《美国病理学杂志》。2000年9月；157（3）：709–715。
霍奇金病Reed-Sternberg细胞中BMI-1和EZH2多梳群基因的共表达
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Frank M.Raaphorst先生
阿姆斯特丹VU大学医院；以及EC斯莱特研究所，†
Folkert J.van Kemenade先生
阿姆斯特丹VU大学医院；和欧共体斯莱特研究所，†
Tjasso Blokzijl公司
阿姆斯特丹VU大学医院；和欧共体斯莱特研究所，†
伊利·费雷特
阿姆斯特丹VU大学医院；和欧共体斯莱特研究所，†
克里斯·J·L·M·梅杰
阿姆斯特丹VU大学医院；和欧共体斯莱特研究所，†
病理科的，*
阿姆斯特丹VU大学医院；和欧共体斯莱特研究所，†
荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学
摘要
人类BMI-1和EZH2多梳群（PcG）蛋白是两种不同的PcG蛋白复合物的组成部分，具有基因调节活性。PcG蛋白通过抑制同源异型盒基因确保正确的胚胎发育，也有助于调节淋巴生成。这两种PcG复合物被认为调节不同的靶基因，并且可能具有不同的组织分布。PcG基因表达的改变与突变小鼠的细胞系转化和肿瘤诱导有关，但PcG在人类癌症中的作用尚不清楚。利用人PcG蛋白特异性抗血清，采用免疫组织化学和免疫荧光技术检测霍奇金病（HRS）Reed-Sternberg细胞中BMI-1和EZH2-PcG蛋白。将表达模式与淋巴结滤泡淋巴细胞（HRS细胞的正常对应物）中的表达模式进行比较。在生发中心，BMI-1的表达仅限于静止的Mib-1/Ki-67−中心体细胞，而EZH2的表达与Mib-1/Ki-67的分裂有关+成中心细胞。相反，HRS细胞共存BMI-1、EZH2和Mib-1/Ki-67。由于HRS细胞被认为来源于生发中心淋巴细胞，这些观察结果表明霍奇金病与HRS细胞中BMI-1和EZH2的共表达有关。
霍奇金病（HD）的特征是孤立的霍奇金和里德-斯特恩伯格（HRS）肿瘤细胞，周围是由T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞组成的非肿瘤浸润。1最近有两种证据表明，经典HRS细胞是生发中心（GC）B细胞的后代。除了其他B细胞特异性基因外，2HRS细胞经常表达B细胞特异性激活蛋白（BSAP）三和BCL-6，GC B细胞的标记物。4此外，HRS细胞包含完整的Ig H链重排。5至7这些基因通常表现出广泛的体细胞突变，这是B淋巴细胞在次级淋巴组织中进行抗原选择的特征。5,7由于Ig H链基因中存在终止密码子和破坏性突变，HRS细胞失去了表达B细胞受体的能力。8具有这种突变的B细胞通常在GC反应过程中被清除，但HRS细胞逃脱了这种命运。7,9,10
HRS细胞形成的机制尚不清楚。癌基因的表达，如c-myc公司，c-raf公司，c-fos公司、和N-ras型与周围的非肿瘤细胞相比，HRS细胞似乎没有改变。11月13日肿瘤坏死因子受体（TNF-R）家族成员的异常表达，14,15凋亡途径异常，15-17Epstein-Barr病毒的存在，18p53的核蓄积，19或CD99下调20可能都与HD的发病机制有关。
多梳（PcG）基因21,22编码一类新的基因调节蛋白，在调节淋巴细胞发育中起关键作用。23-29PcG蛋白的靶点包括同源盒基因30,31以及有助于调节细胞周期的基因，例如第16页/墨水4a和p19/急性呼吸衰竭。32PcG蛋白作为大型多元蛋白复合物发挥作用。33至37在人类中发现了两种不同的复合物。31一种由BMI-1、RING1、HPH1、HPH2和HPC2 PcG蛋白质组成，另一种包含ENX/EZH2和EED PcG蛋白。34-39我们最近证明，通过检测BMI-1、RING1、EZH2和EED，这些复合物的表达在扁桃体的GC B细胞中是相互排斥的，并且依赖于B细胞分化阶段。29
