canstatin协同辐射和抑制血管生成诱导HIF-1α介导的肿瘤凋亡开关

体内AdCanHSA-AdNIS-¹³¹我对转基因视网膜色素上皮瘤模型进行了综合治疗。

将转基因酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP-1）小鼠静脉注射AdCanHSA或AdCO1，并进行眶内注射AdNIS或AdCO1。AdNIS驱动一种蛋白质在脉络膜、视网膜和肿瘤内的局部和特异性表达（图​（图2，2、A和B）。经腹腔注射AdNIS感染的TRP-1眼内肿瘤¹³¹一、 4小时后定量摄入放射性碘（1.35%/g眼组织；P（P）=0.005（与AdCO1组相比），证实眼球中的特定碘摄取和AdNIS的特异性-¹³¹I抗肿瘤作用描述如下。

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图2

AdNIS的综合效应-¹³¹我在转基因TRP-1小鼠模型中使用AdCanHSA治疗。

(A类)用抗NIS多克隆抗体对AdNIS感染的RPE肿瘤的免疫组织学分析（原始放大倍数，×50）。(B类)装箱区域的高倍放大A类（原始放大倍数，×200）。阳性细胞位于RPE肿瘤和视网膜中（箭头所示）。(C类)具有代表性的非肿瘤眼科切片，包括视网膜、脉络膜、巩膜和晶状体的位置（箭头所示）。(D类–H（H）)出生后45天RPE肿瘤的组织学。2次全身注射Ad治疗的代表性转基因眼切片_x个和一次眶内注射Ad_年，还有一个¹³¹I注入300μCi。AdCO1和AdCO1(D类); AdCO1和AdNIS(E类); AdCanHSA和AdCO1(F类); 或AdCanHSA和AdNIS(G公司和H（H）)（原始放大倍数，×25）。注意，AdCO1处理的肿瘤细胞持续生长，并在小鼠45天大时占据眼球的一半(D类). 相比之下，AdCanHSA-AdNIS治疗的眼球中只有少数肿瘤细胞存在(H（H）). t、 肿瘤。(我–M（M）)中黑框中区域的高倍图像D类–H（H）分别为（原始放大倍数，×100）。(S公司)测量用适当腺病毒治疗的每个TRP-1转基因小鼠眼球后部的肿瘤面积。结果为平均值±SEM(n个= 10). (N个–R（右）)在上述每次治疗后使用凝集素免疫染色评估肿瘤内血管形成（原始放大倍数，×100）。AdCO1和AdCO1(N个); AdCO1和AdNIS(哦); AdCanHSA和AdCO1(P（P）); AdCanHSA和AdNIS(问和R（右）)（与中的黑框中相同D类–H（H）). 原始放大倍数，×200。(T型)每组肿瘤内血管的平均数量±SEM*P（P）< 0.05.

AdCanHSA-AdNIS抑制肿瘤生长-¹³¹I综合治疗（平均0.8 mm²与AdCO1处理相比，2.9 mm²; 70%肿瘤生长抑制；P（P）= 0.001). 与AdNIS治疗相比，这些结果也很显著-¹³¹仅I（平均值，4.1 mm²;P（P）= 10^—5)或AdCanHSA-¹³¹仅I（平均值，2毫米²;P（P）=0.009）（图​（图2，2、D–M和S）。

接下来，我们使用凝集素免疫染色评估了在该模型中联合治疗是否也抑制了血管生成。如图所示​图2，2，N–P，AdCO1-，AdNIS中仍有大量开放管腔的血管-¹³¹I–和AdCanHSA-¹³¹与AdCanHSA-AdNIS相比，I治疗的肿瘤-¹³¹I–治疗肿瘤（图​（图2，2、Q和R）。量化肿瘤内血管仅在AdCanHSA-AdNIS中显示出强烈的抗血管生成作用-¹³¹I–（81%；P（P）<0.001），AdCanHSA中轻微-¹³¹I–治疗（19%；P（P）=0.002），与AdCO1治疗组相比（图​（图2T）。2T） ●●●●。

总之，¹³¹我的综合治疗治愈了不同的局部病变，并且没有发现肿瘤类型依赖性。

体内AdCanHSA-AdNIS-¹³¹我的联合治疗既能抑制血管生成，又能消除HIF-1的表达和肿瘤线粒体的凋亡。

最近研究表明，辐射可诱导血管内皮细胞优先凋亡，并增加HIF-1活性，导致分泌促血管生成分子，调节血管生成依赖性肿瘤进展(12,13). 矛盾的是，HIF-1也能驱动细胞凋亡(23,25). 为了进一步解释上述双重治疗的抗肿瘤作用，我们研究了肿瘤内血管生成网络、HIF-1表达和凋亡信号通路对辐射和/或canstatin的反应。

