英国临床药理学杂志。2003年7月；56(1): 78–83.
亚洲人群C3435T单核苷酸MDR1基因多态性频率：表型-基因型相关性
,1 ,2 ,三和4
C巴勒姆
1新加坡国家癌症中心临床试验和流行病学科学部临床药理学实验室
A夏尔马
2美国康涅狄格州格罗顿市辉瑞公司格罗顿实验室，邮编：06340
1新加坡国家癌症中心临床试验和流行病学科学部临床药理学实验室
2美国康涅狄格州格罗顿市辉瑞公司格罗顿实验室，邮编：06340
三新加坡国家心脏中心心胸外科
4新加坡国立大学医学院药理学系
通信：Edmund J.D.Lee，新加坡国立大学医学院药理学系，地址：16，Medical Drive，Singapore 117597。传真：+65 873 7690；电子邮件：gs.ude.sun@eelechp公司 收到日期：2002年3月15日；2002年12月22日接受。
摘要
目的
目的研究亚洲人MDR1基因第26外显子单核苷酸多态性C3435T的频率，并通过10例稳定心脏移植患者口服环孢素（Neoral）的临床药代动力学来确定该SNP的功能意义。
方法
这个MDR1型对290名健康亚洲人（98名中国人、99名马来人和93名印度人）的C3435T多态性进行了研究。我们还比较了MDR1型这里研究的亚洲人口与公布的非洲人和高加索人数据之间的多态性。在10名稳定的中国心脏移植患者中评估了该SNP对已知P-gp底物环孢菌素口服生物利用度的临床相关性。
结果
在32%、28%和43%的中国人、马来人和印度人中观察到纯合TT基因型。在25%的中国人和马来人中发现了纯合子CC基因型，而在印度只有18%。印度人的C等位基因频率[0.38（0.31-0.45）]低于中国人[0.46（0.39-0.53）]和马来人[0.48（0.42-0.55）]。χ2检验表明，马来人和印度人的等位基因频率分布存在显著差异(P（P）= 0.04). 在这一亚洲人群中，基因型（CC、CT和TT）的总体分布和等位基因频率与非洲人显著不同(P（P）< 0.001). 当中国人、马来人和印度人分别与非洲人群进行比较时，结果也很显著(P（P）< 0.001). 与白种人的数据相比，亚洲人群中基因型和等位基因频率的总体分布也存在显著差异(P（P）≤ 0.05). 然而，当将每个亚洲民族与高加索人单独进行比较时，发现只有印度人有显著差异(P（P）≤ 0.004). 在10名稳定的中国心脏移植患者中评估了该SNP的基因型-表型相关性。CC基因型患者的平均AUC（0,4 h）比TT基因型患者低11%。然而，患者AUC（0,4 h）的患者间变异性较高，尤其是CC基因型患者。
结论
中国人和马来人第26外显子中SNP C3435T的分布与白种人相似，而印度人不同。亚洲人群与非洲和高加索人群在C3435T单核苷酸多态性分布上也存在显著差异。印度人群中T等位基因的低频率意味着P-gp的低表达，并可能对印度血统个体使用P-gp依赖性药物具有重要的治疗和预后意义。
关键词：亚洲人群，环孢菌素A，CYP3A4，种族，Mdr1基因，P-糖蛋白，药代动力学
介绍
P-糖蛋白（P-gp）是一种170-kD的血浆糖蛋白，属于ATP-结合盒（ABC）转运体超家族[1]. 它由两个同源的半体组成，每个半体包含六个跨膜结构域和一个ATP/利用结构域，由连接体多肽分隔。P-gp由Juliano&Ling发现[2]在多药耐药性（MDR）癌细胞中，几项报道观察到哺乳动物癌细胞对单一细胞毒性药物的耐药性，对广泛的结构和功能无关的化合物表现出交叉耐药性。当P-gp在肿瘤细胞中表达时，通过引起广泛的癌症化疗药物的活性挤压，包括文卡生物碱、蒽环类、秋水仙碱、骨骺毒素、放线菌素和紫杉烷[三].
除了在肿瘤细胞中高度表达外，P-gp也在健康组织中组成性表达，并且在肝脏上皮细胞（胆管）的顶面上高浓度表达[4]、肾脏（近端小管）、胰腺（胰腺导管细胞）、小肠和结肠（柱状粘膜细胞）和肾上腺[5,6]. 它也表达于大脑和睾丸的毛细血管内皮，表明它可能起到限制某些分子进入特定解剖腔室的作用[7]. P-gp的组织分布导致合理预期，P-gp通过将细胞毒性物质排泄到胆汁、胃肠道和尿液中以及参与血脑屏障功能，在抵御外源毒素方面发挥作用。
P-gp浓度的表达沿肠纵向增加，胃中浓度最低，结肠中浓度最高[8]. P-gp浓度也显示出显著的个体间差异，在肾移植患者和健康人的小肠活检中发现2-8倍的差异[9]. P-gp表达的高度患者间变异性可导致作为P-gp底物的口服药物的吸收率和吸收程度发生重大变化。肠道P-gp的完全丧失mdr1a型–/–敲除小鼠支持肠道P-gp在作为P-gp底物的药物口服生物利用度中的重要作用。例如，紫杉醇的口服生物利用度比mdr1a型–/–小鼠与mdr1a型+/+老鼠[10].