除了在正常淋巴细胞发育中发挥作用外，PcG基因表达的改变与肿瘤发生之间也有明确的联系。各种PcG基因的过度表达，如HPC2、RING1和BMI-1，导致突变小鼠细胞系的细胞转化或淋巴瘤的诱导。36,40-42然而，PcG基因在人类癌症中的作用还相对未知。在目前的研究中，我们分析了HRS细胞及其正常对应物淋巴结滤泡B细胞中PcG的表达。我们研究了作为两种人类PcG复合物代表的BMI-1和EZH2-PcG蛋白，并检查了BMI-1与EZH2在HRS细胞中的表达是否发生改变。我们发现，大多数HRS细胞在细胞核中共存BMI-1和EZH2，而这些蛋白在正常卵泡B细胞中的表达明显分离。这表明HD与HRS细胞中BMI-1和EZH2的共表达有关。
材料和方法
人体组织
手术后获得的正常淋巴结或HD患者的淋巴结立即冷冻或固定在10%的福尔马林缓冲液中，并包埋在石蜡中。HD病例被归类为结节性硬化（NS、，n个=13），混合细胞数（MC，n个=1），并且，当无法确定子类型时，未另行指定（NOS，n个= 2). 在诊断时从患者身上获取淋巴结组织（在常规诊断检查程序中使用福尔马林固定石蜡包埋材料）。一例复发病例为NS亚型。
人PcG基因表达的免疫组织化学检测
使用6C9小鼠单克隆抗体（抗BMI-1）和多克隆K358兔抗血清（抗EZH2）测量BMI-1和EZH2-PcG蛋白的表达。37脱蜡后，组织切片在室温下0.3%H培养30分钟，内源性过氧化物酶被抑制2O（运行）2在甲醇中稀释。通过在柠檬酸盐缓冲液（pH 6）中煮沸10分钟，然后在含有0.5%Triton的磷酸盐缓冲液（PBS）中连续冲洗（1×5分钟）和仅在PBS中冲洗（3×5分钟。然后将载玻片在0.1 mol/L甘氨酸中培养10分钟（在PBS中稀释），并仅在PBS内冲洗（3×5分钟）。在应用初级抗血清或抗体之前，将切片置于PBS+1%牛血清白蛋白（BSA）中1:10稀释的正常猪血清或PBS+1%BSA中1:50稀释的正常兔血清中孵育10分钟。次级抗血清为生物素化羊抗鼠或生物素化猪抗兔。采用链霉亲和素-生物素复合物/辣根过氧化物酶（sABC-HRP）法和酪胺强化法，用3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）进行免疫染色。切片用苏木精复染。照片是用蔡司Axiophoto显微镜（纽约州桑伍德）拍摄的，并使用Agfa双扫描扫描仪（比利时莫特尔）进行数字化。
结合CD30和Mib-1/Ki-67的免疫荧光检测BMI-1和EZH2的表达
组织切片固定在2%甲醛中，内源性过氧化物酶如上所述受到抑制。在用5%BSA预孵育后，在4°C下使用三种主要抗体的组合过夜：抗BMI-1（6C9；小鼠IgG2b单克隆抗体37)，抗EZH2（K358；兔多克隆抗血清37)、抗Ki67（Mib-1；小鼠IgG1单克隆抗体；Beckman Coulter，Fullerton，CA）或抗CD30（BerH2；小鼠IgG1单抗；Dako，Glostrup，丹麦）。选择Mib-1/Ki-67是因为该核增殖抗原的表达43被证明仅限于BMI-1−/EZH2型+扁桃体GC中的细胞。29我们包括CD30，因为它是由HRS细胞特异表达的44,45活化的T细胞、单核细胞和粒细胞（根据形态学很容易与HRS细胞区分）。
对于双重免疫荧光，BMI-1或Ki-67由生物素化山羊抗鼠抗血清检测，然后由链霉亲和素cy3检测（Jackson Immunoresearch，West Grove，PA）。用猪抗兔Ig-FITC（Dako）检测EZH2。对于三重免疫荧光，在如上所述阻断非特异性结合后，将载玻片与三种抗体孵育。冲洗后，将载玻片与羊抗鼠IgG2b或IgG1孵育，在5%正常人血清或正常山羊血清中与辣根过氧化物酶（取决于一级抗体的亚类）相连。随后添加共轭羟基古拉明（1:1000；分子探针，尤金，OR）和酪胺，46产生蓝色荧光。对于绿色荧光信号，用异硫氰酸荧光素结合猪抗兔抗体（1:50）检测EZH2。对于红色荧光信号，使用亚类特异性TRITC结合的山羊抗鼠IgG检测BMI-1或Ki-67。所有试剂在标准条件下培养至少30分钟。冲洗后，用Prolong（分子探针）覆盖载玻片。使用DMR显微镜进行分析和摄影（瑞士圣加仑莱卡）；使用Agfa双扫描扫描仪对图像进行数字化。
