这种GFP⁺肌纤维细胞和含有致密肌管的克隆培养物。因此，肌管产生的环境似乎为NES-GFP的更新提供了条件⁺细胞。这可能反映了体内生长和再生肌纤维引导成肌细胞进入卫星细胞室的过程。根据这个模型，生态位可能会引导一些成肌细胞成为新的卫星细胞。静止的卫星细胞，甚至在进入增殖之前，可能已经被指定为更新、分化或两者兼而有之。肌肉内和肌肉间卫星细胞之间的分子异质性可能反映了这种特定过程。与强健肌管形成和GFP平行出现相关的克隆变异⁺细胞表明，并非所有的单个卫星细胞都能参与更新过程。我们的假设是，肌管产生的环境将成肌细胞导向卫星细胞更新，但这并不排除细胞内机制的作用，例如增殖率差异（Schultz，1996）或不对称细胞分裂（Shinin等人，2006），在调节卫星细胞更新方面的作用。

我们目前正在开发分离获得NES-GFP的细胞的方法，以进一步研究其功能。这是一项具有挑战性的任务，因为长期培养产生的NES-GFP细胞数量相对较少。NES-GFP的表达可以实时成像单个细胞的卫星细胞更新途径，并可以研究该过程是如何由内在和外在因素控制的。通过研究NES-GFP小鼠生长期、成年期和衰老期肌肉中的肌源性克隆，我们可以确定可产生NES-GFP细胞的卫星细胞比例是否受年龄的影响。更新潜力的这种下降可能会导致随年龄增长卫星细胞数量的减少(Shefer等人，2006年). 总的来说，解开NES-GFP表达的分子基础将有助于更好地理解静止卫星细胞中活跃的独特转录网络。

致谢

脚注

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