人类有两种MDR基因，MDR1型和MDR2型（也称为MDR3级). 这个MDR1型该基因位于7号染色体长臂上，由一个核心启动子区和28个外显子组成。多药耐药1型编码P-gp，而MDR2型编码对细胞中磷脂酰胆碱移位特异的P-gp[11].
MDR1型该基因已鉴定出15个突变，主要涉及内含子和摆动位置的非编码单核苷酸多态性（SNP）。最近，外显子26（C3435T）中描述了导致C→T转换的功能性SNP，其中纯合T等位基因被证明与十二指肠P-gp表达水平相比降低了两倍以上[12]. 纯合子CC基因型的基因型频率在非洲人群中最高，在东南亚人群中最低。杂合个体表现为中间表型。尽管在高加索人群中观察到了C3435T过渡的种族变异和人口频率，但我们评估了三个民族的C3435T SNP：华人、马来人和印度人。我们还通过口服环孢素（CsA）作为Neoral微乳制剂（CsA-ME）给10名稳定的中国心脏移植患者的临床药代动力学来确定C3435T SNP的功能意义。
方法
受试者和MDR1多态性的鉴定
所有受试者在进行研究前均给予书面同意，研究方案得到伦理委员会的批准。在EDTA真空管中收集血样（5毫升）用于DNA提取MDR1型中国三个不同民族的基因分型(n个=98），马来人(n个=99）和印度人(n个= 93). 用苯酚-氯仿萃取法从外周血白细胞中提取纯化的基因组DNA。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测C3435T单核苷酸多态性。正向引物MDR1F（5′-TGCTGTCGAAGTTGATCTGGAAC-3′）和反向引物MDR1R（5′-ACATTAGGCAGACT CGATGAAG GCA-3′）的序列来自已知的外显子26序列（Genbank:J05168和AC 005068）。PCR检测在20µl反应体积中进行，反应体积包含100 ng基因组DNA，0.25µmol l−1每个引物的10×PCR缓冲液中含有10 mmol−1Tris和50 mmol l−1KCl，1.5毫摩尔−1氯化镁2，200µmol l−1每个DNTPs和1 U Taq DNA聚合酶。PCR条件包括94°C下变性1分钟，55°C下退火1分钟，72°C下伸长2分钟，然后在72°C最终伸长5分钟。扩增反应产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化（美国加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）用于PCR扩增产物的直接纯化。然后用限制性内切酶消化姆博I在37°C下持续2小时。然后在2%琼脂糖凝胶上分离消化产物。
心脏移植受试者的新药代动力学
对10例中国心脏移植患者进行了新药代动力学评价。所有患者均出具书面知情同意书。患者临床表现稳定，至少6个月前接受过心脏移植。从移植开始，平均随访时间（±SD）为5.2±4.4年，患者平均年龄为47.9±9.8岁，平均体重为63.5±16.1 kg。平均血清肌酐值为127.7±38.6µmol l−1平均肌酐清除率为58.1±13.5 ml min−1并假设在研究期间保持稳定。所有其他生化参数均在正常范围内。
在研究当天，所有患者空腹服用推荐剂量的CsA-ME和一杯水（200 ml）。在以下时间采集用于AUC分析的全血样本（3 ml）：给药前(C类0)和1、2、3、4、6、12小时(C类1小时,C类2小时，C类三,C类4小时,C类6小时,C类12小时（分别为）第一次给药间隔期间的给药后。将血液样本收集在含有EDTA作为抗凝剂的普通真空玻璃管中。样品采用商用环孢素全血单克隆抗体荧光偏振分析法（FPIA；TDx；美国伊利诺伊州芝加哥雅培实验室）进行分析。日内和日内变异性小于4%，检测限为25µg l−1.