确认血管生成与MDA-MB-231肿瘤进展之间的潜在联系，如图所示​图1A，1A、 我们使用CD34免疫染色来评估肿瘤内微血管。尽管AdNIS的血管系统-¹³¹I–或AdCanHSA-¹³¹I治疗的肿瘤在第15天受到轻微抑制，血管发育在第30天受到高度刺激（60.8和68.2血管/mm²分别在第30天）（图​（图3A）。三A） ●●●●。相反，AdCanHSA-AdNIS中肿瘤内血管的发育被稳定抑制-¹³¹I–在第15天和第30天治疗肿瘤（29.5血管/mm²与58个容器/mm相比²AdCO1治疗组；P（P）=0.004，在第30天）（图​（图3A），三A） ，这与图中描述的持续肿瘤生长抑制相一致​图1A。1答：。

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图3

在体内，检测AdNIS后MDA-MB-231异种移植瘤中的缺氧、凋亡和内皮标记物-¹³¹I疗法结合AdCanHSA。

(A类)感染后第30天，通过对肿瘤组织切片的数字分析，量化每平方毫米CD34染色的肿瘤内微血管的数量。原始放大倍数，×100。(B类)CD34内皮免疫染色的代表性图像。(C类)在第15天和第30天（即注射¹³¹一） ●●●●。(D类)每组具有代表性的CAIX染色数字化切片。(E类)量化HIF-1型原位杂交分析mRNA水平。在注射上述适当的腺病毒后的第30天，在肿瘤切片（×40）中量化每个产生mRNA HIF-1α的区域的细胞数。(F类)腺病毒感染的异种移植瘤细胞核（N）和细胞质（C）提取物中HIF-1α蛋白水平的Western blotting分析。RCC（VHL突变）细胞的全细胞裂解物被视为阳性对照。注意，HIF-1α和CAIX在第30天的表达模式相似。(G公司)感染后第15天和第30天，用切片（×200）（TUNEL法）定量每个区域的凋亡细胞比例。半胱天冬酶-9面积分数的量化(H（H）)和caspase-3染色细胞(我)如图所示，在第30天治疗肿瘤的数字化切片中​图1A。1答：(J型)TUNEL和caspase-3染色的代表性插图。柱，每个治疗组9只小鼠的平均±SEM。所有数字化石蜡包埋肿瘤切片都是从图中描述的实验中获得的​图1A。1A.原始放大倍数，×200。

已知HIF-1可刺激肿瘤血管生成(13,23,24). 正如预期的那样，AdNIS-¹³¹I或AdCanHSA-¹³¹我单独诱导了HIF-1应答基因碳酸酐酶IX（CAIX）的长期表达(31)（图​（图3，三、C和D）。在第30天，HIF-1表达之后，辐射或canstatin单独诱导的血管生成。有趣的是，AdCanHSA-AdNIS-¹³¹在治疗期间，我的联合治疗诱导的CAIX在第15天的表达意外消失（在第15到30天之间，CAIX染色细胞的面积分数减少了5倍）。我们进一步显示，在第30天，CAIX蛋白表达反映了HIF-1 mRNA表达。此外，原位杂交显示，在治疗期间（第30天），联合治疗并未诱导HIF-1 mRNA表达，而AdCanHSA-¹³¹I或AdNIS-¹³¹只有我一个人(P（P）=0.03）（图​（图3E）。三E） ●●●●。因此，在第30天，AdCanHSA-AdNIS后的Western blotting也未检测到HIF-1蛋白表达水平-¹³¹I治疗，与单独放疗或单独canstatin相比（图​（图3F）。三F） ●●●●。

这些结果表明，单独辐射或单独canstatin均可通过刺激HIF-1依赖的存活血管生成途径（纠正氧失衡）诱导耐药机制。相反，联合治疗可能会降低肿瘤对辐射的总体抵抗力。

接下来我们展示了AdCanHSA-AdNIS-¹³¹I联合治疗联合治疗是唯一导致显著持续凋亡的治疗方法（与AdCO1治疗组相比，感染后第15天和第30天，凋亡的MDA-MB-231细胞分别增加了9倍和14倍；P（P）<0.0001）（图​（图3G）。三G） ●●●●。更准确地说，AdCanHSA-AdNIS-¹³¹I诱导的细胞凋亡继发于线粒体损伤，导致caspase-9和caspase-3断裂（图​（图3，三、H和I）。相比之下，AdCanHSA-¹³¹I和AdNIS-¹³¹在第15天，我单独诱导了较弱的促凋亡信号，在第30天逐渐消失（与AdCO1组相比，凋亡细胞/场增加了5倍和2倍[P（P）< 10^–3]分别在第15天和第30天）（图​（图3G）。三G） ●●●●。

