鲜血。2007年6月1日；109(11): 4839–4845.
免疫生物学
硼替佐米通过暴露细胞表面热休克蛋白90增强树突状细胞（DC）介导的人类骨髓瘤免疫诱导：治疗意义
,1 ,2 ,三 ,三 ,三和
1 安娜·查拉兰博斯
2纽约洛克菲勒大学细胞生理学和免疫学实验室；
Madhav V.Dhodapkar公司
1肿瘤免疫学与免疫治疗实验室
1肿瘤免疫学与免疫治疗实验室
2洛克菲勒大学细胞生理学和免疫学实验室，纽约州纽约市；
三纽约州纽约市圣文森特癌症中心
通讯作者。 2006年10月25日收到；2007年2月7日接受。
摘要
大多数抗癌化学疗法都具有免疫抑制作用，并导致非免疫原性肿瘤细胞死亡。硼替佐米（Bortezomib）是26S蛋白酶体的特异性抑制剂，在包括骨髓瘤在内的多种人类肿瘤中显示出临床活性。这里我们表明，在硼替佐米（bortezomib）导致肿瘤细胞死亡后，树突状细胞（DC）摄取人类骨髓瘤细胞，而不是γ射线照射或类固醇，导致诱导抗肿瘤免疫，包括对原代肿瘤细胞的免疫，而无需任何额外的佐剂。硼替佐米杀死的肿瘤细胞向树突状细胞传递激活信号依赖于树突状中心与死亡肿瘤细胞之间的细胞间接触，并通过硼替佐米诱导暴露在死亡细胞表面的热休克蛋白90（hsp90）介导。硼替佐米和格尔德霉素（一种hsp90抑制剂）联合使用会导致肿瘤细胞发生更大的凋亡，但会消除其免疫原性。这些数据确定了药物诱导的死亡细胞表面内源性热休克蛋白的暴露是人类肿瘤免疫原性死亡的机制。硼替佐米对肿瘤的特异性靶向可能增强其免疫原性和诱导抗肿瘤免疫。
介绍
大多数抗肿瘤化学疗法通过诱导凋亡来杀死肿瘤细胞。然而，在大多数（但不是所有）情况下，化疗诱导的细胞死亡并不会导致抗肿瘤免疫增强。1–4更好地了解哪些特效药会导致免疫原性细胞死亡及其潜在机制，可能有助于癌症化疗和免疫疗法的整合。硼替佐米是26S蛋白酶体亚单位的特异性抑制剂，在多种肿瘤中显示出良好的临床活性。5硼替佐米通过多种机制诱导人类肿瘤细胞凋亡，包括抑制NFκB和破坏未折叠蛋白反应。5我们假设诱导肿瘤细胞死亡的方式可能对其免疫原性有重大影响。在这里，我们表明，DC对硼替佐米b杀伤的人骨髓瘤细胞的摄取可在培养基中强烈诱导抗肿瘤免疫，而无需任何额外的佐剂，并表征了增强免疫原性的机制
患者、材料和方法
患者
根据圣文森特癌症中心和洛克菲勒大学机构审查委员会批准的《赫尔辛基宣言》提供的知情同意书，获得多发性骨髓瘤患者的外周血和骨髓样本。
原发性肿瘤细胞的分离
使用Ficoll Hypaque（GE HealthCare，Uppsala，瑞典）通过密度梯度离心法从血液或骨髓中获得单核细胞。使用CD138磁珠（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）将骨髓单核细胞分离为肿瘤（CD138+）和非肿瘤（CD38−）组分。将肿瘤细胞冷冻保存在小份中，用作抗原源和靶点。
细胞系
骨髓瘤细胞系取自美国类型培养收集（U266，HLA-A2阳性；ATCC，Manassas，VA）或由J.Epstein，Arkansas Cancer Center，Little Rock，AR提供（cag，HLA-A2-阴性）。其他使用的肿瘤细胞系包括NCEB1（套细胞淋巴瘤；O.O'Connor的礼物，纪念Sloan Kettering[MSKCC]，纽约）和MCF-7（乳腺癌；P.Livingston的礼物，MSKCC）。细胞系在添加10%胎牛血清（FCS）/谷氨酰胺/庆大霉素的RPMI 1640中生长。
肿瘤负载DC的生成