使用非线性回归程序（WinNonLin，2.1版；Pharsight Inc，Montain View，CA，USA）通过非部门分析确定药代动力学参数。使用线性梯形规则计算从0到4小时的浓度-时间曲线下的面积[AUC（0.4小时）]。
统计分析
根据从每个种族的基因型数据中获得的两个不同等位基因C和T的观察数量计算等位基因频率。使用Hardy–Weinberg方程和chi-squared goodness of fit分析对观察到的和预期的等位基因和基因型频率进行种族间比较。使用R×C列联表分析比较等位基因和基因型分布的种族间差异，并使用齐方检验比较两个不同种族的差异。我们还将这项研究的结果与非洲人公布的结果进行了比较[13]和白种人（德国人）[12]采用χ2检验；计算所有观察到的等位基因频率的95%置信区间。采用Jonckheere–Terpstra检验分析了中国心脏移植受试者基因型与剂量归一化AUC（0,4 h）之间的相关性，这是一种考虑变量水平之间定量关系（缺陷等位基因数量）的非参数统计程序。P（P）<0.05为统计学显著性的最低水平。使用SAS程序版本6（SAS Institute，Cary，MA，USA）进行统计分析。
结果
印度受试者纯合子TT变异体的频率为43%，而携带纯合子CC变异体者的频率为18%。几乎50%的中国人和马来人是C/T变异体的杂合携带者，而印度人为39%(). 中国人、马来人和印度人的C和T基因型分布无统计学差异。马来族和印度族之间的等位基因频率略有差异(P（P）= 0.04,). 在所有亚洲血统的三个种族中观察到的基因型频率符合哈迪-温伯格平衡(P（P）> 0.5)
中国、马来和印度少数民族C3435T MDR1多态性的基因型频率。
表1
观察到的基因型和等位基因频率的种族间差异MDR1型种族多态性
| | 人口 | P（P）价值 |
|---|
| | 中文(n个=98）（A） | 马来人(n个=99）（B） | 印第安人(n个=93）（C） | A类与B类 | A类与C类 | B类与C类 |
|---|
| 基因型 | 信用证 | 0.24 | 0.25 | 0.18 | 0.874 | 0.243 | 0.096 |
| 转交 | 0.44 | 0.46 | 0.39 | | | |
| 电汇 | 0.32 | 0.28 | 0.43 | | | |
| Allele（95%置信区间） | 铯 | 0.46 (0.39, 0.53) | 0.48 (0.42, 0.55) | 0.38 (0.31, 0.45) | 0.758 | 0.102 | 0.041 |
| T型 | 0.54 (0.47, 0.61) | 0.52 (0.45, 0.59) | 0.62 (0.55, 0.69) | | | |
我们还比较了合并的亚洲受试者中C和T基因型分布和等位基因频率的差异(n个=290）与非洲受试者（加纳人、肯尼亚人和苏丹人）的公布数据；n个= 337) [13]和高加索人[德语；n个= 188][12]. 亚洲人纯合子TT基因型的基因型频率为28%至43%，而非洲人群为0-6%[13]白种人占24%[12] (). 亚洲受试者野生型C等位基因的等位基因频率为0.38至0.48，而非洲受试者为0.73至0.83，高加索人为0.52。突变T等位基因的等位基因频率在亚洲受试者中为0.52至0.62，而在非洲受试者为0.17至0.27[13]白种人为0.48[13]. 每个亚洲民族都与非洲人有很大不同(P（P）每种情况下<0.001，,). 与白种人相比，只有印度人在基因型分布方面存在统计学差异(P（P）= 0.004,)和等位基因频率(P（P）= 0.002,).
亚洲、非洲和加西亚人群中C3435T MDR1多态性的基因型频率。
表2
亚洲、非洲和高加索人群C和T基因型及等位基因频率的差异(P（P）值）
| | 中国人 | 马来语P（P）价值 | 印度的 | 综合亚洲人 |
|---|
| 基因型 | 非洲的 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| 高加索人 | 0.371 | 0.699 | 0.004 | 0.053 |
| 阿勒 | 非洲的 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| 高加索人 | 0.228 | 0.458 | 0.002 | 0.022 |
的相关性MDR1型10名中国心脏移植患者的第26外显子基因型和CsA-AUC（0,4h）剂量标准化全身暴露描述如下尽管数据显示TT纯合子患者的全身暴露水平高于CC基因型纯合子的患者，但由于剂量标准化CsA AUC（0,4 h）的患者间变异性，差异在统计学上并不显著与CT或TT基因型患者相比，纯合子CC基因型患者的CV相对较大（51%与16%与30%).
稳定的中国心脏移植患者外显子26 SNP与剂量标准化的新AUC（0,4 h）的相关性(n个= 10).
讨论
The characterization ofMDR1型基因与药物遗传学检测在鉴别不同基因型中的应用多药耐药1型患者中的等位基因可能为优化作为P-gp底物的药物治疗提供了有用的工具。识别不同等位基因变体及其与P-gp表达水平的关系也可能有助于确定治疗结果。到目前为止，位于外显子26中摆动位置的SNP C3435T与肠道P-gp表达水平相关，并显示影响作为P-gp底物的口服药物的吸收。收集到的关于C3435T多态性在不同种族人群中分布的信息对于解释药物反应和/或副作用的个体间和种族间差异可能至关重要。
本研究表明，等位基因变异在中国和印度人群中的频率分布相似，在马来人和印度人之间的频率分布不同。与印度人和中国人相比，印度人和马来人的基因型频率和C、T等位基因分布的差异更大(). 近30%的中国人和马来人是变异T等位基因纯合子携带者，而印度人为40%。本研究中获得的中国人的结果与之前发表的结果一致[13]. 亚洲人纯合子C等位基因的频率分布与日本人相似[14].