该实验表明，联合治疗可显著降低血管生成，同时消除HIF-1和CAIX的表达，并导致细胞凋亡。另外，HIF-1已被证明可以诱导细胞凋亡(23–25). AdCanHSA-AdNIS中HIF-1表达的消亡-¹³¹因此，经I治疗的肿瘤可能是HIF-1依赖性凋亡过程诱导的结果。

为了进一步确定HIF-1与联合治疗后肿瘤细胞死亡途径之间的可能联系，我们在体外探索了HIF-1在细胞单独、单独辐射或联合治疗后参与线粒体凋亡和有丝分裂检查点控制的可能性。

在体外，HIF-1和canstatin激活整合素介导的线粒体凋亡信号通路。

为了研究HIF-1在给予canstatin后线粒体肿瘤凋亡细胞死亡中的可能作用，我们对AdCanHSA感染的MDA-MB-231肿瘤细胞的HIF-1表达和caspase-3裂解进行了体外研究。100μM去铁胺（DFO）治疗MDA-MB-231肿瘤细胞能有效诱导HIF-1稳定。

在体内，canstatin联合辐射下调HIF-1的表达（图​（图3C）。三C） ●●●●。正如预期的那样，CanHSA在体外也消除了HIF-1蛋白的表达（图​（图4A，4A、 右侧面板）。这种现象伴随着胱天蛋白酶-3的裂解。相反，CanHSA在不表达HIF-1的肿瘤细胞中诱导了低凋亡效应（图​（图4A，4A、 比较中间和右侧面板）。HIF-1表达抑制和caspase-3裂解增加均取决于CanHSA感染水平（图​（图4B，4B、 右侧面板）。结果如图所示​图4C4C进一步表明，只有当HIF-1积累高时，CanHSA治疗才能介导细胞毒性效应。

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图4

HIF-1是增强CanHSA诱导的整合素介导的肿瘤凋亡信号通路所必需的。

通过对AdCO1或AdCanHSA感染的MDA-MB-231细胞制备的全细胞提取物进行Western blotting，在存在或不存在DFO的情况下，评估HIF-1α和caspase-3的表达水平(A类)在感染后的不同时间点(B类)具有多个MOI（2000、10000或16000粒子病毒[PV]）或(C类)不同浓度的DFO（1、10、50和100μM[D1、D10、D50和D100]）。表达VHL突变的非感染（NI）或AdCO1或AdCanHSA感染的RCC细胞的全细胞提取物的免疫印迹(D类)或VHL WT(E类)在存在或不存在DFO的情况下，证实HIF-1表达增强AdCanHSA感染后caspase-3的裂解。(F类)HUVEC蛋白提取物的Western blotting显示，HIF-1α不需要诱导CanHSA介导的内皮细胞凋亡过程。注意，HIF-1α的表达略微加速了caspase-3的裂解。Staurosporine（St）是一种已知的caspase依赖性凋亡诱导剂，用作阳性对照。确定α_v（v）β₅整合素促进CanHSA诱导的HIF-1α信号肿瘤凋亡途径，α_v（v）β₅通过siRNAβ沉默₅表达或不表达HIF-1α的MDA-MB-231细胞（如前所述的FACS分析；参考。27) (G公司)对AdCO1或AdCanHSA感染的MDA-MB-231细胞的全细胞提取物进行Western blotting，这些细胞被随机siRNA（siRNA加扰）或siRNAβ转染₅(H（H）). (我)同时，研究α_v（v）β_三整合素参与HIF-1依赖性肿瘤凋亡过程，MDA-MB-231细胞也转染siRNAβ_三然后感染AdCO1和AdCanHSA。每个实验做两次。为了证实CanHSA是否触发HIF-1依赖性凋亡过程，我们在MDA-MB-231细胞内转染了siRNA HIF-1。

我们证实了HIF-1与CanHSA使用von Hippel–Lindau缺陷（VHL缺陷）肾细胞癌4（RCC4）细胞系诱导肿瘤凋亡途径之间的联系，该细胞系未能产生WT VHL蛋白（VHL突变），导致结构性HIF-1α过度表达。在这些细胞中，CanHSA通过caspase-3裂解诱导凋亡（图​（图4D）。4D） 。相反，野生型VHL的再表达导致HIF-1的下调。用50或100μM DFO预处理这些细胞能够诱导HIF-1表达。在这种情况下，CanHSA还诱导了半胱氨酸蛋白酶-3的裂解，如在MDA-MB-231细胞中观察到的（图​（图4E）。4E） ●●●●。