通过培养纯化的CD14生成DC+如前所述，在存在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（加利福尼亚州千橡树市Immunex）和白细胞介素-4（IL-4）（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司）的情况下，从患者外周血单个核细胞或棕毛中分离出的细胞。6在硼替佐米（100 nM）（Velcade，Millennium Pharmaceuticals，Cambridge，MA）或地塞米松（1μM）存在下培养24小时或通过γ射线照射（20 Gy）杀死肿瘤细胞。annexin V/TO-PRO3染色监测细胞凋亡程度。在给DC喂食之前，对细胞进行广泛清洗。以1:2的DC/肿瘤细胞比率喂养未成年DC（第5天）。在一些实验中，肿瘤细胞被抗syndecan-1抗体包被（B-B4，1μg/mL；Serotec，罗利，北卡罗来纳州）。6,7在一些实验中，用100 ng/mL脂多糖（LPS）刺激脉冲DC 6小时（西格玛，密苏里州圣路易斯）。
刺激骨髓瘤细胞-特异性T细胞
如所述，在培养的第0天和第7天，以1:30的比例将未脉冲或负载肿瘤的DC添加到CD56耗竭的T细胞中。7在培养第2天和第7天添加IL-2（25-50国际单位/mL；Chiron，Emeryville，CA）。在最后一次DC刺激后7至9天，对培养物进行肿瘤特异性T细胞检测。
HSPs在死亡肿瘤细胞上的表达
用硼替佐米或γ射线照射肿瘤细胞，6至24小时后用特异性单克隆抗体（Stressgen，Ann Arbor，MI）流式细胞术分析诱导型hsp70和hsp90的表达。
DCs与杀伤肿瘤细胞相互作用后表型的FACS分析
流式细胞术检测与肿瘤细胞培养的DC的表型。用硼替佐米、γ射线或地塞米松杀死肿瘤细胞，并与未成熟DC共培养24小时。在一些实验中，如前所述，DC和肿瘤细胞在共培养前进行染色标记，以监测吞噬作用。6在一些实验中，在建立共培养之前，用格尔德霉素（GDC，Sigma）以100 nM或抗hsp90单克隆抗体（10μg/mL）预先培养肿瘤细胞。使用藻红蛋白（PE）-针对以下分子的结合单克隆抗体（mAbs）：CD80、CD86、CD83和HLA-DR（BD Biosciences，加州圣何塞）。DC在4°C下染色30分钟，在磷酸盐缓冲盐（PBS）+0.1%牛血清白蛋白（BSA）中洗涤两次，并使用FlowJo软件（Tree Star，Ashland，OR）在FACS Calibur（BD Biosciences）上进行分析。DC根据其FSC和SSC特性进行门控，通过to-PRO3（Molecular Probes，Eugene，OR）染色将死亡细胞排除在分析之外。包括适当的同型对照，每个实验获得5000个活DC。
肿瘤反应性、产生IFN-γ的T细胞的评估
如前所述，通过酶联免疫斑点（ELISPOT）分析评估肿瘤负载DC对肿瘤反应性干扰素（IFN）-γ-生成T细胞的诱导作用。7在一些实验中，以HLA A2+U266肿瘤细胞为靶点，以HLA-A2-cag细胞为对照靶点，对HLA-A2+供体抗骨髓瘤T细胞反应的诱导进行了测试。为了检测肽特异性T细胞，在一些实验中，用10μM来自MAGEA3（271-279，FLWGPRALV）和NYESO1（157-165，SLLMWITQC）的限定HLA A2限制性肽或2.5μM针对survivin的重叠肽库（15肽重叠11 aa）的自体DC作为抗原提呈细胞（APC），如前所述。6,7这些肽由洛克菲勒大学蛋白质组学资源中心合成。在一些实验中，通过细胞内IFNγμ染色监测肿瘤特异性IFN-γ产生T细胞6