将亚洲和非洲的混合数据进行比较，发现SNP C3435T在亚洲人群中的分布与非洲人群有显著差异[13]. 当亚洲人口中的三个民族（中国人、马来人和印度人）与非洲人口中的这三个民族组合（加纳人、肯尼亚人和苏丹人）进行比较时，基因型和C和T等位基因的频率分布在统计学上存在差异[13] (P（P）每种情况下<0.001，). 中国人和马来人被发现与高加索人（德国）相似[12,15]与非洲和高加索人口都不同的印度受试者进行比较。
为了评估第26外显子SNP的临床后果，我们将csa AUC（0,4 h）与MDR1型中国10例稳定的心脏移植患者第26外显子基因型。CsA是一种著名的P-gp底物，其药代动力学曲线显示出极大的患者间和患者内变异性。虽然环孢素A的Neoral制剂比环孢素a的玉米油制剂（Sandimune）具有更好的药代动力学特性，但其生物利用度仍然存在很大差异，尤其是在最初的4小时内。在他们对肾移植患者的研究中，Johnston等. [16]结果表明，CsA血浓度的患者间和患者内变异性最大发生在给药后的前4小时，而这种变异性在给药4至12小时内最小。库尼也报告了类似的发现等。[17]在一项针对心脏移植患者的单独研究中。
AUC（0.4小时）与MDR1型与TT基因型受试者相比，第26外显子CC基因型的中国患者血浆AUC（0,4 h）值较低，基因型显示出纯合子的趋势。纯合子CC受试者的低AUC（0.4小时）和高程度的患者间变异性可能是由于肠道P-gp表达增加，从而影响Neoral的吸收。霍夫迈耶等。[12]结果表明，与TT受试者相比，CC基因型受试者的稳态最大地高辛血浆浓度较低，这是因为CC受试者十二指肠P-gp的表达较高。心脏移植患者的基因型状态与其CsA AUC（0,4小时）之间存在关联，尽管我们受到CT患者数量的限制(n个=2）或TT(n个=2）基因型。到目前为止，我们在新加坡总共只有10名中国心脏移植患者。
虽然我们在本研究中没有确定与CYP3A4基因相关的遗传多态性，但CYP3A4-mediated drug disposition中的遗传变异性也可能是Neoral AUC（0,4 h）患者间高度变异的原因。CYP3A4和多药耐药1型似乎受到独立监管[18]并取决于底物的剂量和暴露时间。因此，在CC基因型患者中，P-gp和CYP3A4可能会相互配合，以尽量减少对Neoral的接触。最近，已经鉴定出CYP3A的两个等位基因变体，一个位于CYP3A公司(CYP3A4*1b年) [19]另一个导致Ser222Pro改变(CYP3A4*2年) [20]. 发生频率的种族差异CYP3A4*1b年比CYP3A4*2年; 后者在2.7%的白人受试者中发现，但在黑人和中国人中没有发现[20]. 然而，这两种等位基因形式被认为对白人和非裔美国人CsA处置的个体间差异没有显著影响[21].
SNP C3435T位于MDR1型基因，因此不太可能调节MDR1型。该SNP可能与尚未确定的MDR1型调节表达的基因。Synold公司等。[22]最近的研究表明，孤儿核受体SXR（类固醇和外源性受体）在调节CYP3A4年和MDR1型表达式。他们表明，紫杉醇而非多西紫杉醇能够激活SXR，并导致CYP3A4年,CYP2C8公司和多药耐药1型在肠和肝细胞中，这反过来导致LS180结肠癌细胞的紫杉醇流出增加。因此，研究SXR活性和MDR1型不同民族受试者的基因型状况。然而，似乎C3435T单核苷酸多态性在定义与MDR1型表达和活动。
总之，本研究表明，C3435T SNP的等位基因频率在马来人和印度人之间存在差异。亚洲人在C3435T SNP的分布上也与非洲人群有显著差异。与白种人相比，只有印第安人不同。了解不同种族之间ABC转运蛋白的遗传变异性和功能多态性是相关的药理学因素，可用于了解药物反应的变异性。
鸣谢
作者感谢高飞在统计方面的帮助。这项工作得到了新加坡综合医院研究基金SRF 43-00、国家心脏协会和新加坡癌症协会的部分资助。
工具书类
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