相反，CanHSA诱导的内皮细胞凋亡也独立于HIF-1。事实上，在没有DFO的情况下观察到了CanHSA介导的胱天蛋白酶-3的切割。HIF-1蛋白表达的诱导放大了caspase-3的裂解，但不是必需的（图​（图4F）。4F） ●●●●。

然后我们询问HIF-1蛋白表达的消失是否是由于canstatin介导的HIF-1转录下调所致。在体外HIF-1型通过RT-PCR在肿瘤和内皮细胞中评估的mRNA未被CanHSA调节（数据未显示）。

综上所述，结果表明，在上述体内实验中观察到的凋亡过程并不是由于canstatin诱导抑制HIF依赖性生存途径所致。我们假设，CanHSA介导的内皮细胞死亡可能会诱导体内HIF-1蛋白表达，从而通过上调肿瘤凋亡途径提高CanHSA抗血管生成治疗的疗效。

此外，我们之前已经确定，可以根据整合素基因表达谱预测CanHSA敏感性。事实上，CanHSA与α的相互作用_v（v）β_三和α_v（v）β₅整合素选择性触发线粒体凋亡途径(29). 因此，我们研究了α_v（v）β₅整合素为CanHSA介导HIF-1依赖性肿瘤凋亡信号。FACS分析允许我们表征α_v（v）β₅整合素在MDA-MB-231细胞表面的表达。如图所示​图4G，4G、 α的表达_v（v）β₅HIF-1表达后，肿瘤细胞的表达增加了3倍(P（P）< 0.01). 转染siRNA特异性沉默β₅整合素亚基降低α的表面表达_v（v）β₅30%(P（P）< 0.01). α的这种抑制水平_v（v）β₅表达足以显著降低CanHSA降低HIF-1蛋白水平和裂解caspase-3的能力（图​（图4H）。4H） ●●●●。相反，α_v（v）β_三根据先前对α_v（v）β₅整合素（图​（图4I）。4一） ●●●●。

为了明确确认HIF-1是否需要诱导CanHSA诱导的凋亡过程，siRNA沉默HIF-1表达（图​（图6）6)转染MDA-MB-231细胞。如图所示​图4I，4一、 当HIF-1表达下调时，CanHSA诱导的裂解caspase-3水平降低。

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图6

HIF-1是联合治疗后肿瘤凋亡开关的关键调节因子。

存活的MDA-MB-231细胞的FACS、膜联蛋白V–FITC和碘化丙啶[PI]谱(A类); 膜完整性与早期凋亡(B类); 或AdCanHSA感染合并或不合并γ射线照射后晚期凋亡伴死亡(C类). (D类)为了评估HIF-1α表达的抑制，对用随机siRNA（siRNA加扰[siScr]）或siRNA HIF-1α（siHIF）转染的未感染或AdCanHSA感染的MDA-MB-231细胞进行蛋白质印迹。(E类和F类)AdCanHSA感染后，对转染的MDA-MB-231细胞进行Annexin V–FITC染色，无论是否与γ射线联合照射。棒材代表SEM。每个实验进行两次*P（P）< 0.05. (G公司)HIF-1在肿瘤对canstatin和/或辐射反应中的作用示意图。canstatin通过整合素介导的线粒体凋亡机制和辐射暴露通过凋亡途径直接触发内皮细胞死亡。由此产生的微血管功能障碍诱导HIF-1α表达，作为调节肿瘤适应性反应的强制性信号。HIF-1α反过来上调肿瘤细胞表面整合素受体的表达，特异性增强由canstatin触发的HIF-1β信号转导肿瘤凋亡途径。此外，HIF-1通过内皮细胞和肿瘤细胞的异常有丝分裂，将亚致死辐射损伤（如有丝分裂停滞和四倍体状态）转化为致命损伤。总之，诱导肿瘤细胞深度死亡需要canstatin诱导的肿瘤凋亡途径和通过HIF-1信号分子机制的辐射介导的有丝分裂突变。

总之，我们的结果表明_v（v）β₅整合素和HIF-1在刺激CanHSA诱导的线粒体肿瘤凋亡途径中起着关键作用。

在体外，HIF-1和辐射控制G₂/M检查点、四倍体和亚倍体。

接下来我们研究HIF-1是否参与肿瘤和内皮细胞照射后细胞凋亡和基因组不稳定性的控制。有丝分裂中的细胞周期阻滞（G₂/M检查点）用于修复电离辐射造成的DNA损伤。有丝分裂检查点的缺陷产生四倍体和/或非整倍体状态，这些状态有助于肿瘤的发生和获得对某些治疗药物的耐药性，特别是在缺乏功能性p53的情况下(32,33). 如果G₂/M检查点被取消，细胞可以在DNA损伤修复之前提前进入有丝分裂。异常有丝分裂使细胞因有丝分裂突变而死亡(34).