结果
我们用免疫组织化学方法分析了19例HD患者HRS细胞（11例NS、1例MC、2例NOS和1例复发NS标本）中BMI-1和EZH2-PcG蛋白的表达。因为HRS细胞被视为滤泡B细胞的肿瘤变体，9,10将HRS细胞中建立的PcG基因表达模式与增生淋巴结中滤泡B细胞的表达模式进行比较。我们发现大多数HRS细胞表现出BMI-1的核染色（图1A）和EZH2（图1B）在所有15个HD样品中都观察到了这种表达模式（表1）提示BMI-1和EZH2在HRS细胞的同一细胞核中表达。相比之下，周围浸润细胞表达BMI-1的可变染色，EZH2很少表达（图1、A和B）。
淋巴结HRS细胞和生发中心滤泡淋巴细胞BMI-1和EZH2表达的免疫组织化学分析。A类和B类：Reed-Sternberg（HRS）细胞BMI-1染色(A类)和EZH2(B类). HRS细胞同时表达BMI-1和EZH2，而浸润淋巴细胞对BMI-1染色，但对EZH2.不染色。注意，分裂细胞在细胞质中表达BMI-1，而EZH2仍与浓缩染色体相关（用*表示A类和B类).C类，E类、和德国：淋巴结生发中心BMI-1的表达。D类，F类、和高：EZH2在淋巴结生发中心的表达。C类和医生：淋巴结生发中心概述。E类和传真：生发中心详图，显示暗区（DZ）和地幔区（MZ）。G公司和高：生发中心详图，显示光区（LZ）和MZ.Cb，中心体；cc，中心细胞；淋巴结；MΦ，巨噬细胞。注意，BMI-1和EZH2的互斥表达在MZ、DZ和MΦ染色图谱中特别显著(C−H)而HRS细胞染色两种PcG蛋白(A类和B类). 原始放大倍数，×400(A类和B类), ×200 (C类和D类)和×630(E−H).
表1。
霍奇金病Reed-Sternberg细胞中BMI-1和EZH2的表达
| 病人 | HD亚型 | 年龄 | 性别 | CD30型 | BMI-1型 | EZH2型 |
|---|
| 1 | NS公司 | 25 | 米 | + | + | + |
| 2 | 国会议员 | 71 | （f） | + | + | + |
| 3 | NS公司 | 48 | 米 | + | + | + |
| 4 | NS公司 | 33 | 米 | 钕 | + | + |
| 5 | NS公司 | 18 | 米 | + | + | + |
| 6 | NS公司 | 19 | （f） | + | + | + |
| 7 | NS公司 | 73 | （f） | + | + | + |
| 8 | NS公司 | 57 | 米 | + | + | + |
| 9 | NS公司 | 15 | （f） | 钕 | + | + |
| 10 | NS公司 | 37 | 米 | + | + | + |
| 11 | NS公司 | 26 | （f） | 钕 | + | + |
| 12 | NS公司 | 18 | （f） | + | + | + |
| 13 | NS公司 | 35 | 米 | + | + | + |
| 14 | 无† | 27 | 米 | 钕 | + | + |
| 15 | 网络操作系统 | 13 | 米 | + | + | + |
| 16 | NS公司 | 15 | 米 | + | + | + |
HRS细胞中BMI-1和EZH2的表达与正常淋巴结中的染色模式形成对比，正常淋巴结对这些蛋白的检测似乎相互排斥。BMI-1的表达主要在亮区（LZ）和地幔区（MZ）以不同的水平发现，而暗区（DZ）细胞通常为阴性（图1，C，E和G）相比之下，EZH2主要在DZ中表达，而在LZ中表达EZH2的细胞较少，而在MZ中表达的细胞很少（图1、D、F和H）毛囊EZH2−/BMI-1型+细胞具有中心细胞外观（图1，E和G），而卵泡型EZH2+/BMI-1型−表达细胞类似于成中心细胞（图1，F和H）我们之前证明，BMI-1的少数+细胞是T细胞。29巨噬细胞为BMI-1+并且没有表示EZH2（图1，E和F）BMI-1和EZH2在身体不同部位（纵隔、腹股沟、腋下）淋巴结的生发中心或结外淋巴组织中的表达模式相似（数据未显示）。