细胞毒性测试
以流式细胞术为基础的细胞毒性试验分析了抗肿瘤T细胞的细胞毒性。8靶细胞用1μM羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）（分子探针，尤金，OR）标记，并与效应T细胞以1:20的肿瘤T细胞比共培养6小时。然后通过流式细胞仪CFSE/TO-PRO3双重染色测定肿瘤细胞的杀伤率。
结果
硼替佐米以剂量和时间依赖性的方式诱导骨髓瘤细胞凋亡。9,10在100 nM硼替佐米存在下培养骨髓瘤细胞系（U266和cag）24小时后，95%以上的细胞发生凋亡（%膜联蛋白V+细胞），该剂量用于初始实验。染料（PKH-26）标记的肿瘤细胞通过硼替佐米或γ射线照射杀死并喂入DC。11硼替佐米杀死的U266骨髓瘤细胞被未成熟树突状细胞吞噬，吞噬速率与γ射线照射细胞相似（数据未显示）。这些DC随后被LPS激活，并用于刺激肿瘤特异性T细胞。用硼替佐米杀伤骨髓瘤细胞脉冲的DC是肿瘤特异性IFNγ产生T细胞的更有效诱导剂(A） ●●●●。抗syndecan-1单克隆抗体对骨髓瘤细胞的作用通过靶向DC上的Fcγ受体增强肿瘤抗原的交叉呈现。7,12即使在这种情况下，用硼替佐米灭活的U266细胞脉冲的DC效率更高(B） ●●●●。用硼替佐米b杀伤的U266细胞脉冲的树突状细胞对骨髓瘤细胞表达的特定肿瘤抗原（例如MAGE-3、NY-ESO1和survivin）的T细胞水平也明显增强了肿瘤特异性免疫反应的诱导(C） ●●●●。经硼替佐米灭活U266脉冲的树突状细胞诱导的肿瘤细胞特异性T细胞也比经γ射线照射或地塞米松灭活肿瘤细胞的树突形细胞扩增的T细胞具有更高的细胞毒活性(D） ●●●●。因此，与γ射线照射或地塞米松杀死肿瘤细胞相比，硼替佐米杀死肿瘤细胞的DC摄取导致抗肿瘤T细胞的诱导作用更强。
硼替佐米诱导人骨髓瘤免疫原性细胞死亡（A）通过负载通过硼替佐米或γ辐射杀死的U266肿瘤细胞的DC扩增骨髓瘤反应性T细胞。使用LPS作为成熟刺激物，使单核细胞衍生DC或负载U266肿瘤细胞的DC成熟。分别使用载瘤DC和非脉冲DC刺激自体T细胞2周。用ELISPOT法分析干扰素-γ产生子对未脉冲DC、U266或对照cag细胞的抑制作用。所示数据为3个代表性实验中1个的平均值/SD。（B） 与面板A中的设置相同。除了使用装载有杀伤肿瘤细胞的DC外，还使用硼替佐米和γ射线照射杀死的U266细胞对DC进行脉冲处理，并使用抗CD138单克隆抗体进行调理。通过隔夜ELISPOT检测分析U266细胞的IFN-γ产生子。所示数据是对不同献血者进行的3项独立实验的总结。（C） HLA-A2来源的未成熟单核细胞衍生DC+供体被涂有同型对照或抗CD138抗体的U266骨髓瘤细胞装载。然后用树突状细胞刺激自体T细胞。第7天，用相同的DC重新刺激T细胞。培养14天后，在ELISPOT板中隔夜刺激T细胞，用来自MAGE-A3、NY-ESO-1的10μM HLA-A2限制性肽或来自survivin的重叠15肽库的2.5μM脉冲自体DC。通过ELISPOT分析定量IFN-γ产生菌。显示的数据是对3名献血者进行的3个独立实验的平均值/SD*P（P）与γ射线照射肿瘤细胞负载DC的比较值，P（P）< .05. （D） 骨髓瘤反应性T细胞被负载有经硼替佐米、地塞米松或γ射线照射杀死的U266肿瘤细胞的DC扩增后的细胞毒性活性。以1:20的比例将CFSE标记的靶细胞与T细胞孵育6小时，并通过TO-PRO3染色测定死亡细胞的百分比。所示数据代表了3个实验。（E） 硼替佐米或地塞米松治疗后细胞凋亡动力学。膜联蛋白V阳性或膜联蛋白V/TO-PRO3双阳性细胞被认为是凋亡细胞。活细胞定义为annexin V–negateTO-PRO3阴性。数据代表了3个单独的实验。（F） 硼替佐米或地塞米松诱导凋亡过程中早期（膜联蛋白V阳性/TO-PRO3阴性）或晚期（膜联肽V/TO-PRO3双阳性）肿瘤细胞的比例。3个实验的代表性结果。（G） 典型的FACS图显示了诱导凋亡24小时后用于DC脉冲的肿瘤细胞的凋亡阶段。