在这里，照射p53全MDA-MB-231肿瘤细胞诱导了剂量依赖性的有丝分裂检查点缺陷，促进了四倍体而没有低倍体迹象（subG₁)（图​（图5，5、A和B）。HIF-1的表达取消了有丝分裂检查点和四倍体，并导致DFO处理的MDA-MB-231肿瘤细胞在不同剂量照射后进入有丝分裂（图​（图5，5、A和B）。

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图5

HIF-1介导辐射后有丝分裂检查点、非整倍体和单倍体的控制。

暴露于递增剂量γ辐射的细胞的细胞周期分布（每剂量2、16和32 Gy，两次，间隔3小时）。G中发现的群体细胞百分比₁、S、G₂/MDA-MB-231细胞的M期和四倍体(A类和B类)、RCC细胞（VHL突变或WT）(C类和D类)和HUVEC(E类和F类). 棒材显示SEM。每个实验进行两次。所有实验均使用VEGF和bFGF进行，证实HIF-1以生长因子无关的方式控制该检查点。

与不表达HIF-1的RCC细胞（VHL WT）相比，在辐照的p53突变RCC（VHL突变）细胞中，稳定HIF-1表达可抑制细胞周期阻滞缺陷，从而防止细胞四倍体（图​（图5，5、C和D）。

照射后的p53野生型HUVEC在G组发生细胞周期阻滞₂/米。细胞凋亡（subG₁)也迅速启动。如上所述，当HIF-1表达被诱导时，细胞能够恢复有丝分裂并消除四倍体细胞（图​（图5，5、E和F）。此外，G的废除₂/HIF-1的M阻滞增加了低倍性，从而提供了从有丝分裂到凋亡的转变(35)（图​（图5，5、E和F）。总之，我们的研究结果表明，HIF-1在迫使内皮细胞和肿瘤细胞进入异常有丝分裂从而导致死亡方面发挥着至关重要的作用(34).

细胞培养

HUVEC和乳腺MDA-MB-231细胞之前已经描述过(29). 已知RCC4细胞存在VHL突变（VHL突变），破坏HIF-1的蛋白水解调节，以及稳定转染WT-pVHL（VHL-WT）的RCC细胞在添加10%FBS的DMEM中生长(45).

对于低氧处理，细胞在1、10、50或100μmol/l DFO（Sigma-Aldrich）的存在下生长。

肿瘤模型和体内碘实验

体内CanHSA的定量

如前所述，用ELISA定量异种移植小鼠血清中的CanHSA蛋白(29).

组织学和免疫组织化学

蛋白质印迹分析

在体内，为了进行HIF-1α蛋白表达分析，在第20天解剖MDA-MB-231异种移植瘤¹³¹I注射，如上所述。细胞质和核蛋白提取物与单克隆小鼠抗HIF-1α（BD Biosciences-Pharmingen）孵育，并与过氧化物酶结合的山羊抗鼠抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.）显示。

在体外，在感染腺病毒后的指定时间点采集HUVEC、MDA-MB-231和RCC（RCC4）细胞。使用抗人HIF-1α、抗人裂解caspase-3（如上所述）或抗ERK抗体（Upstate）分析HIF-1 a、裂解caspase 3和ERK的表达。

如前所述，使用Staurosporine诱导细胞凋亡(29).

流式细胞术

MDA-MB-231细胞中HIF-1α和整合素基因沉默

如前所述，siRNAβ3和β5以及siRNA HIF-1分别从Ambion和Eurogentec购买(29,49).

这项工作得到了国家癌症研究中心、古斯塔夫·罗西研究所、法国电力原子能委员会、法国国家癌症研究所和癌症研究协会的支持。我们衷心感谢动物实验服务社（SCEA），尤其是Annie Rouches、Colette Chianale和Monique Stanciu对动物的照顾。我们热烈感谢西尔维安·贝耶特和弗雷德里克·拉维埃尔的帮助。