通过双重和三重免疫荧光进一步研究了BMI-1和EZH2的表达，这使我们能够确定与其他标记物（如CD30和Mib-1/Ki-67）相关的BMI-1及EZH2的表达（见材料和方法）。通过对BMI-1和EZH2进行双重染色，我们首次证实了HRS细胞中BMI-1与EZH2的共表达。事实上，具有巨核的HRS样细胞同时表达BMI-1（图2A）和EZH2（图2B）; 这些信号的组合证实了这些PcG蛋白在同一细胞核中的双重表达（图2C）。然后我们确定BMI-1+/EZH2型+表达CD30的细胞（图2，D-F） 将这些细胞识别为HRS细胞。注意，大多数浸润细胞表达BMI-1+，（图2、A、C、D和F）但通常是EZH2−（图2、B、C、E和F）这包括激活的CD30+淋巴细胞（图2、B和E）此外，偶尔观察到BMI-1+/EZH2型−细胞核较大的细胞可能代表巨噬细胞，因为这些细胞是CD30−（图2F，另请参见图1、B和E). 浸润淋巴细胞中BMI-1和EZH2的互斥表达模式与滤泡B细胞的表达模式相似。卵泡EZH2表达（图2G）与BMI-1表达分离（图2H），在DZ和LZ交界处检测到少量双阳性（黄色）细胞（图2I）。
A−I：BMI-1和EZH2在HRS细胞中的表达(A−F)和LN(G−I型). BMI-1型(A类和D类; 红色荧光）和EZH2(B类和E类; 绿色荧光）在HRS细胞中检测到，而浸润淋巴细胞是BMI-1+(A类和B类)一般不表示EZH2(B类和E类). BMI-1和EZH2的共表达产生黄色核信号(C类和F类). 这些细胞核属于HRS细胞，因为它们表达CD30（蓝色信号D−F型). 具有致密细胞核的Occasional EZH2表达细胞也表达CD30(E类)，但属于BMI-1−; 这些可能是活化的淋巴细胞。注意EZH2+浸润淋巴细胞可能是淋巴结滤泡中残留的成中心细胞。CD30型−/BMI-1型+核较大的细胞可能是巨噬细胞（MΦinF类). 滤泡淋巴细胞(G−I型)，BMI-1主要在LZ中检测到(G公司)而EZH2主要在DZ中检测到(H（H）). BMI-1和EZH2的共表达有时在LZ和DZ的界面上观察到，但发生在非常低的频率(我). EZH2和Mib-1/Ki-67在HRS细胞中的表达(J−L型)和LN(M−O型)：两种HRS细胞中都有EZH2的表达(J型; 绿色荧光）和位于DZ的LN成中心细胞(M（M）)，与Mib-1/Ki-67的检测结果一致(K（K）和N个). 红色和绿色荧光信号结合产生黄色细胞核(L（左）和O（运行）)支持HRS细胞和成中心细胞中Mib-1/Ki-67和EZH2的共表达。HRS细胞和LN中BMI-1和Mib-1/Ki-67的表达：HRS细胞及周围浸润中出现BMI-1的表达(P（P）). HRS细胞也表达Mib-1/Ki-67(问，绿色荧光），当红色和绿色荧光结合时，在HRS细胞中产生黄色信号(R（右）). 相比之下，BMI-1(S公司，红色荧光）和Mib-1/Ki-67表达(T型，绿色荧光）在滤泡淋巴细胞中分离(U型)和HRS细胞周围的浸润淋巴细胞(R（右）). 有关缩写，请参见图1图例。原始放大倍数，×400。
先前的实验表明，Mib-1/Ki-67在扁桃体淋巴滤泡中的表达仅限于EZH2+成中心细胞，而BMI-1+滤泡淋巴细胞不表达Mib-1/Ki-67。29接下来，我们询问HRS细胞中BMI-1和EZH2的表达与Mib-1/Ki-67的表达在多大程度上一致，以及这些模式是否通过淋巴结中的滤泡反映出来。我们发现Mib-1/Ki-67在HRS细胞中表达，与BMI-1或EZH2表达无关。在两个EZH2中均检测到Mib-1/Ki-67+（图2，J-五十） 和BMI-1+（图2，P-R） HRS细胞。相比之下，淋巴结滤泡淋巴细胞中Mib-1/Ki-67的表达与BMI-1的表达明显分离：而EZH2+滤泡淋巴细胞也表达Mib-1/Ki-67（图2，M-O） ，在BMI-1中未检测到Mib-1/Ki-67+滤泡细胞（图2，S-U） ●●●●。