为了验证地塞米松和硼替佐米杀伤肿瘤细胞的免疫原性之间观察到的差异不是由这些药物导致肿瘤细胞死亡的动力学或程度的差异引起的，我们监测了细胞凋亡的动力学，以annexin V+细胞的百分比计量(E） 以及早期（annexin V+TOPRO3-）和晚期（annecinV+TOPRO3+）凋亡细胞的比例(F） 在药物暴露后的不同时间点。地塞米松和硼替佐米诱导肿瘤细胞死亡的动力学相似。24小时时，当肿瘤细胞用于DC搏动时，两种治疗中超过92%的细胞处于晚期凋亡阶段(G） ●●●●。因此，尽管凋亡的动力学和程度相似，但硼替佐米杀死的肿瘤细胞激活树突状细胞的能力与其他治疗方法杀死的肿瘤相比存在显著差异。
然后，使用相同的实验模型，我们测试了骨髓瘤患者分离的原代肿瘤细胞的诱导凋亡模式是否也对T细胞免疫的诱导产生影响。用硼替佐米、γ射线或地塞米松杀死骨髓瘤患者骨髓中纯化的CD138+肿瘤细胞，并将其喂入自体DC。与喂食γ射线或地塞米松杀死的肿瘤细胞的DC相比，喂食硼替佐米杀伤肿瘤细胞的DCs诱导更大的肿瘤特异性CD4和CD8 T细胞反应(A、 B）。因此，诱导原发性骨髓瘤细胞凋亡的方法对肿瘤负载DC产生抗肿瘤免疫具有重要影响。
硼替佐米对多发性骨髓瘤患者骨髓瘤细胞的免疫原性增强（A）用γ射线照射、地塞米松或硼替佐米杀死的自体CD138阳性肿瘤细胞对来自多发性骨髓瘤（MM）患者的DC进行脉冲处理，用LPS成熟，并用于刺激自体T细胞2周。用ELISPOT法分析抗未脉冲DC或用自体肿瘤细胞脉冲DC的IFN-γ产生子。数据显示了3名受试患者中代表患者的平均值/SD*P（P）< .05. （B） 自体肿瘤细胞特异性CD4和CD8 T细胞产生细胞内IFNγ。将T细胞扩增为A组，用载有杀伤肿瘤细胞的自体树突状细胞刺激后，用流式细胞仪分析IFNγ的产生。
DC诱导免疫的能力与其激活或成熟状态密切相关。未成熟DC与硼替佐米灭活但未经γ射线照射的肿瘤细胞或地塞米松处理的肿瘤细胞共同培养，导致CD83、CD80和CD86的表达增加，这与硼替佐米灭活的肿瘤细胞提供DC成熟刺激相一致(A、 数据未显示）。重要的是，硼替佐米杀死的肿瘤细胞促进DC成熟的能力在通过跨阱将DC从死亡的肿瘤细胞中分离出来时被剥夺，这表明肿瘤和DC之间需要细胞间接触。先前的研究表明，蛋白酶体的抑制会导致几种热休克蛋白（hsps）的表达增加，包括hsp70和hsp90。13,14此外，我们假设硼替佐米诱导的细胞死亡也可能导致hsps移位到细胞表面。树突状细胞确实表达hsps受体，并且可以通过这种机制激活。15与诱导型hsp70相比，硼替佐米治疗骨髓瘤细胞导致hsp90的表面表达显著增加(B） ●●●●。硼替佐米诱导细胞表面hsp90并非骨髓瘤独有，也在套细胞淋巴瘤（NCEB1）和乳腺癌（MCF-7）细胞系中检测到(C） ●●●●。死亡肿瘤的DC激活刺激传递与hsp90上调的程度相关，并不局限于晚期凋亡细胞。我们在硼替佐米治疗12到24小时后检测到hsp90的显著表达，这一发现与与硼替佐米特灭活的肿瘤细胞共培养的树突状细胞上成熟相关标记物的表达增加有关(D、 E）。在硼替佐米之前，用格尔德霉素（GDC，一种hsp90抑制剂）预孵育骨髓瘤细胞，可以更好地诱导肿瘤细胞凋亡(F） ●●●●。然而，被这种组合杀死的肿瘤细胞在垂死的肿瘤细胞上表达的表面hsp90水平降低(B） ●●●●。当GDC和硼替佐米联合作用杀死的骨髓瘤细胞被喂入DC时，它们导致共刺激分子的诱导少于喂入硼替佐米特杀肿瘤细胞的DC，且DC与死亡肿瘤细胞的比例相同(G） ●●●●。在γ射线杀死肿瘤细胞的情况下，单纯增加肿瘤/DC比率不会导致DC成熟11或地塞米松（数据未显示）。因此，GDC在这些实验中的作用并不是由于肿瘤细胞死亡程度的改变。为了进一步验证GDC的观察效果确实与其抑制hsp90的能力有关（相对于hsp90独立作用或增强凋亡的非特异性作用），我们还分析了抗hsp90抗体代替GDC的作用。与该抗体预孵育也可阻断硼替佐米杀伤肿瘤细胞诱导的DC成熟(G） ●●●●。因此，硼替佐米杀死的肿瘤细胞向树突状细胞发出的激活信号是通过暴露在死亡细胞表面的hsp90介导的，并且需要死亡细胞和树突状中心之间的细胞间接触。
硼替佐米诱导免疫原性细胞死亡的机制：细胞表面hsp90在硼替佐米诱导细胞死亡免疫原性中的作用（A）树突状细胞与硼替佐米b作用后的表型杀死U266细胞。第5天，将未成熟DC与γ射线照射、地塞米松或硼替佐米杀死的U266骨髓瘤细胞培养24小时。第二组共培养物设置在跨孔中，以防止DC/肿瘤细胞接触。24小时后，用流式细胞术分析DCs上CD80和CD86的表达。显示了平均荧光强度*P（P）与γ射线照射肿瘤细胞负载DC的比较值，P（P）< .05. （B） 硼替佐米治疗的U266诱导可诱导HSP70（iHPS70）和HSP90表达。γ射线照射或硼替佐米诱导U266骨髓瘤细胞凋亡，24小时后流式细胞仪检测HSP70和HSP90的表面表达。在加入硼替佐米前1小时用格尔德霉素预孵育肿瘤细胞可抑制HSP90表达的增加。（C） 硼替佐米治疗骨髓瘤（U266和cag）、套细胞淋巴瘤（NCEB1）和乳腺癌（MCF-7）细胞24小时后HSP90表达。（D） 流式细胞术分析地塞米松或硼替佐米处理后U266细胞HSP90表达的动力学。（E） 树突状细胞与地塞米松或硼替佐米相互作用后的表型在不同凋亡阶段杀死U266细胞。用硼替佐米或地塞米松杀死U266细胞，并在诱导凋亡后6、12和24小时与第5天的未成熟DC共培养。24小时后，用流式细胞术分析DCs上CD86的表达。显示了平均荧光强度*P（P）与未成熟DC进行比较的值，P（P）< .05. （F） γ射线照射、硼替佐米治疗或硼替佐米加格尔德霉素联合治疗后U266骨髓瘤细胞凋亡动力学。通过流式细胞仪对活细胞百分比进行24小时的跟踪。活细胞被定义为膜联蛋白V阴性/To-Pro3阴性。（G） 通过GDC或抗HSP90抗体与硼替佐米杀伤骨髓瘤细胞相互作用后抑制DC上CD86表达增加。将未成熟DC与硼替佐米杀死的U266骨髓瘤细胞培养24小时，流式细胞仪分析CD86的表达。在硼替佐米诱导细胞凋亡之前，用格尔德霉素或抗HSP90单克隆抗体预先孵育肿瘤细胞可消除CD86表达增加。图中显示了同型对照染色（灰色线）和抗HPS90单克隆抗体染色（黑色线）。误差线表示平均值±SD。
接下来，我们评估了肿瘤诱导的DC激活对这些DC诱导抗肿瘤免疫的影响。肿瘤细胞用硼替佐米或辐射单独或用GDC杀死。用这些肿瘤细胞喂养树突状细胞，随后用或不用脂多糖成熟，并用于刺激T细胞。用干扰素-γELISPOT监测肿瘤特异性T细胞的生成(A） 以及细胞内细胞因子流式细胞术(B） ●●●●。重要的是，装载硼替佐米杀伤肿瘤细胞的树突状细胞有效地诱导抗肿瘤免疫，而不需要额外的成熟刺激，而装载辐照肿瘤细胞的DC无效，除非提供外源性DC成熟(A、 B）。与喂食硼替佐米灭活肿瘤的DC相比，喂食GDC和硼替佐米灭活肿瘤细胞的DC也导致抗肿瘤T细胞的诱导较少(A、 B）。因此，硼替佐米杀伤肿瘤细胞的免疫原性增强与hsp90对死亡肿瘤细胞的诱导和细胞接触介导的DC激活密切相关。