讨论
PcG蛋白在各种过程中具有调节作用，包括胚胎发育、造血和细胞周期控制。21-32最近的几项研究表明，这些蛋白也参与了肿瘤的发生。小鼠Bmi-1PcG基因被鉴定为一种下调第16页/墨水4a和第19页/ARF并与c-myc公司产生淋巴瘤。41,42类似地，RING1 PcG基因的过度表达导致了肿瘤的转化和诱导，并且与肿瘤的上调相一致c-jun公司和c-fos公司。36尽管一项研究指出，一组囊胚样细胞受累的人套细胞淋巴瘤表现出BMI-1扩增，47迄今为止，还没有其他研究涉及PcG基因可能参与人类癌症。在目前的研究中，我们证明人类BMI-1和EZH2-PcG基因在HRS细胞的细胞核中共存。这种模式与滤泡B细胞中BMI-1和EZH2的表达形成鲜明对比，后者在大多数细胞中相互排斥。由于在滤泡淋巴细胞中很少检测到BMI-1和EZH2的双重表达，并且大多数HRS细胞都表达这两种蛋白，因此我们得出结论，BMI-1与EZH2的共表达与HRS细胞的转化状态有关。
GC B细胞发育的各个阶段，48从外套膜细胞到成中心细胞再到中心细胞，与PcG基因表达谱的显著变化有关29（以及本研究）。BMI-1以Mib-1/Ki-67表示−静息套细胞和中心细胞，而EZH2主要在快速分裂的Mib-1/Ki-67中检测到+成中心细胞。静止的B细胞向分裂的成中心细胞的转变似乎与BMI-1表达的丧失和EZH2表达的获得有关，而成中心细胞向中心细胞的分化则与相反的模式相一致。我们对这些发现的解释是，BMI-1和EZH2的表达受到严格的调控，并且在大多数正常卵泡B细胞中相互排斥。这种独特的PcG表达模式很可能与BMI-1和EZH2蛋白代表不同PcG复合物这一事实有关。BMI-1复合物还包含RING1、HPH1、HPH2和HPC2 PcG蛋白质，而EZH2与另一复合物中的EED PcG蛋白相关。34-39各种PcG复合物可能有不同的靶基因，31这可以解释为什么卵泡B细胞的分化状态与BMI-1和EZH2的差异表达相关。在突变小鼠中的实验表明，BMI-1的丢失导致B细胞祖细胞分裂受到抑制，而EED的丢失与增殖增加有关。27由于BMI-1和EED属于不同的复合物，这表明这些PcG复合物之间的复杂平衡对淋巴细胞增殖至关重要。
HD患者的这种平衡似乎受到干扰，因为HRS细胞与滤泡淋巴细胞相比，BMI-1、EZH2和Mib-1/Ki-67的表达模式不规则。尽管在扁桃体和淋巴结的绝大多数滤泡淋巴细胞中，BMI-1的表达与EZH2分离，但这些蛋白在HRS细胞的细胞核中共存。其次，Mib-1/Ki-67仅在EZH2中检测到+正常滤泡淋巴细胞，而BMI-1+细胞不表达Mib-1/Ki-67。相比之下，Mib-1/Ki-67在BMI-1中表达+HRS细胞。这些模式背后的机制尚不清楚，可能是由于EZH2和Mib-1/Ki-67未能下调，BMI-1表达增加或诱导，或这两种可能性的结合所致。无论是何种机制，在Mib-1/Ki-67存在下BMI-1和EZH2的共表达强烈表明HRS细胞中细胞周期的放松是由PcG基因的不规则表达所反映的。PcG表达的干扰是否导致细胞转化（或是否是该过程的结果）仍有待确定。
总之，我们证明了BMI-1和EZH2-PcG基因在HRS细胞的细胞核中共表达，而它们的表达在GC B细胞分化过程中是高度调节和相互排斥的。这表明HD与PcG蛋白表达的失调有关。结合其他人在不同肿瘤模型中获得的结果，我们的研究需要进一步研究人类PcG基因作为导致淋巴腺病的候选因素。
脚注
请将转载请求发送至Frank M.Raaphorst，VU大学医院病理科，地址：荷兰阿姆斯特丹HV 1081号De Boelelaan 1117室PA-001。电子邮件：.ln.uvza@tsrohpaar.mf
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