格达那霉素消除硼替佐米杀伤骨髓瘤细胞的免疫原性增强（A）在硼替佐米治疗前，用γ射线照射杀死的U266骨髓瘤细胞、硼替佐米单用或用格尔德霉素预孵育1小时的骨髓瘤细胞对DC进行脉冲处理。肿瘤负载DC加或不加LPS的额外成熟刺激，然后作为自体T细胞的刺激物使用2周。第7天，用新鲜肿瘤细胞脉冲DC重新刺激T细胞。在第14天，肿瘤反应性T细胞对U266骨髓瘤细胞的反应产生IFNγ，通过隔夜ELISPOT进行定量。以HLA-A2阴性细胞系cag或未脉冲自体DC的反应作为对照。所示数据为3名献血者的3个独立实验的平均值/SD。（B） 用γ射线或硼替佐米杀死的凋亡的U266肿瘤细胞喂养树突状细胞，用或不用格尔德霉素预孵育U266细胞1小时。然后用LPS激活脉冲DC或不进行处理。然后使用DC刺激T细胞，如图2A所示。在培养的第14天，通过细胞内细胞因子流式细胞术监测U266肿瘤细胞对IFNγ产生的反应。数据代表了3名捐赠者的类似实验。对HLA-A2阴性cag细胞的反应作为阴性对照，不超过0.1%（未显示）。
接下来，我们测试了硼替佐米诱导骨髓瘤患者原代肿瘤细胞凋亡是否可以诱导抗肿瘤T细胞免疫，而无需额外刺激。骨髓瘤患者纯化的CD138+肿瘤细胞用硼替佐米、地塞米松或γ射线照射杀死，并喂入自体单核细胞衍生的未成熟DC。然后，这些DC被用于刺激肿瘤特异性T细胞，而无需任何额外的成熟刺激。喂食硼替佐米杀死的肿瘤而非辐照的树突状细胞，在3名受试患者中有3名患者的肿瘤特异性T细胞被激活(). 因此，硼替佐米介导的细胞死亡提供了一种独特的免疫原性刺激，并导致抗肿瘤免疫的激活。
硼替佐米在无需外源性DC成熟刺激的情况下杀伤原发性骨髓瘤细胞诱导抗肿瘤免疫用γ射线照射、地塞米松或硼替佐米在无任何DC成熟刺激的情况下杀死的自体CD138阳性肿瘤细胞对来自MM患者的单核细胞衍生DC进行脉冲处理，并用于刺激自体T细胞2周。用ELISPOT分析法分析干扰素-γ产生子对抗未脉冲DC或用自体肿瘤细胞脉冲DC。显示的数据是3名受试患者的代表性数据（平均值/SD）。
讨论
濒死细胞与树突状细胞之间的相互作用是一个深入研究的焦点。三树突状细胞专一性地从死亡细胞中摄取和呈现抗原，并在组织内稳态期间维持免疫耐受中发挥重要作用。DC获取和交叉呈现肿瘤抗原也被认为在产生抗肿瘤的T细胞免疫中起着关键作用。因此，不同化疗诱导的细胞死亡对人类肿瘤抗原的交叉提呈是否有不同的影响，对癌症的化疗和免疫治疗的联合具有根本意义。在这里，我们表明硼替佐米诱导的骨髓瘤细胞死亡不同于其他常见的骨髓瘤治疗方法（地塞米松和放疗），因为它提供了独特的免疫激活刺激。硼替佐米可诱导人类骨髓瘤（包括原发性肿瘤细胞）的免疫原性死亡，这一发现对利用免疫系统对抗这种肿瘤以及可能的其他肿瘤具有启示意义。据我们所知，这些数据代表了第一个例子，其中药物诱导的细胞凋亡导致增强的自体抗肿瘤T细胞对原代人类肿瘤细胞的反应，而不需要任何额外的刺激。
硼替佐米杀伤肿瘤细胞的免疫原性机制依赖于细胞间接触，并与死亡细胞表面hsp90的表达有关。先前的研究已经证明硼替佐米治疗的肿瘤细胞中的几个hsp增加，14然而，它们在细胞表面的移位及其产生的免疫效应尚未得到研究。Demaria等人观察到喂食硼替佐米杀伤癌细胞系的小鼠DC中成熟标记物上调，尽管尚未研究其潜在机制和T细胞免疫诱导。16来自坏死细胞的几种可溶性因子被认为是介导DC激活的危险信号。三,17然而，我们的数据表明，在这种情况下，树突状细胞和死亡细胞之间需要细胞接触，并支持小鼠的研究，即细胞表面的hsps代表一种独特的免疫原性刺激。18,19硼替佐米还可能通过抑制供体细胞中的抗原处理来影响交叉呈现。20,21然而，硼替佐米的作用被格尔德霉素消除，这表明这些实验中增强的交叉呈现在很大程度上依赖于hsp。
人们对了解抗癌治疗引起的肿瘤细胞免疫原性与非免疫原性死亡的生化特征颇感兴趣。我们使用原始人类肿瘤细胞的数据表明，在濒死肿瘤细胞表面暴露内源性hsps可能代表了这种刺激。在我们的例子中，主信号通过hsp90传递。然而，暴露在死亡细胞上的特异性hsp的性质可能是细胞类型、组织或刺激/药物特异性的，其潜在机制需要进一步研究。
这些数据对硼替佐米在临床上的使用也有一些启示。诱导凋亡的方式对树突状细胞的交叉表达有重要影响，这一发现对改进树突状病毒介导的癌症免疫治疗也有意义。鉴于热休克蛋白的佐剂特性，目前正在积极评估其在癌症免疫治疗中的作用。22这通常是通过注射纯化的hsps或诱导热疗来实现的。22–24因此，硼替佐米可能是在垂死的肿瘤细胞上诱导内源性hsps并增强其体内免疫原性的有用工具。这些发现不仅局限于骨髓瘤，也在淋巴瘤和乳腺癌细胞系中观察到。药物诱导的hsps表达也可能与硼替佐米的一些临床疗效有关，例如与抗肿瘤活性相关的血管性皮疹。25然而，硼替佐米也可能对DC和活化的T细胞有毒。26,27的确，肿瘤与DC相互作用的破坏10,28可能有助于这种药物的抗脊髓瘤作用。因此，可能需要将该药物靶向肿瘤细胞（与目前的全身给药相反），以充分利用此处所述硼替佐米的免疫原性。这可以通过直接注射到肿瘤（在实体肿瘤、淋巴瘤或浆细胞瘤的情况下）或与抗肿瘤抗体偶联来实现。硼替佐米介导的免疫原性依赖于hsp90，这一发现也促使人们对正在进行的与hsp90抑制剂联合的试验持谨慎态度。设计这些研究的基本原理是基于联合用药增强对肿瘤细胞的杀伤作用。29然而，虽然这些组合可能导致短期内增强反应，但死亡肿瘤细胞的免疫原性降低可能最终限制这种反应的持久性。或者，蛋白酶体抑制剂与其他被认为介导免疫原性死亡的药物（如蒽环类药物）的组合4可能会引起特别的兴趣。30抗肿瘤治疗的最佳组合不仅取决于它们对肿瘤细胞的影响，还取决于宿主。
致谢
作者感谢R.M.Steinman博士和K.M.Dhodapkar对手稿的批评性阅读，感谢J.Adams对插图的帮助，感谢P.Matthews的技术援助。
美国国立卫生研究院（CA106802、CA109465、P50-AT02779）、Damon Runyon癌症研究基金会、Irene Diamond基金会、Dana基金会和Irma T.Hirschl基金会为医学博士提供了部分资助。
脚注
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节的规定，本文特此标记为“广告”。
作者
贡献：R.S.进行了研究，分析了数据，并撰写了论文；交流分析数据；A.M.、D.V.和S.J.进行了临床研究；M.V.D.设计了研究，分析了数据，并撰写了论文。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
通信：Madhav V.Dhodapkar，洛克菲勒大学肿瘤免疫与免疫治疗实验室，纽约州纽约市约克大道1230号，邮编：10021；电子邮件：ude.rellefekcor@mpadohd.
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